Wir bedanken uns bei AdVec, Inc. für die Erlaubnis zur Nutzung ADHD Reagenzien, Julia Feyk für die Amtshilfe und die Abteilung für vergleichende Medizin Veterinärdienste für chirurgische Beratung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch HL114541 und die John L. Locke, Jr. Charitable Trust unterstützt.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bestimmte Aspekte der Operationstechnik verdienen besondere Aufmerksamkeit. Volle Belichtung und Mobilisierung der gemeinsame Halsschlagader über sorgfältige Dissektion wird gen-Transfer und arteriotomie Reparatur zu erleichtern. Allerdings sollten während der Dissektion, direkte Manipulation der Halsschlagader minimiert werden, um Vasospasmus zu verhindern. Darüber hinaus eine Blutung angrenzend an die Arterie angehalten werden sollte, durch leichte Druckmassage mit Gaze und extravasierten Blut bereinigt werden soll...

Das Ziel dieser Methode ist, ein Transgen in das Endothel der gemeinsamen Halsschlagadern Kaninchen einzuführen. Einführung des Transgens ermöglicht die Beurteilung der biologischen Rolle der Transgen-Produkt sowohl in normalen Arterien Kaninchen Modelle der menschlichen arteriellen Verschlusskrankheit. Überexpression des Transgens in Krankheitsmodellen kann zeigen, ob das Transgen (und seine Proteinprodukt), Versprechen als Therapeutika1,2,3,4 zeigen. Einbeziehung der GUS wirkenden regulatorische Elemente in der Transgen-Expressionskassette erlaubt eine Beurteilung der Aktivität dieser Elemente im arteriellen Endothel in Vivo5,6. Kenntnisse über die Aktivität der spezifischen GUS wirkenden regulatorische Elemente kann mehr aktive Expressionskassetten gestalten und Mechanismen der Genregulation in große Arterie Endothel in Vivo7Sonde verwendet werden.
Kaninchen sind ein wertvolles Modell für die verschiedenen Aspekte der menschlichen vaskuläre Physiologie und Krankheit. Kaninchen haben viele vaskuläre Merkmale mit den Menschen. Beispielsweise ähneln hämatologischen Ausgangswerte, blutstillende Regulierung und vaskuläre Längsspannung zwischen Kaninchen und Menschen8. Kaninchen-Modelle von Gefäßerkrankungen Replizieren der wichtigsten Features von vielen menschlichen Krankheiten einschließlich: Aneurysmen (ähnliche geometrische und Fließeigenschaften)9, Vasospasmus (ähnliche Reaktion auf die endovaskuläre Behandlung)10,11, und Atherosklerose (Intima Plaketten mit ähnlichen Eigenschaften, einschließlich einen Kern reich an Lipid, Makrophagen und glatten Muskelzellen in einer fibrösen Kappe)12,13. Entsprechend, Kaninchen-Modelle wurden für viele Gefäßerkrankungen wie Thrombose, vasospasmen, Aneurysma, Diabetes, Gefäßprothese Stenose und Arteriosklerose8,13,14, 15,16.
Für die Forscher unter Tiermodellen für vaskuläre Physiologie und Krankheit zu wählen hat die Kaninchen mehrere Vorteile. Im Vergleich zu Nagern, ermöglichen größere Schiffe von Kaninchen einfachere chirurgische Manipulation, Verwendung von endovaskuläre Prothesen und eine größere Menge des Gewebes für quantitative Messungen. Kaninchen sind phylogenetisch Primaten als Nagetiere17sind viel näher, und die größere genetische Vielfalt der fremd-Kaninchen besser approximiert die genetische Variabilität des Menschen. Genetischer Vielfalt ist besonders wichtig für präklinische Studien, die-durch ihre Natur-Ziel, Therapien zu entwickeln, die genetisch vielfältigen menschlichen Bevölkerung angewendet werden können. Wie mit vielen, wenn nicht alle anderen Modell Arten Kaninchen Gene einfach geklont oder synthetisiert, weil mit hoher Abdeckung der Kaninchen-Genom sequenziert hat (7,48 X) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Im Vergleich zu anderen großen Tiermodellen (wie Hunde, Schweine oder Schafe), Kaninchen sind relativ kostengünstig zu erwerben und Haus und sie sind einfacher zu züchten und zu handhaben. Spezifische Gefäßerkrankungen Modelle bei jedem Kaninchen haben ihre eigenen vor- und Nachteile als Modelle für menschliche Krankheiten, die über den Rahmen dieses Manuskript8,12,18sind. Ein Ermittler sollten überprüfen, diese vor- und Nachteile zu ermitteln, ob das Kaninchen das beste Modell für eine spezifische experimentelle Frage zu beantworten ist.
