Alle Verfahren in diesem Artikel beschrieben, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften des Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Deutschland durchgeführt. Pre-chirurgische Eingriffe 1. Herstellung von Monofilen <ol><li> Zur Herstellung der intraluminalen Filamenten wurden 8-0 Nylonmonofilament Nähte verwendet und wurden auf eine Länge von je 13 mm geschnitten. </li><li> Für die Beschichtung der Monofile wurde Xantopren M Schleimhaut (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland), indem Sie einen Tropfen Aktivator-Lösung (Activator, Universal plus, Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) verwendet aktiviert. </li><li> Das Monofilament wurde langsam durch das Silikon gezogen, bis es vollständig damit bedeckt. Auf diese Weise würde das Monofilament gleichmäßig mit Silikon abgedeckt werden. Vermeiden Sie zu lange warten, weil die aktiviert Beschichtungsmaterial wird fest und trocken schnell. </li><li> Bevor das Silikon zu erstarren beginntEmpfiehlt es abzustreifen übermäßige Silikon von der Wendel durch Ziehen über ein Blatt Papier. Auf diese Weise kann die Silikonschicht aus einer ungefähren Dicke von 200 um verdünnt werden. </li><li> Die Basis des Silikon-covered Monofilament wurde in Knetmasse stecken in Ordnung, lassen Sie es über Nacht trocknen. </li></ol> Anmerkung: Im Idealfall nur sterilisiert oder desinfiziert mindestens Monofilamente verwendet, um die Sterilität an der Operationsstelle zu gewährleisten. In der Praxis ist die Sterilisation oder Desinfektion der Hand-made monofilaments sehr schwierig, weil die Qualität der Monofile 9 verschlechtern kann. Daher kann es bevorzugt sein, im Handel erhältlich sterile Monofilamente zu verwenden. 2. Herstellung von chirurgischen Instrumenten und der Tiere <ol><li> Alle chirurgischen Instrumente wurden in 70% igem Ethanol erhalten. Zusätzlich vor jeder neuen Operation wurden alle chirurgischen Instrumenten sorgfältig eine gereinigtend desinfiziert mit 70% igem Alkohol. </li><li> Der OP-Bereich wurde gründlich desinfiziert unter Verwendung von 70% igem Alkohol bei allen Tieren vor Durchtrennung. Die desinfiziert Websites durften vollständig, bevor Sie die Schnitte trocknen. Zusätzliche Clipping des Fells wurde nicht durchgeführt, da dies microabrasions und nachfolgende Entzündungen der Haut verursachen können 9. </li></ol> Chirurgische Verfahren 3. Die Positionierung der Probe und LDF LDF Überwachung <ol><li> Für die Induktion der Anästhesie wurden die Mäuse mit einem Gasgemisch, bestehend aus 30% Sauerstoff, 70% N 2 O und 2,5% Isofluran mit einem Verdampfer ausgesetzt. Für die Wartung der Anästhesie wurde Isofluran-Konzentration auf 1,5% reduziert. Die Mäuse wurden spontan atmenden über Atemmaske während des chirurgischen Eingriffs. </li><li> Eine rektale Temperatursonde wurde eingesetzt und Mäusen wurden dem stereotaktischen Rahmen Aussetzen des parietalen Kopf fixiert. Während der Operation wurden die Mäuse auf ein ruhtThermostat gesteuerte Heizkissen, wodurch eine konstante Kerntemperatur von 37,0 ± 0,5 ° C. Eine sagittale Mittellinienschnitt (~ 1 cm Länge) wurde durchgeführt, um die parietal Schädel freizulegen. </li><li> Die linke Seite des Schädels wurde sorgfältig seziert und eine faseroptische Sonde wurde direkt auf den Schädel 2 mm und 5 mm kaudal lateral von Bregma mit Sekundenkleber fixiert. Danach wurden Wundränder sorgfältig auf Gehirn Hypothermie sowie Infektionen zu vermeiden. </li><li> Die Maus wurde um die ventrale Seite des Halses gedreht freizulegen. Die faseroptische Sonde wurde der LDF Gerät (Periflux System 5000, Perimed, Järfälla, Schweden) über