Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von NIH (5U01CA137070) und der American Cancer Society (RSG-09-070 bis 01-LIB), einem Cancer Research Institute Investigator Award (MK), eine American Heart Association vor-Stipendium (KM) und unterstützt einem spanischen Ministerium für Bildung und Wissenschaft Fellowship (APG). Wir würden das danken Dr. Nicholas Restifo und Dr. Zhiya Yu (NIH / NCI) für hilfreiche Anregungen, um das Protokoll wie.

1. Bereiten Retrovirale Construct <ol><li> Sub-Klon des T-Zell-Rezeptor (TCR) Gen von Interesse in einen retroviralen Vektor (Abbildung 1, Beispiel Vektoren pMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs aus Cellbiolabs). Die TCR α-und β-Kette-Gen sollte auf dem gleichen Vektor unter der Kontrolle des gleichen Promotors werden, um gleich Expression gewährleisten. Wenn die TCR von Interesse ist menschlich, benötigen Sie den humanen konstanten Domänen von Maus konstanten Domänen 9 ersetzt werden. Unsere Beobachtung ist, dass in voller Länge menschlichen TCRs nicht stabil auf Maus-T-Zellen zu exprimieren. </li><li> Bereiten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA mittels Qiagen Maxi Prep Kit oder ein ähnliches Produkt. Die Konzentration der Plasmid sollte bei etwa 1 ug / ul werden. </li></ol> 2. Transfektion und T-Zell-Isolation Tag -1 (Platte Verpackung Zellen) <ol><li> Verdrängen Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) retroviralen Verpackung Zellen mit Trypsin-EDTA und neutralisieren mit DMEM-Medium. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 xg für 5 min. Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in DMEM-Medium. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen und löst die Zellen in 0.6x10 6 / mL. Plate 10 ml Zellsuspension in einem 10 mm Poly-Lysin beschichtet Gewebekulturplatte und wachsen über Nacht in einer Zelle Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Tag 0 (Transfektion) <ol start="4"><li> Am nächsten Morgen, untersuchen die Zellen unter einem Lichtmikroskop. Die Zellen sollten ca. 80% konfluent. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium von der Platte. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und 10 ml vorgewärmte, frische DMEM-Medium ohne Penicillin-Streptomycin (Pen / Strep). (Hinweis: Pen / Strep kann mit der Transfektion stören) </li><li> Bereiten Transfektion komplex. Bereiten Mix A und B wie folgt: <table border="0"><tbody><tr><td> Mix A: Plasmid-DNA </td><td> 9 ug </td></tr><tr><td> PCL-Eco Helferplasmids </td><td> 6,3 pg </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td> Mix B: Lipopfectime 2000 </td><td> 60 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> 1,5 ml </td></tr></tbody></table> Inkubieren A und B getrennt für 5 Minuten bei Raumtemperatur Mix A und B zusammen vorsichtig und inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf die Transfektion Komplex zu bilden. </li><li> Langsam tropft das Gemisch (insgesamt 3 ml) in den Plat-E-Zellen. Schütteln Sie die Platte hin und her, um die Transfektion Mischung gleichmäßig zu verteilen. </li><li> Inkubieren Zellen bei 37 ° C / 5% CO 2 in einer Zelle Inkubator. </li><li> Nach 