Einführung der Desoxyribonukleinsäure (DNA) regulatorischen Sequenzen in Endothelzellen in Vivo ermöglicht die Untersuchung der Aktivität dieser Sequenzen in einem komplexen physiologischen Umfeld. In-vitro- Studien in transfizierten Endothelzellen können nützlich für die Erstbewertung von regulatorischen DNA-Sequenzen sein; jedoch sind Ausdruck Niveaus in Gewebekultur Modelle manchmal nicht wiedergegeben, wenn die Studien wiederholt in Vivo5,19,20sind. In-vitro- Systeme können auch für die Erkundung von grundlegenden Wege der Protein-Signalisierung und endotheliale Physiologie sowie Kommunikation zwischen kultivierten vaskuläre Zellen nützlich sein; jedoch sind komplexere Wege oder regulatorische Netzwerke, die durch komplexe Populationen von vaskulären Nachbarzellen oder das Immunsystem beeinflusst werden am besten in einem in Vivo System6,20studiert. Die hier beschriebene Methode bietet eine Plattform für die Regulierung des Transgens Ausdruck in dem Endothel im Rahmen eines intakten Schiffes, mit oder ohne Krankheit zu erforschen. Das in-Vivo -System erlaubt auch Untersuchung der physiologischen und pathologischen zellulären Übersprechen und Identifikation von Beiträgen des Immunsystems zur Regulierung der Gen-Expression-6.
Keimbahn Transgenese (vor allem bei Mäusen) ist ein alternativer Ansatz für die Leitung der Transgene Ausdruck Endothelzellen. Dieser Ansatz bieten lebenslange Transgene Ausdruck mit endothelialen targeting vermittelt durch spezifische Promoter oder regulatorischen Regionen21,22. Aber die Generation von transgenen Mäusen ist zeitaufwändig und teuer, mehrere transgene Linien müssen oft getestet werden, um sicherzustellen, Ausrichtung des Transgens auf die gewünschte Zelle Art und Leistung angemessene Transgene Ausdruck Niveaus, und experimentelle Ergebnisse in murinen Systeme können Belastung abhängig sein. Murine transgene Modelle mit endothelialen gezielt transgene haben viele Vorteile: Es gibt keine Notwendigkeit, auf jedes Versuchstier operieren, um Transgenese zu erreichen, experimentellen Mäuse gezüchtet werden können, mit zahlreichen anderen verfügbaren Transgene Mäuse in um genetische und phänotypische Interaktionen zu testen, und gibt es eine große Auswahl an Antikörpern, die mit murinen Proteinen, Erleichterung der Charakterisierung von Phänotypen zu reagieren. Ausrichtung der Transgene des Endothels über die Keimbahn in der Regel führt jedoch Transgene Ausdruck in das Gefäßsystem,22 macht es schwierig, die Website zu bestimmen, an der das Transgen-Produkt handelt. Dies gilt insbesondere wenn das Transgen Produkt abgesondert wird, weil ein Transgen Produkt sezerniert Endothelzellen in das Gefäßsystem biologischen Aktivität an vielen verschiedenen Standorten innerhalb eines Tieres haben könnte. Obwohl in diesem Manuskript beschriebene Methode Fachwissen und spezialisierte Einrichtungen erfordert, kann es weniger zeitaufwendig und weniger teuer als die Entwicklung einer endothelialen-spezifische transgene mauslinie. Es ermöglicht die Beurteilung der Funktion eines Proteins selektiv in Endothelzellen eines Segments große Arterie, und es erlaubt die Verwendung von der kontralateralen gemeinsame Halsschlagader als gekoppelte Steuerung (Beseitigung systemische Faktoren, die unter experimentellen variieren kann Tiere-zum Beispiel Blutdruck oder Cholesterinspiegel-als unkontrollierte Variablen).
Gentherapie ist ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von Gefäßerkrankungen, insbesondere chronische Erkrankungen, weil eine einzelne Anwendung nachhaltig oder möglicherweise lebenslange Ausdruck einer therapeutischen Gens23bieten kann. Das therapeutische Versprechen der Gentherapie ist in Tiermodellen der somatischen Gentransfer, oft gezielt die Leber24,25, ein relativ leichtes Ziel ist, weil viele Blut übertragbare virale Vektoren Hepatotropic untersucht worden. Jedoch muss um auf Gefäßerkrankungen auswirken, Gentherapie, die gezielt auf die Leber systemische Überexpression von Proteinen erreichen. Dies erfordert in der Regel große Dosen des Vektors, die giftige oder tödliche26sein kann. Darüber hinaus höhere systemische Protein erhöhen das Risiko von Nebenwirkungen, Ziel, die erschweren oder sogar verschleiern Interpretation der experimentellen Ergebnisse könnten. Lokale Gentherapie gezielt Gefäßendothels, wie in diesem Manuskript beschrieben könnte systemischen Nebenwirkungen vermeiden, denn der infundierte Vektor nicht weit über die transduced arteriellen Segment verbreitet ist und lokale vaskuläre Effekte, ohne erzielt werden Änderungen im systemischen Plasmaspiegel von Protein. 