Verbindungsleitungen Sonde Adapter (; Järfälla, Schweden Master-Probe 418-1, Perimed) verbunden. </li></ol> Kommentar: Drehen Sie die Maus um, die faseroptische Sonde sollte mit Vorsicht gebogen werden, um zu vermeiden, dass es bricht aus dem Schädel. <ol start="5"><li> Die LDF Gerät wurde an einen Laptop angeschlossen comComputer. Kontinuierliche Aufzeichnung von LDF-Werte wurde eingeleitet mit PeriSoft für Windows (Version 2.50, Järfälla, Schweden). Abbildung 1 zeigt den mittleren Verlauf von zehn CBF LDF Aufnahmen während BCCAO und Reperfusion erhalten. </li></ol> 4. Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion <ol><li> Die Narkose wurde aufrechterhalten, wie in 3.1 beschrieben. Maus wurde auf den Rücken gelegt. Den Schwanz des Tieres und Pfoten wurden dem Heizkissen mit Klebeband fixiert. Eine sagittale ventralen Mittellinienschnitt (~ 1cm Länge) durchgeführt wurde. </li><li> Beide mundwässernden Drüsen wurden sorgfältig getrennt und mobilisiert werden, um die zugrunde liegende CCA visualisieren. </li><li> Sowohl CCA wurden sorgfältig von den jeweiligen Vagus Nerven und Begleitvenen ohne Schädigung dieser Strukturen getrennt. Manipulationen des Vagus-Nerven vielleicht vorübergehende oder dauerhafte Funktionsstörung des parasympathischen Nervensystems, die das Potenzial für das Auftreten von signifikanten kardialen arr hat dazu geführt,hythmia oder sogar irreversible Herzstillstand. Daher ist es wichtig, keine Manipulationen der Vagus-Nerven zu vermeiden. Eine lockere 5-0 Seidenfaden Schleife wurde um jeden CCA gemacht. </li><li> Ein kleiner Silikonschlauch (Durchmesser 2 mm) wurde zwischen dem CCA und die Seidenfäden auf jeder Seite eingefügt. Dieser Schlauch wurde als Schienung des CCA verwendet werden, um Beschädigung der Gefäßwand zu vermeiden, wenn die Nähte wurden angezogen (Fig. 4). </li><li> Sowohl CCA wurden für eine Minute durch Anziehen der Seidenfäden verschlossen. Nur Mäuse, in denen die LDF Signal auf &lt;10% des Ausgangswertes Signal reduziert wurde, wurden in die Studie eingeschlossen. Nach Wiedereröffnung der beiden CCA wurde ein 5 Minuten Reperfusionsperiode eingeleitet. Durch LDF eine komplette Reperfusion wurde sichergestellt. Tiere mit unvollständiger Reperfusion (dh &lt;90% für die Verwertung von CBF im Vergleich zum Ausgangswert CBF) wurden ausgeschlossen. Die Sequenz von einer Minute und fünf Minuten BCCAO Reperfusion wurde zweimal für insgesamt BCCAO durati wiederholtauf der 3 min. Abbildung 1 zeigt den mittleren Verlauf von zehn CBF LDF Aufnahmen während BCCAO und Reperfusion erhalten. Während des Verfahrens, ist es empfehlenswert, um den Hals gewickelt nass mit physiologischer Kochsalzlösung. </li><li> Nach der letzten Reperfusion wurden alle Rohre und Nahtmaterial sowie die faseroptische Sonde, die an dem Schädel entfernt, die Wunden vernäht und Lidocain Salbe (Xylocain 2%; AstraZeneca GmbH, Wedel, Deutschland) wurde wiederholt, um die Wunden angewendet wie für erforderlich analgetische Management. </li><li> Die Mäuse wurden in eine vorgewärmte übertragen (30 ° C) Rückgewinnungskasten (MediHEAT. PecoServives Ltd Brough, Cumbria, UK), bis sie komplett das Bewusstsein wiedererlangt hatte. Danach wurden die Mäuse auf ihre Tierkäfige zurückgegeben. </li></ol> 5. Middle Cerebral Artery Occlusion <ol><li> Die Mäuse wurden wieder anästhesiert wurde ein rektalen Temperaturfühler eingefügt und die Mäuse wurden auf einem Heizkissen angeordnet, um die ventrale Seite des Halses freizulegen. Danach w sieere, werden wie im BCCAO Abschnitt beschrieben. </li><li> Eine permanente Ligatur mit einem langen 7-0 Seidenfaden wurde um den linken proximalen CCA gemacht und