Research berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter-Award Anzahl R01CA174385 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Ein. Reagenzien Vorbereitung <ol><li> Planen RPMI-PLGH durch Mischen von 500 ml RPMI-1640 und jeweils 5 ml Penicillin-Streptomycin, L-Glutamin, und HEPES-Lösung. </li><li> Planen R10 Lösung durch Mischen RPMI-PLGH mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Die FBS ist hitzeinaktiviertem bei 56 ° C für 30 min vor der Zugabe. </li><li> Vorwärmen bei 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS und 15 ml R10 in sterilen konischen Rohren. </li><li> Herstellung von Arrays von nanowells in PDMS: Das Silizium-Master hergestellt ist unter Verwendung von Photolithographie Wesentlichen wie zuvor beschrieben 10. Gründlich mischen die Sylgard 184 Elastomer-Kit Basis und Härter bei 10:1 Gewichtsverhältnis in einem Einwegbecher mit einem Kunststoff-Messer. Entgasen das Gemisch in einer Vakuumkammer für 1 Stunde. Gießen Mischung auf die nanowell Array versiegeln mit einem Objektträger aus Glas und lassen Sie es für 30 Minuten sitzen. Übertragen Sie die Baugruppe in einem Ofen auf 80 ° C für 2 Stunden und ließ bei Raumtemperatur abkühlen 1 Stunde. Das Elastomer wird Aktuelle während dieser Zeit und verbindet sich mit dem Glasträger. Der Objektträger mit dem PDMS nanowell Array wird vorsichtig von der Silizium-Master aufgehoben, bedeckt mit Klebeband und gelagert, bis die zukünftige Verwendung. </li></ol> 2. Zielzelle (T) Labeling <ol><li> Zählen 5.000.000 Zielzellen aus Zellkultur unter Verwendung eines Hämozytometers und Pellet die Zellen in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugieren bei 340 × g für 5 min. Die Zellkultur wird geteilt am Vortag in 5 ml Gesamtvolumen (Dichte = 1 Millionen / ml) kultiviert und in T-25-Kolben (VWR). Protokolle für Zellzählung unter Verwendung Hämozytometer wurden im Detail zuvor beschrieben 11 </li><li> Saugen Sie überschüssige Medien hinterließ etwa 50 ml Medien. </li><li> Vorbereiten einer Arbeitslösung von Cell Tracker Red (CTR) durch Mischen von 0,5 ul CTR Lager (1 mM) in 150 ul RPMI-PLGH (Endkonzentration 2,5 pM). Fügen Sie 150 ul der Arbeitslösung zu den Zielzellen und gründlich mit einem P200 Pipette.Alternativ können PKH 26 (Endkonzentration von 2 uM) Label Zielzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. </li><li> Bei 37 ° C / 5% CO 2 für 20 min. </li></ol> 3. Effektor (E) Cell Labeling <ol><li> Zählen 5.000.000 Effektorzellen aus Zellkultur unter Verwendung eines Hämozytometers und Pellet die Zellen in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugieren bei 340 × g für 5 min. </li><li> Saugen Sie überschüssige Medien </li><li> Bereiten Sie eine funktionierende Lösung Vybrant DyeCycleViolet Stain Lösung durch Zugabe von 1 ul 5 mM Vybrant Violet Lager zu 1 ml R10 Medien (Endkonzentration von 5 uM). Fügen Sie die funktionierende Lösung zu den Zellen und resuspendieren mit P200 Pipette. Alternativ können PKH 67 (Endkonzentration von 2 uM) Label Zielzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Wenn PKH 67 verwendet wird, dann SYTOX Green sollten nicht verwendet, da sie in der gleichen Fluoreszenzkanal sind. Die Aufzählung der apoptotischen Ziele erfolgt ausschließlich mit AnnexinV Färbung in diesem Fall. Hinweis: Wenn die Durchführung Zeitraffer-und nicht Endpunkt Messungen, UV Farbstoffe wie Vybrant Violet sollte vermieden werden. </li><li> Bei 37 ° C / 5% CO 2 für 20 min. </li></ol> 4. Trennung von lebenden und toten Zellen durch einen Dichtegradienten <ol><li> Fügen Sie 6,8 ml und 6,0 ​​ml RPMI-PLGH zum Ziel und Effektorzellen bzw. und