27 darüber hinaus ein weit geringer Betrag des Vektors muss eine arterielle Segment transduzieren als erforderlich, um robuste hepatische Transduktion zu erreichen. Transgene Ausdruck aus der Leber wurde berichtet, zu sinken im Laufe der Zeit wahrscheinlich aufgrund der Zellerneuerung, die wiederholter Gabe, wenn hochrangige Transgene Ausdruck soll beibehalten werden. 28 im Gegensatz dazu bietet die niedrige Fluktuationsrate des Endothels stabile Expression für mindestens 48 Wochen in Chow gefütterten Kaninchen und mindestens 24 Wochen bei atherosklerotischen Läsionen des Cholesterin-gefütterten Kaninchen. 1 , 27
Um festzustellen, ob diese Methode des Gentransfers auf gemeinsame Halsschlagader Endothel Kaninchen geeignet ist, sollten die vor- und Nachteile (Tabelle 1) im Zusammenhang mit den spezifischen Forschungsziele betrachtet werden. Vorteile dieser Methode sind unter anderem: fremd-Kaninchen sind bessere Vertreter der menschlichen genetischen Vielfalt als Inzucht Mäuse (wichtig für präklinische Arbeit); Kaninchen, größere Schiffe für einfachere Handhabung und mehr Gewebe für die Analyse bereitzustellen; die Methode kann Endothel gezielt Transgen Ausdruck erreichen sehr viel schneller als Keimbahn endotheliale targeting bei transgenen Mäusen tut; Vektor-Dosis kann leicht zu einer Variable Transgene Ausdruck Modell eingestellt werden; speziell für große Arterie Endothel Prozesse untersucht werden können; und lokale vaskuläre Transgenese ermöglicht dem gegenüberliegenden Carotis im gleichen Tier als ein Steuerelement, systemische Faktoren als unkontrollierte Variablen verwendet werden. Nachteile sind: spezielle Einrichtungen und Fachkenntnisse sind erforderlich; weniger gentechnisch veränderte Hintergründe auf dem Experimentieren gibt es bei Kaninchen als bei Mäusen; und es gibt eine weniger umfangreiche Auswahl von Antikörpern gegen Kaninchen gegen Maus-Proteine (für Immunodetection des Transgens Protein und andere Antigene, die möglicherweise wichtig bei der Interpretation der Versuchsergebnisse).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Disposables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL syringe with 24G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>309571</td><td>2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery</td></tr><tr><td>1mL syringe with 27G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td>6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery</td></tr><tr><td>20mL syringe, luer lock</td><td>Nipro Medical Corp</td><td>JD+20L</td><td></td></tr><tr><td>Catheters, 24G x 3/4&quot;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>19G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305187</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>21G needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305165</td><td>For 20 mL syringe of saline</td></tr><tr><td>Gauze 4&quot; x 4&quot;</td><td>Dynarex</td><td>3242</td><td>~10-15 per surgery</td></tr><tr><td>3-0 silk suture</td><td>Covidien Ltd.</td><td>S-244</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Covidien Ltd.</td><td>S-182</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>7-0 polypropylene suture</td><td>CP Medical</td><td>8648P</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>5-0 polyglycolic acid suture</td><td>CP Medical</td><td>421A</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>3-0 polyglycolic acid suture</td><td>CP Medical</td><td>398A</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Alcohol swabs</td><td>Covidien Ltd.</td><td>6818</td><td>For placement of I.V. line</td></tr><tr><td>Catheter plug</td><td>Vetoquinol</td><td>411498</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Ketamine HCl, 100 mg/mL</td><td>Vedco Inc.</td><td>05098916106</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine, 100 mg/mL</td><td>Akorn Inc.</td><td>4821</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine HCl, 2%</td><td>Pfizer</td><td>00409427702</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine HCl, 0.5%</td><td>Pfizer</td><td>00409161050</td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia D-Special</td><td>Intervet Inc.