der Faden wurde sanft kaudal mit einem Moskito-Klemme (Abbildung 4) gezogen. </li><li> Eine weitere dauerhafte Ligatur um die linke äußere Halsschlagader (ECA) und der Faden auf der rechten Seite des Tieres gezogen (Fig. 4). </li><li> Bindegewebe rund um den linken ICA wurde vorsichtig mobilisiert und die Hypoglossus wurde leicht angehoben, um einen guten Überblick über den Verlauf des distalen ICA erhalten. Die linken ICA biegt nach links, während die pterygopalatina Arterie (PPA) folgt dem Verlauf des proximalen ICA nach rechts (Abbildung 4). </li></ol> Kommentar: Es ist eine andere Arterie identifiziert, die sich auf der rechten Seite in Richtung Schwanzflosse werden. Dies ist die A. occipitalis, die variabel stammt entweder aus dem CCA Bifurkation oder von der proximal Teil der ECA (Abbildung 4). <ol start="5"><li> Eine lose Fadenschleife wurde um den proximalen ICA unter Verwendung eines 5-0 Seidenfaden. </li><li> Mit einem kleinen microvascular Klemme wurde die ICA vorübergehend distal der 5-0 lose Fadenschleife (Abbildung 4) verschlossen. </li><li> Ein kleiner Einschnitt in dem distalen Teil des CCA CCA kurz vor der Verzweigung mit mikrovaskulären Schere (Abbildung 4). </li><li> Eine vorgewählte Silikon bedeckten Monofilament wurde in der CCA über den kleinen Schnitt eingeführt und dann in den ICA, bis es an der mikrovaskulären Klemme (Abbildung 4) gestoppt. </li><li> Die microCLAMP wurde vorsichtig von der ICA entfernt, während das Monofilament wurde tiefer in den ICA vorgeschoben, bis sie (Fig. 4) gestoppt. Kommentar: An dieser Stelle, drehen die Zange in der linken Hand, so dass Sie nicht halten es wie ein Stift. Dies hilft, den Faden mit der Pinzette leichter greifen.Die Gefäßklemme-Applikator sollte in der rechten Hand gehalten werden. Es könnte notwendig sein, ziehen Sie die losen fast 5-0 Naht um die ICA, um Blutungen aus dem Einschnitt Seite zu verhindern. </li><li> Die genaue Lage des Monofils Spitze identifiziert wurde, um zu überprüfen, ob es in der ICA und nicht in den PPA vorgeschoben wurde. Wenn das Monofilament Spitze in der proximalen PPA eingeführt wurde, wurde das Filament leicht wieder kurz vor dem ICA / PPA Bifurkation gezogen. Es wurde versucht, das Monofilament in die ICA wieder vorrücken, während leichtes Ziehen der proximalen ICA ein bisschen auf der rechten Seite. Damit war der natürliche Verlauf des distalen ICA simulierten macht es einfacher, die ICA zugreifen. </li><li> Nachdem das Monofilament in die ICA vorgeschoben wurde fast vollständig, wurde das lose 5-0 Fadenschleife um den proximalen ICA angezogen werden, um den Faden zu fixieren. Danach wurden alle Seidenfäden verkürzt und die Haut Wunde wurde genäht. </li><li> Der Flüssigkeitsverlust während der Operation wurde ReplenIshed durch die Injektion von 1,0 ml Kochsalzlösung ip Danach wurde die Maus auf den vorgewärmten Erholung Box übertragen, bis sie vollständig das Bewusstsein wiedererlangte. </li><li> Für Reperfusion wurden die Mäuse erneut narkotisiert und das Monofilament wurde nach vorsichtiges Lösen der 5-0 Seidenfaden um den proximalen ICA entfernt. Danach wurde die 5-0 Naht wieder vorsichtig angezogen werden, um Blutungen zu verhindern. </li><li> Nach Bestätigung der vollständigen Hämostase wurde die Wunde am Hals genäht. </li><li> Lidocain Salbe wurde wiederholt lokal auf die Haut aufgetragen, wie zur Schmerzlinderung erforderlich, und die Maus wurde auf die vorgewärmten (30 ° C) übertragen Rückgewinnungskasten bis es komplett das Bewusstsein wiedererlangte. </li><li> Als ein erster Hinweis für eine erfolgreiche MCAO Verfahren, im Uhrzeigersinn kreisen des Tieres beobachtet wurde. Die