mischen durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig. </li><li> Layer 3,5 ml Ficoll-Paque Plus Unterseite jedes konische Röhrchen mit Ziel-und Effektorzellen. Schicht die FICOLL langsam auf eine gute Bildung von Schichten zwischen FICOLL und Medien. </li><li> Zentrifuge beide Rohre bei 340 × g für 30 min. ohne Bremse und Beschleunigung. </li><li> Bei der Zentrifugation zu übertragen 7 ml vorgewärmtes PBS auf eine 4-Well-Platte. Planen nanowell Array (hergestellt in PDMS): saubere Boden Glasobjektträger mit Ethanol und oxidieren das PDMS bei hohen RF-Einstellung unter Verwendung von Plasma Oxidierer für 1 min. Dieser Schritt wird sterilize die nanowell Array gleichzeitig Rendern des PDMS hydrophil. Unmittelbar bewegen nanowell Array in der Platte mit PBS. </li><li> Übertragen Sie die Platte mit einem Biosicherheitswerkbank und saugen überschüssiges PBS. Make 10 ml 1% Noble-Agar durch Zugabe von 100 mg Agarpulver bis 10 ml DI-Wasser und dann Mikrowelle es für 30-45 sek. Anwenden erwärmen 1% Noble-Agar am oberen und unteren Rand der Folie, die das Glas nanowell Array, um das Array zu immobilisieren und warten 10 min für Agar verfestigt enthält. 3 ml PBS und saugen überschüssiges Agar. </li><li> 3 ml R10 auf der Oberseite des nanowell Array und lassen Sie es für ~ 10 min äquilibrieren. </li><li> Nach Zentrifugation Ficoll aspirieren 5 ml Medien von der oberen Schicht von jedem Rohr. Achten Sie darauf, um die Schicht, welche die Zellen absaugen. </li><li> Ernten Sie die Zellen (weiße Schicht) durch die Rückgewinnung von 1-2 ml aus der Schicht zwischen FICOLL und Medien mit P1, 000 Pipette und Umzug in neue sterile konische Röhrchen. Wiederholen Sie dies für beide Arten von Zellen, während Sie sicher, dass Sie Maximeize die Recovery-Zellen. </li><li> 3 ml vorgewärmten RPMI-PLGH in jedes Röhrchen, durch Pipettieren gründlich mischen und Pellet durch Zentrifugation bei 340 xg für 5 min bei voller Beschleunigung und Bremse. </li><li> Saugen Sie die überschüssige Medien, 5 ml vorgewärmten RPMI-PLGH in jedes Röhrchen und wiederholen Zentrifugation bei 340 xg für 5 min. </li><li> Saugen Sie die überschüssige Medien und das Zellpellet in 500 ul R10. </li><li> Zählen lebender Zellen unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschluss-Methode auf einem Hämozytometer. </li></ol> 5. Zelle Verladung auf Nanowell Array <ol><li> Saugen Sie überschüssige Medien aus nanowell Array und 2 ml frisches R10 über das Array. Saugen wieder, während Sie sicher, dass die Spitze der nanowell Array ist nicht zu nass / trocken, wie es wird die Verteilung von Zellen beeinflussen. </li><li> Kaution 1 x 10 5 Effektorzellen in 200 ul R10 auf nanowell Arrayoberfläche (Dichte = 5 x 10 5 Zellen / ml). </li><li> Lassen Zellen für 5 min absetzen und mit einem Standard-Gewebekulturmikroskopeinrichtung Scheck ensicherzustellen, dass die Verteilung der Zellen erwünscht ist. Fügen Sie mehrere Zellen, wenn nötig. </li><li> Kaution 1 x 10 5 Zielzellen in 200 ul R10 auf nanowell Arrayoberfläche (Dichte = 5 x 10 5 Zellen / ml). </li><li> Lassen Zellen für 5 min und unter Verwendung eines Standard Gewebekulturmikroskopeinrichtung Überprüfung, um sicherzustellen, dass die Verteilung der Zellen erwünscht ist niederzulassen. Fügen Sie mehrere Zellen, wenn nötig. </li><li> Spülen nanowell Array vorsichtig mit 2 ml R10 und saugen überschüssige Medien. </li><li> Bereiten Sie 3 ml vorgewärmten R10 in einem 15 ml sterile konische Röhre. Hinzufügen 3 ul 0,5 mM SYTOX Green Nucleic Acid Stain (Endkonzentration 0,5 uM) und 60 ul Annexin V-Alexa Fluor 647 zu arbeiten herzustellen. Hinzufügen der Gebrauchslösung