</td><td>NDC 00061047305</td><td>Harvest surgery only</td></tr><tr><td>Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL&amp;nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>12496075705</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Saline IV bag, 0.9% sodium chloride</td><td>Baxter</td><td>2B1309</td><td>2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one</td></tr><tr><td>Heparin&amp;nbsp; (5000 U/mL)</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-047-10</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Fentanyl patch, 25 mcg/hr&amp;nbsp;</td><td>Apotex Corp.</td><td>NDC 60505-7006-2</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Multiple vendors</td><td>Catalog number not available</td><td></td></tr><tr><td>Gene transfer vector</td><td></td><td></td><td>Dilute 350 &amp;micro;L per artery; 2 x 10&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum needle holder 7&quot; straight</td><td>Roboz</td><td>RS-7900</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Operating scissors 6.5&quot; straight blunt/blunt</td><td>Roboz</td><td>RS-6828</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder /w suture scissors</td><td>Miltex</td><td>8-14-IMC</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Castroviejo scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo needle holder, 5.75&quot; straight with lock</td><td>Roboz</td><td>RS-6412</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Stevens scissors 4.25&quot; curved blunt/blunt</td><td>Roboz</td><td>RS-5943</td><td></td></tr><tr><td>Alm retractor 4&quot; 4X4 5mm blunt prongs</td><td>Roboz</td><td>RS-6514</td><td>2x</td></tr><tr><td>Backhaus towel clamp 3.5&quot;</td><td>Roboz</td><td></td><td>4x</td></tr><tr><td>Micro clip setting forceps 4.75&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-6496</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Micro vascular clips, 11 mm</td><td>Roboz</td><td></td><td>2x for gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Surg-I-Loop</td><td>Scanlan International</td><td>1001-81M</td><td>5 cm length</td></tr><tr><td>Bonaccolto forceps, 4&amp;rdquo; (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width</td><td>Roboz</td><td>RS-5210</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5042</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps, 4&amp;rdquo; (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip</td><td>Roboz</td><td>RS-5280</td><td></td></tr><tr><td>Halstead mosquito forceps,&amp;nbsp; 5&quot; straight, 1.3mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7110</td><td>2x</td></tr><tr><td>Halstead mosquito forceps,&amp;nbsp; 5&quot; curved, 1.3mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7111</td><td></td></tr><tr><td>Jacobson mosquito forceps 5&quot; curved extra delicate, 0.9 mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7117</td><td></td></tr><tr><td>Kantrowitz forceps, 7.25&quot; 90 degree delicate, 1.7 mm tips</td><td>Roboz</td><td>RS-7305</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps 5&quot;, 1X2 teeth, 2 mm tip width</td><td>Roboz</td><td>RS-8162</td><td></td></tr><tr><td>Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width</td><td>Fine Science Tools</td><td>11092-12</td><td>2x</td></tr><tr><td>Adson forceps, 12 cm, serrated, straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary electrosurgery handpiece and electrode</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>HPAC-1; R-F11</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical Suite Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulating warm water blanket and pump</td><td>Multiple vendors</td><td>Catalog number not available</td><td></td></tr><tr><td>Forced air warming unit</td><td>3M</td><td>Bair Hugger Model 505</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>IV infusion pump</td><td>Heska</td><td>Vet IV 2.2</td><td>Gene transfer surgery only</td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer and scavenger</td><td>Multiple vendors</td><td>Catalog number not available</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary multi-parameter monitor</td><td>Surgivet</td><td>Surgivet Advisor</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary electrosurgery unit</td><td>MACAN Manufacturing</td><td>MV-9</td><td></td></tr><tr><td>Surgical microscope</td><td>D.F. Vasconcellos</td><td>M900</td><td>Needs ~16x magnification</td></tr></tbody></table>