Schwere der funktionellen Defizit wurde mit Hilfe der Bederson Punktzahl für Mäuse 10 modifiziert. Nach diesem modifizierten Bederson Punktzahl, neurologischen Scores wir0 (normal Motorik), 1 (Beugung des Rumpfes und kontralateralen Vorderbein, wenn die Maus am Schwanz aufgehoben wurde), 2 (kreisen um der Gegenseite, wenn die Maus am Schwanz wurde auf eine flache Oberfläche gehalten, aber normal: wie folgt gestaffelt neu Haltung at rest), 3 (lehnt an der Gegenseite in Ruhe) und 4 (keine spontane motorische Aktivität oder tot). </li></ol> 6. BCCAO Sham Surgery Für BCCAO Schein Verfahren wurden die Mäuse narkotisiert für die Dauer von einem echten PC BCCAO Verfahren wurden die Drüsen Speichelfluss mobilisiert und die CCA ausgesetzt waren. Es ist entscheidend, dass die direkte Manipulationen an den Halsschlagadern oder Vagus Nerven während Schein-Verfahren vermieden werden. Manipulationen des CCA beschädigen können seine Endothelschicht, das kann zu einer Freisetzung von vasoaktiven Verbindungen aus Endothel oder induzieren lokale Thrombose im arteriellen Lumen führen. Als Konsequenz daraus könnten thromboembolischer Ereignisse nach Schein-Operation auftreten. Dies wäre ein wichtiger Confounder von th werdene Verfahren. Auf der anderen Seite könnte Manipulationen der vagale Nerven vorübergehende oder dauerhafte Funktionsstörung des parasympathischen Nervensystems, welche das Potential für das Auftreten von signifikanten Herzrhythmusstörungen oder sogar irreversible Herzstillstand führt. Daher ist es wichtig, keine Manipulationen der vagale Nerven während BCCAO vermeiden. Post-chirurgischen Eingriffen 7. Infarktvolumen Messungen Für die Beurteilung der Infarktgrößen überlebten Mäuse für 72 Stunden nach MCAO. Danach waren tief narkotisierten Tiere, Gehirne entnommen, schockgefroren in methylbutan, geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin (mit Papanicolau dem Protokoll) für Infarktvolumen Messungen. Gehirn Schnitte wurden bei 600 um-Intervallen und Infarkt Bände gesammelt wurden unter Verwendung eines Bildanalysator (MCID Kern 7.0 Rev.2.0, GE Healthcare Niagara Inc) und korrigiert bei Ödemen nach der Methode von Lin et al. 7,11 </sup&gt;. 8. Einschlusskriterien Wir enthalten nur Tiere, die eine LDF-gemessenen CBF Reduzierung um mehr als 90% in jedem der drei BCCAO Folgen hatte. Idealerweise sollte LDF Überwachung in beiden Hemisphären während BCCAO durchgeführt werden. Für Praktikabilität, führten wir LDF Überwachung nur in der linken Hemisphäre, die unterworfen später MCAO werden. Dieser Ansatz hat sich vor 6,12 beschrieben worden. Reperfusion nach jedem BCCAO Folge war erforderlich, um vollständig sein (dh Rückkehr zu den Ausgangswerten). Aus Gründen der Verkürzung der Dauer Mäusen unter Narkose gehalten wurden, haben wir nicht überwachen CBF während MCAO Chirurgie. In einer Pilotstudie mit einer separaten Gruppe von Tieren, aber wir überwacht CBF durch LDF während MCAO Chirurgie. In dieser Gruppe von Mäusen, setzen wir konsequent gemessen eine Reduktion von 90% CBF im Vergleich zum Ausgangswert vor CCA Okklusion. Zusätzlich nach der Entfernung von Monofilamenten CBF zurückgewonnen, um&gt; 90% des jeweiligenBaseline-Werte nach CCA Okklusion. Diese LDF Kriterien sind in der Literatur und Ergebnis in Einklang Infarkt Bände 7 etabliert. Wir haben nur Tiere, die enthalten ein Bederson Punktzahl von mindestens 1 nach Erwachen aus der Narkose nach MCAO hatte. Darüber hinaus zeigten die Tiere nur für 72 Stunden nach MCAO und welche überlebt keine Anzeichen von intrakraniellen Blutungen in der Studie enthalten waren.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