auf das 4-Well-Platte sorgfältig gleichzeitig dafür, dass Zellen nicht aus den Vertiefungen verdrängt. </li><li> Bei 37 ° C / 5% CO 2 für 15 min. </li></ol> 6. Imaging 1 <ol><li> Erwerben Sie Bilder des nanowell Array mit einem Fluoreszenz-MikrOSCOPE: In diesem Beispiel verwenden wir ein ZEISS Observer Z-1 Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und Lambda-DG4 ausgestattet. </li><li> Initialisieren Sie die Software und das Mikroskop und überprüfen Sie die Signalstärke auf dem übertragenen Licht und den anderen fluoreszierenden Kanäle. Insgesamt werden fünf Kanäle entsprechend lauten: Durchlicht, Annexin V-647 (Cy5-Filter), CTR (DsRed-Filter), SYTOX Green (FITC-Filter), und Vybrant Violet (DAPI-Filter). Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop, um eine maximale Signal-Rausch-unter Vermeidung Sättigung einzustellen. </li><li> Set X-und Y-Position für den nanowell Array. Beginnen Prozess, indem die Null-Position und Initialisieren Fokus auf der Mitte der 7 x 7 nanowell Array Block auf der linken oberen Ecke des nanowell array Stempel. Einstellen der x, y-Position mit dem Zentrum jedes Blocks und der z-Wert übereinstimmen, um genau der Schwerpunkt jedes Blockes. </li><li> Sobald die Position und Fokus ganz eingestellt sind, stellen Sie sicher, Bildaufnahme im linearen Modus gesetzt und Bilder aufzunehmen. <sTrong&gt; Hinweis: Bei Bedarf wiederum auf dem Inkubator und CO 2 auf dem Mikroskop mindestens 30 min vor dem Experiment. </li></ol> 7. Post-Bildgebung Übertragen der 4-Well-Platte, welche die nanowell Array in einen Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) über 6 Stunden. 8. Imaging 2 Erwerben die Bilder an der zweiten Zeitpunkt, wie in Schritt 6 beschriebenen. 9. Image Analysis <ol><li> Die Belegung von Zellen innerhalb des nanowells wird durch die Verwendung von geeigneten Bildaufteilung Programme (zB ImageJ, bestimmt <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) im Wesentlichen wie zuvor beschrieben 9,12. </li><li> Analyse der anfänglichen Menge von Mikroskopaufnahmen (t = 0 h, t 0) wird verwendet, um eine Datenbank der einzelnen nanowells die genau eine Live Zielzelle (identifiziert erzeugenvon CellTracker Red, rot) und keine toten Zellen (gekennzeichnet durch Annexin V-Färbung, grün) [T1T 0 nanowells]. </li><li> Analyse des zweiten Satzes von Mikroskopaufnahmen (t = 6 h; t 6) wird verwendet, um autonom zu bestimmen eine zweite Datenbank von nanowells enthaltend 1 Zielzelle (rot) [6 T1T nanowells]. Eine Integritätsprüfung (Datenbankabfrage) implementiert ist, um sicherzustellen, dass alle stromführenden Targets bei t 0 bis zum Zeitpunkt t 6 Targets abgestimmt sind, um einen endgültigen Satz übereinstimmender Targets (implementiert als nanowells die T1T 0 = T1T 6, wie T1match bezeichnet haben) zu erzeugen </li><li> Die Zahl der Effektorzellen in nanowells wird anhand Vybrant-Färbung bei t 0 [E1 nanowells] </li><li> Eine Datenbankabfrage wird implementiert, um nanowells mit einzelnen Effektoren identifizieren einzelne Ziele (definiert als nanowells, die E1-und T1-Spiel haben, wie E1T1 bezeichnet) coinkubiert </li><li> Effektor-induzierte Apoptose wird durch i erzielte<html> dentifying Ziele, die Annexin V sind bei t 0 und Annexin V positiv t 4 (E1T1 mit Annexin V Ziel Färbung bei t 6) negativ. </li></ol> 10. Optional Zeitraffer-Imaging des Tötens mit Nikons BioStation IM <ol><li> Nehmen Sie eine Petrischale mit Deckglas unten und schneiden Sie ein kleines Stück des nanowell Array-Chip (hergestellt bei Schritt 5), die genau auf dem Deckglas passen. Stellen Sie sicher, dass der Chip feucht bleibt während des