in vivo gene transfer to the rabbit common carotid artery endothelium

Das Ziel dieser Methode ist, ein Transgen in das Endothel der isolierte Segmente der beiden Kaninchen gemeinsame Halsschlagadern einzuführen. Die Methode erreicht fokale endotheliale selektive Transgenese, wodurch ein Ermittler um die biologische Rollen von endothelialen ausgedrückt transgenen zu ermitteln und zu quantifizieren, die in-vivo transkriptionelle Aktivität der DNA-Sequenzen in große Arterie Endothelzellen. Die Methode verwendet chirurgische Isolation von Kaninchen gemeinsame Halsschlagadern und eine arteriotomie Transgen exprimierenden viralen Vektoren in das arterielle Lumen liefern. Eine kurze Inkubationszeit des Vektors in das Lumen mit nachfolgenden Aspiration des Inhalts Lumen ist ausreicht, um effizienter und langlebiger Expression des Transgens in das Endothel ohne nachweisbare Transduktion oder Ausdruck außerhalb der isolierte arterielle Segment. Die Methode erlaubt Einschätzung der biologischen Aktivitäten des Transgens Produkte sowohl in normalen Arterien Modelle menschlicher vaskulären Erkrankungen, unter Vermeidung von systemischen Wirkungen, die entweder durch gezielte gen Lieferung zu anderen Websites (zB. verursacht werden könnten der Leber) oder durch den alternativen Ansatz genetischen Konstrukte des Endothels durch Keim Linie Transgenese zu liefern. Anwendung der Methode wird durch die Notwendigkeit eines erfahrenen Chirurgen und Anästhesisten, einen gut ausgestatteten Operationssaal, die Kosten für Kauf und Gehäuse Kaninchen und den Bedarf an Fachwissen in Gentransfer Vektor Bau und die Nutzung begrenzt. Mit dieser Methode erzielten Ergebnisse gehören: Transgen-im Zusammenhang mit Veränderungen im arteriellen Struktur, zellularität, extrazelluläre Matrix oder vasomotorische Funktion; zu- oder Abschläge bei arteriellen Entzündungen; Veränderungen im Kreislauf zellapoptose; und Progression, Retardierung oder Regression von Krankheiten wie Intima-Hyperplasie oder Arteriosklerose. Die Methode erlaubt auch Maß für die Fähigkeit der native und synthetische DNA regulatorischen Sequenzen zum Ändern Transgene Ausdruck in Endothelzellen, die Ergebnisse, die zählen: Ebenen des Transgens mRNA Niveaus des Proteins Transgen und Ebenen des Transgens enzymatische Aktivität.