In unserer Studie haben wir gezeigt, dass drei Sequenzen BCCAO, jede dauert eine Minute, gefolgt von Reperfusion für fünf Minuten, eine angemessene ischämischen PC Stimulus zu früh IT induzieren. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Vorbehandlung Protokoll verwendet eine sichere und kleinere invasives Verfahren ohne nennenswerte postoperative Morbidität, keine Anzeichen von Apoptose in Gehirn und ohne Mortalität ist. Mehrere verschiedene Vorkonditionierung Protokolle wurden zuvo...

Der ischämische Schlaganfall ist eine Erkrankung mit einer hohen Mortalität und eine enorme sozioökonomische Belastung 1. Trotz intensiver experimenteller und klinischer wissenschaftlichen Bemühungen in den letzten Jahrzehnten bleiben Behandlungsmöglichkeiten für akuten ischämischen Schlaganfall-Patienten sehr begrenzte 2. Im Gegensatz dazu, wird Zunahme des Anteils älterer Menschen in den entwickelten Ländern drastisch erhöhen Inzidenz und Prävalenz von Patienten mit ischämischem Schlaganfall in den nächsten Jahrzehnten 3. Daher besteht ein dringender Bedarf für neue Behandlungsstrategien bei Patienten mit ischämischem Schlaganfall. Ein Ansatz ist es, weitere Verständnis in Mechanismen der endogenen Anpassung des Gehirns mit einer schädlichen Reiz bewältigen zu gewinnen. Das Gehirn stammenden Neuroprotektion ist auch als ischämischen Präkonditionierung (PC) oder Ischämietoleranz (IT) bekannt und bezeichnet das Phänomen, bei dem ein nicht-schädlichen Reiz schädliche Einwirkung auf das Gehirn, induziert einen Übergangswiderstandgegen einen nachfolgenden schädlichen ischämischen Insult 4. Es tritt in zwei verschiedenen Zeitfenstern: früh IT, die innerhalb von Minuten bis wenigen Stunden nach PC erfolgt verzögert und IT, was braucht eine Latenzzeit von ein paar Stunden bis 4 auftreten. Bisher hat sich die Forschung auf die IT in Gehirn verzögert IT konzentriert. Viel weniger ist über die Mechanismen der frühen IT bekannt. Das Ziel dieser Studie ist es, die bilateralen Arteria carotis communis Okklusion (BCCAO), die ein etabliertes Stimulus verzögert IT induzieren, wie eine angemessene PC Stimulus zu induzieren etablieren frühen IT vorübergehender fokaler zerebraler Ischämie (induziert durch Mitte Zerebralarterie, MCAO) in C57Bl6 / J Mäusen. Während der beiden chirurgischen Eingriffen (BCCAO und MCAO), wurde die Überwachung des zerebralen Blutflusses (CBF) durch Laser-Doppler-Flussmessung (LDF) durchgeführt. BCCAO wurde betäubt und spontan atmenden Mäusen durchgeführt. Beide Arteria carotis communis (CCA) ausgesetzt wurdenund verschlossen für 60 Sekunden, gefolgt von 5 min der Reperfusion. Diese BCCAO / Reperfusion Sequenz wurde zweimal wiederholt. Nach der Operation erholte sich schnell und Mäusen zeigte keine Anzeichen von Funktionsstörungen. Um auszuschließen, dass die oben beschriebenen BCCAO Protokoll nicht in verzögerten Zelltod im Gehirn führen, führten wir eine TdT-vermittelte dUTP-Biotin-nick end labeling (TUNEL)-Färbung 72 h nach BCCAO (oder Schein-Operation) in ein separate Gruppe. MCAO ist ein weithin etablierten Modell für die Induktion von fokaler zerebraler Ischämie bei Nagetieren 5-7. Die chirurgischen Eingriffe wurden mit standardisierten Arbeitsanweisungen (SOP) 8 durchgeführt. Nach Aussetzen links CCA wurde ein Silizium-covered Monofilament in den distalen CCA über die Arteria carotis interna (ICA) in den Kreis der Willis vorgeschoben, bis die vordere Hirnarterie (ACA) und damit der Ursprung der mittleren zerebralen Arterie eingeführt ( MCA) für einen definierten Zeitraum verschlossen. In dieser Studie haben wirverwendet 45 min von MCAO, die typischerweise zu einem ischämischen Läsion in der MCA Hoheitsgebiets der striatalen und kortikalen Hirnregionen. In unserer Studie untersuchten wir den zeitlichen Verlauf der frühen IT mit BCCAO als PC Reiz. Unsere Daten zeigen, dass die optimale Zeitverzögerung zwischen BCCAO und MCAO früh IT ist 30 min zu induzieren. In diesem Video geben wir eine Demonstration der beiden chirurgischen Verfahren, dh BCCAO und MCAO.