Schneidens. </li><li> Mix 1 x 10 6 Ziele und 1 x 10 6 T-Zellen in 100 ul Medien und pipettieren es auf dem Deckglas. </li><li> Lassen Sie etwa 15-30 min zu lassen die Zellen zu begleichen. </li><li> Schnell kehren die kleinen nanowell Array-Chip und legen Sie es auf dem Deckglas. </li><li> Um sicherzustellen, dass der Chip nicht in der Lage, während der Bildgebung Ort zu bewegen ein oder zwei 20mm x 20mm Deckgläser auf die Oberseite des Chips. Druck ausüben leise zu den Chip an der Unterseite der Schale drücken. </li></ol>Zelt &quot;&gt; Hinweis: Die nanowell Array-Chip Hintern ist zu dick für hochauflösende Bildgebung und hat daher auf den Kopf gestellt werden Während dieser, viele der Zellen ausgewaschen werden Da dies nicht leicht kontrollierten Zellzahlen werden in Schritt 9.2.. und Inkubationszeit in Schritt 9,3 müssen optimiert werden.

<ol>
	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+visualizing+immunity+in+context.">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8++T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis.">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li><li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies.">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8++T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li><li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+a+house+of+cards:+re-evaluating+CD8++T-cell+immune+correlates+against+HIV.">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li><li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry.">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben das Protokoll für ein Hochdurchsatz-Single-Cell-Assay cytolytischen durch Co-Inkubation von Effektoren und Targets in Arrays von nanowells (Abbildung 1) aktiviert skizziert. Neben Durchsatz ein großer Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, Effektorzellen-vermittelten Zytotoxizität gegen gewünschten Zielzellen ohne Zielzelle Engineering Dies wiederum erlaubt die Verwendung von autologen oder Matched / primären Tumorzellen als Zielzellen zu überwachen. Die räumliche Begrenzung ermö...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-Glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 15-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> 10.000 IU Penicillin 10.000 pg / ml Streptomycin </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200 mM Lösung </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lot geprüft </td></tr><tr><td> Handy Tracker Red Stain </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 ug </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Stain </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX grünen Nukleinsäurefärbemittel </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexin V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Noble-Agar </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% flüssigem, sterilfiltriert </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Helle Linie </td></tr><tr><td> 4-Well-Platte </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plasma Reiniger </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Grundlegende Plasma cleaner </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Fluoreszenzmikroskop (funktioniert mit den drei Teilen unten) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Filter-Controller </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instrument </td><td></td><td> Ultra-Breitband-Wavelength-Umschalter </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> CCD-Mikroskop-Kamera </td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konischen Röhrchen </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc. </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Glasboden Kulturschale </td><td> MatTek Konzern </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm Petrischale, 10 mm Mikrotiter </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