Zur Umsetzung dieser Methode vertrauensvoll sind Vorversuchen notwendig, um festzustellen, ob der Betreiber effiziente und reproduzierbare Gentransfer mit Transgene Ausdruck vor allem in der luminalen endothelial Zellen erreicht. Nach unserer Erfahrung ist dies am einfachsten anhand eines Vektors, das β-Galaktosidase ausdrückt. 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) Färbung der gemeinsame Halsschlagader Segmente entfernt 3 Tage nach Vektor Infusion sowie Messung der ...

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In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

Diese Methode ist ein Transgen in das Endothel der Kaninchen Halsschlagadern einzuführen. Einführung des Transgens ermöglicht die Beurteilung der biologischen Rolle der Transgen-Produkt entweder normale Arterien oder Krankheitsmodelle. Die Methode eignet sich auch zur Messung der Aktivität der regulatorischen DNA-Sequenzen.

In Vivo Gentransfer in die Kaninchen gemeinsame Halsschlagader Endothel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

9.1K Aufrufe.  University of Washington. Diese Methode ist ein Transgen in das Endothel der Kaninchen Halsschlagadern einzuführen. Einführung des Transgens ermöglicht die Beurteilung der biologischen Rolle der Transgen-Produkt entweder normale Arterien oder Krankheitsmodelle. Die Methode eignet sich auch zur Messung der Aktivität der regulatorischen DNA-Sequenzen.

Serie: In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Ein Modell des Disturbed Flow-Atherosklerose in Maus Halsschlagader durch partielle Ligation und eine einfache Methode zur RNA-Isolierung aus Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Forschung

Medizin

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine their efficacy and safety.
Gene therapy using viral vectors is one of the most promising approaches for treating cardiac diseases. Viral delivery of various different genes by changing the carrier gene has immeasurable therapeutic potential.
In this video, the full process of an animal model of heart failure creation followed by gene transfer is presented using a swine model. First, myocardial infarction is created by occluding the proximal left anterior descending coronary artery. Heart remodeling results in chronic heart failure. Unique to our model is a fairly large scar which truly reflects patients with severe heart failure who require aggressive therapy for positive outcomes. After myocardial infarct creation and development of scar tissue, an intracoronary injection of virus is demonstrated with simultaneous nitroglycerine infusion. Our injection method provides simple and efficient gene transfer with enhanced gene expression. This combination of a myocardial infarct swine model with intracoronary virus delivery has proven to be a consistent and reproducible methodology, which helps not only to test the effect of individual gene, but also compare the efficacy of many genes as therapeutic candidates.

A method of gene transfer for the treatment of ischemic heart failure is described using a swine model of myocardial infarction. Our simple and reproducible method enables us to readily evaluate the efficacy of various gene transfers with a very simple and reproducible way.

Gentransfer bei ischämischen Herzinsuffizienz in einem vorklinischen Modell

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically narrowed segments of coronary and peripheral arteries. Endovascular stents capable of tunable release of genes with anti-restenotic activity may present an alternative strategy to presently used drug-eluting stents. In order to attain clinical translation, gene-eluting stents must exhibit predictable kinetics of stent-immobilized gene vector release and site-specific transduction of vasculature, while avoiding an excessive inflammatory response typically associated with the polymer coatings used for physical entrapment of the vector. This paper describes a detailed methodology for coatless tethering of adenoviral gene vectors to stents based on a reversible binding of the adenoviral particles to polyallylamine bisphosphonate (PABT)-modified stainless steel surface via hydrolysable cross-linkers (HC). A family of bifunctional (amine- and thiol-reactive) HC with an average t1/2 of the in-chain ester hydrolysis ranging between 5 and 50 days were used to link the vector with the stent. The vector immobilization procedure is typically carried out within 9 hr&#160;and consists of several steps: 1) incubation of the metal samples in an aqueous solution of PABT (4 hr); 2) deprotection of thiol groups installed in PABT with tris(2-carboxyethyl) phosphine (20 min); 3) expansion of thiol reactive capacity of the metal surface by reacting the samples with polyethyleneimine derivatized with pyridyldithio (PDT) groups (2 hr); 4) conversion of PDT groups to thiols with dithiothreitol (10 min); 5) modification of adenoviruses with HC (1 hr); 6) purification of modified adenoviral particles by size-exclusion column chromatography (15 min) and 7) immobilization of thiol-reactive adenoviral particles on the thiolated steel surface (1 hr). This technique has wide potential applicability beyond stents, by facilitating surface engineering of bioprosthetic devices to enhance their biocompatibility through the substrate-mediated gene delivery to the cells interfacing the implanted foreign material.