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<tbody>
<tr>
	<td>Name of the instrument</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number/model</td>
</tr>
<tr>
	<td>Binocular surgical microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Stemi 2000 C</td>
</tr>
<tr>
	<td>Light source for microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>SteREO CL 1500 ECO</td>
</tr>
<tr>
	<td>Heating pad with rectal probe</td>
 <td>FST</td>
 <td>21061-10</td>
</tr>
<tr>
	<td>Stereotactic frame</td>
 <td>David Kopf</td>
 <td>Model 930</td>
</tr>
<tr>
	<td>Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>91460-11</td>
</tr>
<tr>
	<td>Dumont forceps #5</td>
 <td>FST</td>
 <td>11251-10</td>
</tr>
<tr>
	<td>Dumont forceps #7</td>
 <td>FST</td>
 <td>11271-30</td>
</tr>
<tr>
	<td>Mircovascular clamp</td>
 <td>FST</td>
 <td>00398-02</td>
</tr>
<tr>
	<td>Clamp applicator</td>
 <td>FST</td>
 <td>00072-14</td>
</tr>
<tr>
	<td>Springscissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>15372-62</td>
</tr>
<tr>
	<td>Needle holder</td>
 <td>FST</td>
 <td>12010-14</td>
</tr>
<tr>
	<td>Needles	</td>
 <td>Feuerstein, Suprama	</td>
 <td>BER 562-20</td>
</tr>
<tr>
	<td>5-0 silk suture</td>
 <td>Feuerstein, Suprama	</td>
 <td></td>
</tr>
<tr>
	<td>7-0 silk suture</td>
 <td>Feuerstein,Suprama	</td>
 <td></td>
</tr>
<tr>
	<td>8-0 silk suture</td>
 <td>Feuerstein, Suprama	</td>
 <td></td>
</tr>
</tbody>
</table>