6-8 Stunden, ersetzen Medium mit 10 ml frischem DMEM-Medium (mit Pen / Strep) für die virale Produktion. </li></ol> Coat Platte mit Antikörpern <ol start="10"><li> Maus T-Zellen müssen vor dem viralen Transduktion aktiviert werden. Es gibt eine Vielzahl Möglichkeiten, um T-Zellen zu aktivieren. Hier verwenden wir Platte gebundenen Anti-CD3e und anti-CD28 Antikörper. Bereiten Sie ein Antikörper Mischung von 1 pg / ml anti-CD3e und 2 pg / ml anti-CD28 in sterile PBS. </li><li> Dispense 250 ul des Antikörpers Mischung in jede Vertiefung einer 24-well Zellkulturschale. Die Platte kann über Nacht bei 4 ° C oder 2 Stunden beschichtet werden bei 37 ° C. </li></ol> Erstellung von Einzel-Zellsuspension aus Maus-Milz <ol start="12"><li> Zwergmaus Milz und Transfer zum RPMI-Medium. </li><li> Legen Sie die Milz in einer Zelle Sieb. Mash die Milz mit einer Spritze Kolben in eine 5 cm Gewebekulturplatten. Rinse-Zellen aus der Zelle Sieb mit sterilem PBS. </li><li> Centrifuge 1000 xg, 5 min. </li><li> Überstand. Resuspendieren Zellpellet in ACK Lysepuffer (2 mL pro Milz). Inkubieren von 2 bis 3 min bei Raumtemperatur. Add RPMI-Medium bis zu 20 ml und Zentrifuge 1000 xg für 5 min. </li><li> Überstand. Resuspendieren Zellpellet in sterile PBS. Bestimmen der Zellzahl und Zentrifuge 1000 xg für 5 min bei 4 ° C. Gehen Sie auf die Isolierung von T-Zellen. </li></ol> Isolation und Aktivierung von Maus-T-Zellen <ol start="17"><li> Magnetisch-Label die Zellen nach dem Produkt-Handbuch (CD8 + T-Zell-Isolations-Kit von Miltenyi Biotec). </li><li> Legen Sie eine LS-Säule (Miltenyi Biotec) in der magnetic Feld. Übernehmen markierte Zellsuspension auf die Säule. Sammeln Flow-Through-(angereichert Maus CD8 + T-Zellen). Die Säule wird dreimal mit 3 ml Puffer nach dem Handbuch und verbinden sich mit früheren Durchströmung. </li><li> Stain die Zellen mit anti-CD3e und anti-CD8a Antikörper und zu analysieren, mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2a). Für eine typische Trennung kann ~ 8-10% der gesamten Zellen isoliert werden. ~ 90% der isolierten Zellen sind CD8 + T-Zellen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 xg, 5 min. Überstand verwerfen. Zellpellet in RPMI-Medium mit rekombinantem humanem IL-2 (rhIL2, 20 ng / ml) bei 1x10 6 / ml. </li><li> Kurz vor Zugabe der Zellen, zu entfernen Antikörper-Lösung von der Platte (vorher in 2.11) hergestellt. Spülen Sie jede Vertiefung mit sterilem PBS und entfernen PBS. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung. Legen Sie die Platte bei 37 ° C / 5% CO 2 in einer Zelle Inkubator. </li></ol> 3. (Tag 2 und Tag 3) Die Infektion von aktivierten T-Zellen <ol><li> Nach 2 Tagen Virus-Produktion sollte das Medium in den Plat-E Zellplatte gelb werden. Übertragung viraler Überstand in ein 15 mL konischen Rohr. Fügen Sie 10 ml frisches DMEM-Medium auf die Platte für weitere virale Produktion (Optional). </li><li> Centrifuge Virusüberstand bei 1000 xg für 5 min auf Zellen Ablagerungen zu entfernen. Sorgfältig Transfer Virusüberstand in ein neues Röhrchen. Lassen Sie etwas Flüssigkeit am Boden des Röhrchens und stören nicht die Zellen Schutt. </li><li> Aktivierten T-Zellen von der Platte in eine 50 ml konischen Rohr Collect. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen. Sparen Sie einige Zellen in ein separates Röhrchen als negativ (un-transduzierten) eingesetzt werden. Zentrifugation bei 1000 xg für 5 min und Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in Virusüberstand bei 10 6 Zellen pro 1 ml mit 20 ng / mL rhIL2 und 10 pg / ml Protaminsulfat. 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Resuspendieren der Zellen in das Steuerrohr in RPMI Medium bei gleicher Zelldichte mit der gleichen Menge an rhIL2 und Protaminsulfat. Fügen Sie die Zellen auf die gleiche Platte. </li><li> Wickeln Sie die Platte mit Kunststoff-Folie. Zentrifuge 90 Minuten bei 2000 xg, bei 32 ° C ohne Bremse. </li><li> Nach der Zentrifugation, entfernen Sie die Kunststoff-Folie. 1 ml frisches RPMI-Medium mit 20 ng / mL rhIL2 in jede Vertiefung. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator. </li><li> (Optional) Höhere Expression von TCR kann durch das Sammeln der Virus-Überstand und Wiederholung der Infektion Verfahren am Tag 3 erreicht werden. </li></ol> 4. Expansion von Zellen und Evaluierung von Transduktionseffizienz <ol><li> Untersuchen Sie die transduzierten T-Zellen täglich. Split der Zellen bei 1:3-Verhältnis, wenn nötig in RPMI-Medium rhIL2. Lassen Sie sich nicht die Zellen überwuchern (medium gelb). </li><li> Am Tag 6 oder Tag 7, färben die Zellen mit dem Antikörper und MHC-Tetramer spezifisch für den TCR auf den Ausdruck des TCR auf T-Zell-Oberfläche zu beurteilen. Verwenden Sie die un-transduzierten T-Zellen als Kontrolle (Abbildung 2c). </li><li> Die transduzierten T-Zellen sind bereit für weitere Downstream-Anwendungen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Oft ist es vorteilhaft, T-Zell-Untergruppen vor Transduktion zu reinigen, obwohl Splenozyten können ohne Reinigung transduziert werden. Hohe Reinheit T-Zell-Untergruppen erhalten Sie über kommerzielle magnetische Beads (Abb. 2a). Zur Beurteilung der Expression von TCR auf T-Zellen können Antikörper, die spezifisch für TCR Alpha-oder Beta-Ketten verwendet werden. In der Regel 30% bis 80% der Zellen ausdrücken können transduzierten TCR (Abb. 2b) in Abhängigkeit von der TCR-Gene und Virustiter. MHC-Tetramer spezifisch für den TCR kann auch verwendet werden, um weiter zu verifizieren funktionelle Expression von TCR (Abbildung 2c) werden. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Beispiel T-Zell-Rezeptor-Gen-Konstrukt sub-kloniert in einen retroviralen Vektor. Volle Länge alpha und beta-Kette-Gene sind durch eine Selbst-spaltbare 2A Peptidlinker 8 verbunden. <img src="/files/ftp_upload/2307/2307fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel für erfolgreiche Isolierung und Transduktion von Maus-T-Zellen. (A) CD8 T-Zellen wurden aus Milzzellen mit CD8a + T-Zell-Isolation Kit (Miltenyi Biotec) und gefärbt mit anti-CD3e und anti-CD8a Antikörper isoliert. 209 -217 4-Peptid und gefärbt mit anti-human Vbeta 8-Antikörper (b) und HLA-A2kb gp100-Tetramer (c): Isolierte CD8 T-Zellen wurden mit R6C12 TCR spezifisch für humanes gp100 transduziert.