These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.

Gefäß Gentransfer von metallischen Stent Oberflächen mit Adenovirus-Vektoren durch Tethered Hydrolysierbare Vernetzer

In-stent restenosis presents a major complication of stent-based revascularization procedures widely used to re-establish blood flow through critically ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and cellular mechanisms involved in vascular smooth muscle dedifferentiation, neointima formation and vascular remodeling. Male Sprague-Dawley rats are the most frequently employed animals for this model. Female rats are not preferred as female hormones are protective against vascular diseases and thus introduce a variation into this procedure. The left carotid is typically injured with the right carotid serving as a negative control. Left carotid injury is caused by the inflated balloon that denudes the endothelium and distends the vessel wall. Following injury, potential therapeutic strategies such as the use of pharmacological compounds and either gene or shRNA transfer can be evaluated. Typically for gene or shRNA transfer, the injured section of the vessel lumen is locally transduced for 30 min with viral particles encoding either a protein or shRNA for delivery and expression in the injured vessel wall. Neointimal thickening representing proliferative vascular smooth muscle cells usually peaks at 2 weeks after injury. Vessels are mostly harvested at this time point for cellular and molecular analysis of cell signaling pathways as well as gene and protein expression. Vessels can also be harvested at earlier time points to determine the onset of expression and/or activation of a specific protein or pathway, depending on the experimental aims intended. Vessels can be characterized and evaluated using histological staining, immunohistochemistry, protein/mRNA assays, and activity assays. The intact right carotid artery from the same animal is an ideal internal control. Injury-induced changes in molecular and cellular parameters can be evaluated by comparing the injured artery to the internal right control artery. Likewise, therapeutic modalities can be evaluated by comparing the injured and treated artery to the control injured only artery.

This protocol uses a balloon catheter to cause an intraluminal injury on the rat carotid artery and henceforth elicit neointimal hyperplasia. This is a well-established model for studying the mechanisms of vascular remodeling in response to injury. It is also widely used to determine the validity of potential therapeutic approaches.

Gefäßballon Verletzung und intraluminale Verwaltung in Rattenhalsschlagader

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

The Rabbit Model of Accelerated Atherosclerosis: A Methodological Perspective of the Iliac Artery Balloon Injury

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the industrialized world. New Zealand White (NZW) rabbits are widely used as an animal model for the study of atherosclerosis. They develop spontaneous lesions when fed with atherogenic diet; however, this requires long time of 4 - 8 months. To further enhance and accelerate atherogenesis, a combination of atherogenic diet and mechanical endothelial injury is often employed. The presented procedure for inducing atherosclerotic plaques in rabbits uses a balloon catheter to disrupt the endothelium in the left iliac artery of NZW rabbits fed with atherogenic diet. Such mechanical damage caused by the balloon catheter induces a chain of inflammatory reactions initiating neointimal lipid accumulation in a time dependent fashion. Atherosclerotic plaque following balloon injury show neointimal thickening with extensive lipid infiltration, high smooth muscle cell content and presence of macrophage derived foam cells. This technique is simple, reproducible and produces plaque of controlled length within the iliac artery. The whole procedure is completed within 20 - 30 min. The procedure is safe with low mortality and also offers high success in obtaining substantial intimal lesions. The procedure of balloon catheter induced arterial injury results in atherosclerosis within two weeks. This model can be used for investigating the disease pathology, diagnostic imaging and to evaluate new therapeutic strategies.

Animal models of atherosclerosis are essential to understand the mechanism and to investigate newer approaches to prevent plaque development or rupture, a leading cause of death in the industrialized world. This protocol uses a combination of balloon injury and cholesterol rich diet to induce atherosclerotic plaques in rabbit iliac artery.

