Die Autoren bedanken sich bei Andre Han und Lawrence Yen für die technische Unterstützung, und die Mitglieder der Jenkins Labor für Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls danken.

Ein. Zellisolation von Lymphgewebe <ol><li> 1 ml eiskaltem cEHAA (EHAA + 10% FBS, Pen / Strep, Gentamycin, 2 mM L-Glutamin, 55 mM 2-Mercaptoethanol) oder andere gleichwertige T-Zell-Medium auf eine 60 mm Kulturschale, die ein kleines Quadrat aus 100 mu m Nylon-Mesh und auf Eis stellen. </li><li> Einschläfern Maus. </li><li> Entfernen Sie die Milz und so viele leicht zugängliche Lymphknoten wie möglich. Diese sollten mindestens die Leistengegend, Achsel, brachial, Gebärmutterhals-und mesenterialen Lymphknoten. Legen Sie sie auf der Oberseite des Nylon-Mesh in der Kulturschale. </li><li> Mit der flachen Oberseite eines geschlossenen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das Lymphgewebe sanft Maische über die Nylon-Mesh-Lymphozyten zu befreien. Hinzufügen 1 ml cEHAA angesetzt und nach oben und unten, um Zellen in einer Suspension zu arbeiten. Übertragen der Zellen durch ein anderes Stück Nylon Netzgewebe über der Oberseite einer 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben. Spülen Sie das Geschirr und Mesh mit einem anderen 1 ml eiskaltem cEHAA, poOling die Volumina in das gleiche Rohr. Wiederholen, um einen endgültigen Zellsuspension Volumen von 4 ml zu erreichen. </li><li> Hinzufügen kalten Sortierer (PBS + 2% FBS, 0,05% Azid) auf ein Endvolumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Fc-Block (Sorter Puffer + 2.4G2 Antikörper) auf ein Endvolumen gleich ungefähr das Doppelte des Pellets selber. Zum Beispiel können die Milz und Lymphknoten eines naiven Maus erzeugt gewöhnlich eine Zellpellet von etwa 100 ul. In diesem Fall fügen Sie 100 ul Fc-Block, um die Lautstärke zu 200 ul zu bringen. Wenn ein hohes Maß an Zelle Verklumpung aufgetreten ist, entfernen Sie vorsichtig die Zellklumpen an dieser Stelle mit einer Pipettenspitze. </li></ol> 2. Tetramerfärbung <ol><li> Hinzufügen PE-oder APC-markierten Tetramer pMHC zu einer Endkonzentration von 10 nM (oder empirisch optimiert Konzentration). </li><li> Mix und Gründerzentrente für 1 Stunde bei Raumtemperatur (oder empirisch optimiert Zeit und Temperatur). </li><li> Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C Die Proben auf Eis oder bei 4 ° C von nun an. </li><li> Sorgfältig Überstand absaugen und sicherstellen, keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet im Sortierer-Puffer auf ein Endvolumen von 200 ul. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, resuspendieren auf ein Endvolumen von 150 ul. </li></ol> 3. Magnetische Anreicherung <ol><li> Fügen Sie 50 ul Miltenyi anti-PE-oder Anti-APC Mikrokügelchen. Für Doppel-Tetramer Bereicherung, werden 50 ul von beidem. </li><li> Mischen und inkubieren für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Hinzufügen kalten Sortierer Puffer auf ein Volumen von 15 ml und zentrifugieren das Röhrchen 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Während der Wartezeit, die Einrichtung eines Miltenyi LS magnetischen Säule auf einem MidiMACS oder QuadroMACS Magnet. Positionieren Sie eine offene 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen auf einemRack direkt unterhalb der Säule. </li><li> 3 ml der Sortierer Puffer zu dem oberen Ende der Säule, so dass sie in den 15 ml-Röhrchen abzulassen. </li><li> Legen Sie eine 100 mu m Nylon-Mesh Quadrat auf der Säule. </li><li> Wenn die Zellen fertig sind Spinnen, sorgfältig absaugen Überstand und das Pellet in 3 ml Sortierer Puffer. </li><li> Übertragen der Zellsuspension durch die Nylonnetz auf den Kopf der Kolonne. </li><li> Wenn der Zellsuspension vollständig in der Säule abgelassen, spült das Originalbild mit einem anderen Rohr 3 ml Puffer Sortierer und übertragen die Puffer durch das Nylonnetz in die Kolonne, Spülen, die Maschen des Prozesses. Entsorgen Sie die Nylon Mesh. </li><li> Wenn der Puffer in die Säule vollständig entleert, einen weiteren 3 ml Sortierer Puffer auf die Säule. </li><li> Wiederholen Schritt 10 für insgesamt 3 x 3 ml Wäschen. </li><li> Entfernen Sie die Säule vom Magneten und sich über einen neuen 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. </li><li> 5 ml Sortierer Puffer ter Spalte. </li><li> Sofort übernehmen den Kolben in den Kopf der Kolonne und in einer kontinuierlichen Bewegung, drücken den Kolben ganz nach unten, wodurch der Puffer aus der Kolonne in die Röhre. </li><li> Die Röhrchen enthaltend das eluierte gebundenen Fraktion und die Durchströmung ungebundenen Fraktion für 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Sorgfältig Aspiration des Überstands von der gebundenen Fraktion, wodurch sicher, dass keine Flüssigkeitströpfchen auf den Seiten des Rohres verbleiben. Zellpellet in Sortierer Puffer auf ein Endvolumen von genau 95 ul. Ansaugen und resuspendieren ungebundene Fraktion auf ein Endvolumen von 2 ml. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Für jede Fraktion, entfernen 5 ul und in 200 ul Zählen Wülste (eingestellt auf eine Konzentration von 200.000 / ml in Sortierer Puffer) in einem 5 ml FACS-Röhrchen. Beiseite bei 4 ° C für eine spätere Analyse. Um Zeit zu sparen, können Perlen beschrifteten Röhrchen werden vor dem Beginn des Experiments vor-aliquotiert. </li><li> Bereiten Uhraster Mischung von Antikörpern zu färben Oberflächenmarker auf den Zellen (Tabelle 1). Um Zeit zu sparen, kann diese vor dem Beginn des Experiments durchgeführt werden. </li><li> Für die gebundene Fraktion, einen Dosis von Antikörper-Cocktail direkt mit dem ~ 90 ul Zellen in der Röhre. Wenn eine Analyse der ungebundenen Fraktion gewünscht wird, können 90 ul Zellen zu einem 5 ml FACS-Röhrchen und fügen Sie eine Dosis von Antikörper-Cocktail. </li><li> Einsetzung eines Panels von einfarbigen Entschädigung Kontrollen für das Durchflusszytometer. Für jedes Fluorochrom verwendet werden, mischen 50 ul übriggebliebene ungebundenen Fraktion Zellen in einem 5 ml FACS-Röhrchen mit 1 ul des anti-CD4-Antikörper, konjugiert mit dem entsprechenden Fluorochrom ist. Denken Sie daran, Einrichten eines ungefärbten Kontrolle. </li><li> Wirbel und inkubieren alle Proben für 30 min bei 4 ° C. </li><li> 5 ml Sortierer Puffer zu jedem Röhrchen und Zentrifuge 5 min bei 300 × g, 4 ° C </li><li> Für die gebundene Fraktion, sorgfältig absaugen Überstand und Zellen in 200 ul Sortierer buffer. Übertragen der Zellen in einem 1,2 ml Microtube FACS. Spülen Sie das Rohr mit einem anderen 200 ul Sorter-Puffer und Pool in der gleichen Mikroröhrchen. Wenn Zellklumpen offensichtlich sind, passieren die Zellen durch ein 50 um-Filter. </li><li> Für die ungebundene Fraktion und Entschädigung Kontrollen, dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren in 2 ml Sortierer Puffer. </li><li> Einrichten des Durchflusszytometer unter Verwendung der Single-Farbkompensation Kontrollen. Wählen Seitenstreuung-Breite (SSC-W) als ein zusätzlicher Parameter aufgezeichnet werden. </li><li> Analysieren der gefärbten Proben unter Verwendung einer Sequenz von aufeinanderfolgenden Aufnahme Gates an CD4 identifizieren + oder CD8 + T-Zellen wie in den 1 und 2 dargestellt. Bei gebundenen Fraktionen, sammeln Sie so viele Zellen wie möglich bis zu einem Maximum von 2.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Für ungebundenen Fraktionen sammeln 1.000.000 insgesamt Veranstaltungen. Halten Sie die Akquisition bei oder unterhalb von 3.000 Ereignisse pro Sekunde. </li><li> Mit den gleichen Geräteeinstellungen, analysieren die Zählung bead Proben. Sammle 10.000 insgesamt Veranstaltungen. &lt;/ Li&gt; <li> Speichern Sie alle Daten, wie FCS-Dateien. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Analysieren FCS Datendateien für die Zählung bead Proben mit FlowJo Software. Plot Vorwärtsstreuung von FITC und setzen ein Tor aroung die Zählergebnisse Perlen (siehe Abbildungen 1 und 2). Ermitteln der Gesamtanzahl der Zählung Wülste in jeder Probe detektiert. Subtrahieren von der Gesamtanzahl der erfassten Ereignisse, die Anzahl der gesammelten Ereignisse Zelle zu bestimmen. </li><li> Berechne die Anzahl aller Zellen in jeder Probe unter Verwendung der Gleichungen, die in Kasten 1 dargelegt. </li><li> Analysieren FCS-Dateien für den gefärbten gebundenen und ungebundenen Fraktion Proben. Einrichten einer Abfolge von aufeinanderfolgenden Aufnahme Tore zu lymphoiden +, Side-Scatter-Breiten-lo, dump-, CD3 +, CD4 + oder CD8 +, Tetramer +-T-Zellen in jeder Probe wie in den 1 und 2 dargestellt. Identifizieren </li><li> Multiplizieren die Gesamtzahl der Zellen in der Probe durch die Frequenzen jedes der Aufnahme-Gatter verwendet werden, um CD4 + definieren Tetramer+ Oder CD8 +-Tetramer +-Zellen, um die Gesamtzahl von Epitop-spezifischen T-Zellen (Kasten 1) zu berechnen. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire.">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li><li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells.">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die pMHC Tetramer basierte Anreicherung von Zellen-Methode von diesem Protokoll vorgestellt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Epitop-spezifischer T-Zellen aus körpereigenen T-Zellen Repertoires. Die Verwendung von Tetrameren pMHC ermöglicht Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen direkt auf die Fähigkeit ihrer TCRs auf artverwandten pMHC Liganden binden. Die Anreicherung stellt einen Grad der Empfindlichkeit derart, dass extrem selten Populationen von Antigen-spezifischen T-Zellen aus endogenen Repert...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagent</strong</td&gt;<td<strong&gt; Hersteller</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE oder APC konjugierten pMHC Tetramer (oder Multimer)</td&gt;<td&gt; By Ermittler Made, erhalten aus der NIH Tetramer Kern oder gekauft aus kommerziellen Quellen</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE konjugierte magnetische Mikrobeads</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC konjugierten magnetischen Mikrokügelchen</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS magnetischen Säulen</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS oder QuadroMACS Magneten</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 oder 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Zellzählung Perlen</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