bilateral common carotid artery occlusion as an adequate preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to focal cerebral ischemia

Es häufen sich Beweise, dass ischämischen Präkonditionierung - verleiht einen vorübergehenden Schutz auf eine spätere schädliche ischämischen Insult - ein nicht-schädigenden ischämischen Herausforderung an das Gehirn. Wir haben die bilateralen Arteria carotis communis Okklusion als Vorbehandlung Stimulus gegründet, um frühen ischämischen Toleranz gegenüber transienten fokalen zerebralen Ischämie in C57Bl6 / J Mäusen zu induzieren. In diesem Video zeigen wir Ihnen, die Methodik für diese Studie verwendet.

Unsere BCCAO Protokoll führte zu sofortigen und tiefen (&gt; 90%) CBF Kürzungen, wenn beide CCA wurden verschlossen (Abbildung 1). Wiedereröffnung des CCA ist Reperfusion führte zu vervollständigen, wie durch LDF (Abbildung 1) überwacht. Nach PC zeigte Tieren keine Anzeichen einer funktionellen Behinderung. Darüber hinaus gab es keine Mortalität. TUNEL-Färbung durchgeführt 72 Stunden nach BCCAO in einer separaten Gruppe von Tieren zeigte keine Anzeichen von verzögerten Zellto...

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Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

Es wird vermehrt Hinweise darauf, dass ischämischen Präkonditionierung (PC) - verleiht einen transienten Schutz einer nachfolgenden Beschädigung ischämischen - eine schonende ischämischen Herausforderung an das Gehirn. Wir haben festgestellt, bilateralen Arteria carotis communis Okklusion (BCCAO) als Vorbehandlung Stimulus bis Anfang ischämischen Toleranz (IT), um transiente fokale zerebrale Ischämie (induziert durch Mitte Zerebralarterie, MCAO) induzieren in C57Bl6 / J Mäusen.

Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion als adäquate Vorbehandlung Stimulus zu frühe ischämische Toleranz zu Focal zerebraler Ischämie induzieren

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

bilateral-common-carotid-artery-occlusion-as-an-adequate

Research

JoVE Journal

Medicine

28.8K Aufrufe.  Charité - Universitätsmedizin Berlin, Germany. Es wird vermehrt Hinweise darauf, dass ischämischen Präkonditionierung (PC) - verleiht einen transienten Schutz einer nachfolgenden Beschädigung ischämischen - eine schonende ischämischen Herausforderung an das Gehirn. Wir haben festgestellt, bilateralen Arteria carotis communis Okklusion (BCCAO) als Vorbehandlung Stimulus bis Anfang ischämischen Toleranz (IT), um transiente fokale zerebrale Ischämie (induziert durch Mitte Zerebralarterie, MCAO) induzieren in C57Bl...

Serie: Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Mouse Model of Middle Zerebralarterie

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Forschung

Medizin

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Mit Hilfe eines Cranial Fenster, um den Nahen Cerebral Artery Während Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Visualisieren

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Erwachsene Maus venöse Bluthochdruckmodell: A. carotis communis, um äußere Jugularvene Anastomose.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Embolischen mittleren Hirnarterie Okklusion (MCAO) für ischämischen Schlaganfall mit homologen Blutgerinnsel in Ratten

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, obesity and diabetes. Accordingly, when evaluating therapies for stroke in animals, it is important to select a model with excellent face validity. Ischemic stroke accounts for 80% of all strokes, and the majority of these occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA), often inducing infarcts that affect the sensorimotor cortex, causing persistent plegia or paresis on the contralateral side of the body. We demonstrate in this video a method for producing ischemic stroke in elderly rats, which causes sustained sensorimotor disability and substantial cortical infarcts. Specifically, we induce permanent distal middle cerebral artery occlusion (MCAO) in elderly female rats by using diathermy forceps to occlude a short segment of this artery. The carotid artery on the ipsilateral side to the lesion was then permanently occluded and the contralateral carotid artery was transiently occluded for 60 min. We measure the infarct size using structural T2-weighted magnetic resonance imaging (MRI) at 24 hr and 8 weeks after stroke. In this study, the mean infarct volume was 4.5% &#177; 2.0% (standard deviation) of the ipsilateral hemisphere at 24 hr (corrected for brain swelling using Gerriet&#8217;s equation, n = 5). This model is feasible and clinically relevant as it permits the induction of sustained sensorimotor deficits, which is important for the elucidation of pathophysiological mechanisms and novel treatments.

Here we present a protocol to produce permanent distal middle cerebral artery occlusion in elderly female rats with simultaneous occlusion of the carotid arteries to generate large cortical infarcts and sustained deficits. We show confirmation of the lesion size using structural MRI at 24 hr and 8 weeks after stroke.

Darstellende Permanent Distal cerebri mit Arteria carotis communis Occlusion bei alten Ratten zu studieren kortikale Ischämie mit anhaltenden Behinderungs

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

In Vivo Gentransfer in die Kaninchen gemeinsame Halsschlagader Endothel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Ein Kaninchen-Modell der dauerhafte Transgene Ausdruck in Halsschlagader, gemeinsame Halsschlagader Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...