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Mehrere Schritte sind entscheidend, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Plat-E Verpackungs-Zelllinie sollte in gesundem Zustand gehalten werden. Falls erforderlich, können die Zellen ein paar Mal in DMEM-Medium mit 1 pg / mL Puromycin, 10 pg / ml Blasticidin zu einem Verlust der retroviralen Struktur Proteinexpression verhindern passagiert werden. Am Tag der Transfektion sollten die Zellen ca. 80% konfluent sein. Zu wenige oder zu viele Zellen reduzieren die Virustiter. Das Virus Qualität kann durch Tests an Zelllinien, die leicht zu transduzierten überprüft werden. Da TCRs CD3-Komplexe auf der Zelloberfläche exprimiert werden müssen, verwenden wir routinemäßig 58α-/β- Hybridomzellen 10 (a-Zelllinie, die nicht exprimiert endogenen TCR α-oder β-Kette, aber nicht ausdrücken CD3-Komplex). Wir erhalten fast 100% Transduktionseffizienz von Hybridomzellen, wenn transduzierenden Zellen mit 1 ml Virus-Überstand. Schließlich müssen die T-Zellen aktiviert werden und wuchernden, weil Retrovirus nur infizieren können sich aktiv teilenden Zellen. Die hier vorgestellte Methode zur Herstellung von Antigen-spezifischen T-Zellen hat einige Einschränkungen. Erstens ist es schwierig, 100% Transduktionseffizienz für primäre Maus T-Zellen zu erreichen. Ein Teil der Zellen exprimieren nicht das TCR von Interesse. Zweitens, die transduzierten TCR α-und β-Ketten können mit endogenen TCR Fehlpaarung 9, die die Expression Niveau des TCR von Interesse zu reduzieren. Darüber hinaus können die fehlgepaarten TCRs Ursache Autoimmunität in vivo 11. Schließlich gibt es nur einen begrenzten Zeitrahmen der transduzierten T-Zellen verwendet werden kann. Nach ca. 1 Woche durchlaufen die Zellen Apoptose sei denn, er re-stimuliert. Allerdings können die Zellen erschöpft und verlieren Funktionen mit sich wiederholenden re-Stimulationen.

Media: DMEM-Medium (DMEM +10% hitzeinaktiviertem FBS + Pen / Strep + L-Glu + Natriumpyruvat + Non-essentielle Aminosäure). DMEM-Medium ohne Pen / Strep (Wie DMEM-Medium, jedoch ohne Zusatz von Pen / Strep). RPMI-Medium (RPMI +10% hitzeinaktiviertem FBS + L-Glu + Non-essentielle Aminosäure + β-Mercaphoethanol + Pen / Strep + Natriumpyruvat).

retroviral transduction of t-cell receptors in mouse t-cells

T-Zell-Rezeptoren (TCR) spielen eine zentrale Rolle im Immunsystem. TCRs auf T-Zell-Oberflächen können spezifisch erkennen Peptid-Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APC) 1 vorgestellt. Diese Anerkennung führt zur Aktivierung von T-Zellen und eine Reihe von funktionellen Ergebnisse (zB Produktion von Zytokinen, die Tötung der Zielzellen). Das Verständnis der funktionellen Rolle des TCR ist entscheidend für die Leistung des Immunsystems zu nutzen, um eine Vielzahl von immunologischen Erkrankungen (zB Krebs oder Autoimmunität) zu behandeln. Es ist zweckmäßig, TCRs in Maus-Modellen, die auf verschiedene Weise erreicht werden kann studieren. Machen TCR transgenen Mausmodellen ist kostspielig und zeitaufwändig und derzeit gibt es nur eine begrenzte Anzahl von ihnen zur Verfügung 2-4. Alternativ Mäusen mit Antigen-spezifischen T-Zellen können durch Knochenmark-Chimäre generiert werden. Auch diese Methode dauert mehrere Wochen und erfordert Know-how 5. Retrovirale Transduktion von TCRs in in vitro aktivierten Maus-T-Zellen ist eine schnelle und relativ einfache Methode, um T-Zellen des gewünschten Peptid-MHC-Spezifität zu erhalten. Antigen-spezifische T-Zellen können in einer Woche erzeugt werden und in jedem Downstream-Anwendungen. Studieren transduzierten T-Zellen hat auch unmittelbare Anwendung für die menschliche Immuntherapie, wie adoptiven Transfer von menschlichen T-Zellen transduziert mit Antigen-spezifischen TCR ist eine neue Strategie für Krebs Behandlung 6. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur retroviral transduzieren TCRs in in vitro aktivierten T-Zellen der Maus. Sowohl Mensch und Maus TCR-Gene verwendet werden können. Retroviren tragen spezifische TCR-Gene erzeugt und verwendet, um Maus-T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper aktiviert infizieren. Nach In-vitro-Expansion transduzierten T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen Transduktion

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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