Das Kaninchen-Modell der beschleunigten Atherosklerose: methodischer Sicht der Beckenkamm Arterie Ballon Verletzung

Acute coronary syndrome resulting from coronary occlusion following atherosclerotic plaque development and rupture is the leading cause of death in the ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Ein Kaninchen-Modell der dauerhafte Transgene Ausdruck in Halsschlagader, gemeinsame Halsschlagader Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Präklinische Modell von Hind Limb Ischemia in diabetischen Kaninchen

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor because of the acceleration of intimal hyperplasia due to the exposure to arterial blood pressure. The present protocol is designed for the establishment of experimental venous intimal hyperplasia by interposing rabbit jugular veins to the ipsilateral carotid arteries. The protocol does not require surgical procedures deep in the body trunk and the extent of the incision is limited, which is less invasive for the animals, allowing long-term observation after implantation. This simple procedure enables researchers to investigate strategies to attenuate the progression of intimal hyperplasia of the implanted vein grafts. Using this protocol, we reported the effects transduction of microRNA-145 (miR-145), which is known to control the phenotype of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the proliferative to the contractile state, into harvested vein grafts. We confirmed the attenuation of intimal hyperplasia of vein grafts by transducing miR-145 before implantation surgery through the phenotype change of the VSMCs. Here we report a less invasive experimental platform to investigate the strategies that can be used to attenuate intimal hyperplasia of vein grafts in revascularization surgeries.

The present protocol aims to experimentally create venous intimal hyperplasia by subjecting veins to arterial blood pressure for developing strategies to attenuate venous intimal hyperplasia following revascularization surgery using vein grafts.

A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arteriellen Blutdruck

Although vein grafts have been commonly used as autologous grafts in revascularization surgeries for ischemic diseases, the long-term patency remains poor ...

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal experimentation plays a pivotal role in assessing the efficacy and safety of vascular grafts, particularly in the absence of clinical applications. Compared to alternative animal models, the mouse implantation model offers several advantages, including a well-defined genetic background, a mature method for disease model construction, and a straightforward surgical procedure. Based on these advantages, the present study devised a simple cuff technique for the implantation of tissue-engineered vascular grafts in the mouse carotid artery. This technique began with the fabrication of polycaprolactone (PCL) small-diameter vascular grafts via electrostatic spinning, followed by the seeding of macrophages onto the grafts through perfusion adsorption. Subsequently,&#160;the cellularized tissue-engineered vascular grafts were transplanted into the mouse carotid artery using the cuff technique to evaluate patency and regenerative capability. After 30 days of in vivo implantation, vascular patency was found to be satisfactory, with evidence of neo-tissue regeneration and the formation of an endothelial layer within the lumen of the grafts. All data were analyzed using statistical and graphing software. This study successfully established a mouse carotid artery implantation model that can be used to explore the cellular sources of vascular regeneration and the mechanisms of action of active substances. Furthermore, it provides theoretical support for the development of novel small-diameter vascular grafts.

Here, a protocol is presented for the implantation of a tissue-engineered vascular graft into the mouse carotid artery using the cuff technique, providing a suitable animal model for investigating vascular tissue regeneration mechanisms.

Implantation eines Tissue-Engineering-Gefäßtransplantats in die Halsschlagader der Maus mittels Manschettentechnik

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal ...

Biotechnik

Carotid Artery and Jugular Vein Interposition: A Technique to Induce Venous Intimal Hyperplasia in Rabbit Model

Source: Nishio, H., et al. <a href="https://www.jove.com/v/60931">A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arterial Blood Pressure</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the interposition of the rabbit carotid artery with the jugular vein to induce venous intimal hyperplasia by subjecting the veins to arterial pressure. This model will help investigate molecular and genetic interventions to attenuate the progression of intimal hyperplasia after revascularization surgeries.

Interposition der Halsschlagader und der Halsvene: Eine Technik zur Induktion der venösen Intimahyperplasie im Kaninchenmodell

Source: Nishio, H., et al. A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under ...