Krebs-Immuntherapie bändigen können die Spezifität der Immunantwort zu zielen und zu beseitigen Tumoren. Adoptiven Zelltherapie (ACT), basierend auf den adoptiven Transfer von T-Zellen gentechnisch verändert, um ein chimäres Antigen-Rezeptor (CAR) ausdrücken hat beträchtliches Potential in klinischen Versuchen 1-4 dargestellt. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung CAR + T-Zellen für die Behandlung von Krebsarten, einschließlich der Fähigkeit, nicht-MHC-beschränkte Antigene gezielt eingesetzt werden und die T-Zellen zur optimalen Überleben, Homing und Persistenz im Wirt zu funktionalisieren, und schließlich, um Apoptose zu induzieren von CAR + T-Zellen bei Wirtstoxizität 5. Abgrenzung der optimalen Funktionen des CAR + T-Zellen mit klinischen Nutzen zugeordnet ist von wesentlicher Bedeutung für die nächste Generation von klinischen Studien. Jüngste Fortschritte in der lebenden Tier Bildgebung wie Mehrphotonenmikroskopie revolutioniert haben die Studie von Immunzellen Funktion in 6,7 vivo. Während diese Studien unser Verständnis der T-Zell-Funktionen in vivo T-Zell-basierte ACT in klinische Studien haben vorgeschoben erfordert die Notwendigkeit, die molekularen und funktionellen Eigenschaften der T-Zell-Zubereitungen Vorinfusionsleitung mit klinischen Wirksamkeit Nachinfusionsleitung verknüpfen, durch Verwendung in vitro-Assays überwacht T-Zell-Funktionen wie, Zytotoxizität und Zytokinsekretion. Standard Durchflusszytometrie basierende Assays entwickelt worden, bestimmen die allgemeine Funktionsweise von Populationen von T-Zellen in der Ebene einzelner Zellen, aber diese sind nicht geeignet für die Überwachung Konjugat Bildung und Leben oder die Fähigkeit der gleichen Zelle zu töten mehrere Ziele 8. Mikrohergestellte Arrays in biokompatible Polymere wie Polydimethylsiloxan (PDMS) ausgebildet sind ein besonders attraktives Verfahren zur räumlich beschränken Effektoren und Targets in kleinen Mengen 9. In Kombination mit automatisierten Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie, thousands von Effektor-Target-Wechselwirkungen können gleichzeitig durch bildgebende einzelnen Vertiefungen einer nanowell Arrays überwacht werden. Wir stellen hier eine Hochdurchsatz-Methodik zur Überwachung T-Zell-vermittelte Zytotoxizität bei der Einzelzell-Ebene, die weitgehend für die Untersuchung der Funktionalität von cytolytischen T-Zellen angewendet werden kann.

Ein Beispiel für die Anwendung des High-Throughput-Assays cytolytischen ist in Abbildung 2 gezeigt. Kurz gesagt, markierten CD19-spezifische CAR + T-Zellen wurden mit markierten Maus EL4-Zielzellen in den einzelnen Wells einer nanowell Array (Sektionen 1-5) coinkubiert. Ein erstes Bild wurde auf dem automatischen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, um die Belegung (Effektoren und / oder Targets) jedes einzelnen nanowell auf dem Array (Abschnitt 6) identifizieren. Bildverarbeitung wurde verwend...

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Aufrufe.  University of Houston. Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Serie: Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Funktionalisierung von Atomkraftmikroskop-Auslegern mit Einzel-T-Zellen oder Einzelpartikeln für die immunologische Einzelkraftspektroskopie

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...