Eine Grundvoraussetzung für die Forscher studieren adaptiven Immunität in vivo experimentellen Modellen ist die Fähigkeit, T-Zellen auf ihren T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Spezifität zu identifizieren. Viele indirekte Methoden zur Verfügung, in denen ein Schüttgut Population von T-Zellen in vitro mit einem Antigen und Epitop-spezifischer T-Zellen werden durch die Messung einer funktionalen Antwort wie Proliferation, Zytokinproduktion, oder Expression der Aktivierungsmarker 1 identifiziert wird angeregt. Jedoch sind diese Methoden nur identifizieren Epitop-spezifischen T-Zellen, die eine von vielen möglichen Funktionen, und sie sind nicht empfindlich genug, um Epitop-spezifischer T-Zellen bei naiven Vorstufe Frequenzen zu detektieren. Eine beliebte Alternative ist die TCR-transgene adoptiven Transfer Modell, in dem monoklonalen T-Zellen aus einem transgenen Maus TCR in histokompatiblen Hosts ausgesät, um eine große Population von Vorläufer-Epitop-spezifische T-Zellen, die easi sein könnenly mit der Verwendung eines kongenen Markerantikörper 2,3 nachverfolgt. Wenn leistungsfähig leidet dieses Verfahren aus experimentellen Artefakte mit der unphysiologischen Häufigkeit von T-Zellen mit einer Spezifität für ein einzelnes Epitop 4,5 zugeordnet. Darüber hinaus kann dieses System nicht verwendet, um die funktionelle Heterogenität der Epitop-spezifische T-Zell-Klone in einer polyklonalen Population untersuchen. Der ideale Weg zur adaptiven Immunität studieren sollte den direkten Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen aus dem endogenen T-Zell-Repertoire mit einer Methode, TCR Aspekt unterscheidet ausschließlich durch dessen Bindung an cognate Peptid: MHC (pMHC)-Komplexe. Die Verwendung von Tetrameren pMHC und Durchflusszytometrie erreicht dieses 6, jedoch wird auf die Erfassung von hochfrequenten Populationen von Epitop-spezifischer T-Zellen nur gefunden folgenden antigeninduzierte klonale Expansion begrenzt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, die die Verwendung von pMHC Tetramere koordiniert und magnetic Zellanreicherung Technologie, um Erkennung von extrem niederfrequenten Epitop-spezifischer T-Zellen aus der Maus Lymphgewebe 3,7. Mit dieser Technik kann ein umfassender verfolgen gesamte epitopspezifischen Populationen von endogenen T-Zellen in Mäusen in allen Stadien der Immunantwort.

1 zeigt repräsentativ Durchflusszytometrie Parzellen pMHCII Tetramer angereicherten Milz und Lymphknoten-Proben von naiven Mäusen, während 2 zeigt repräsentative Daten für Mäuse zuvor mit dem jeweiligen Peptid + CFA immunisiert. Serielle Gating entfernt Autofluoreszenzlichtbild und andere unerwünschte Ereignisse aus der Analyse der CD4 + T-Zellpopulationen. Die CD8 + T-Zell-Population dient als nützliche interne negative Kontrolle für pMHCII Tetramerfärbung von CD4 + T-Zellen....

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Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von Interesse<em&gt; In vivo</em&gt; Experimentellen Systemen.

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von Interesse In vivo Experimentellen Systemen.

Serie: Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Ableitung von T-Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aus embryonalen Stammzellen der Maus

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Adoptive Transfer of P14 T-Cells into Tumor-Bearing Mice

Adoptiver Transfer von p14-T-Zellen in tumortragende Mäuse

Isolierung und Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen in der Lunge der Maus

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Autor im Rampenlicht: Optimiertes Protokoll zum Nachweis antigenspezifischer T-Zellen in der Lunge von Mäusen mit Hilfe von Tetrameren

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...