Die Autoren bedanken sich bei Brogan Gast, Michelle Weber und Kristen Lippert anzuerkennen. Die Finanzierung dieser Studie wurde durch NIH Grant R03EB009237 sowie NIH Ausbildung Grants T32EB001026-06 aus dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering und T32HL076124-05 zur Verfügung gestellt.

Ein. Tissue Vorbereitung und Versuchsaufbau <ol><li> Ernte Schweinen Organ unmittelbar nach Euthanasie aus einem Schlachthof oder Forschungseinrichtung und spülen Sie überschüssiges Blut. Schneiden Sie die Herzen von überschüssigem Fett und Gewebe, halten die Vorhöfe und der Aorta intakt. Trim entfernt Fett, um die Lungenarterie aus der Aorta zu trennen. Wenn es irgendwelche Schnitte im Gewebe sind, entsprechend zu verwerfen. </li><li> Wickeln Sie jedes Herz einzeln in Freezer Paper und speichern alle Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank für mindestens 24 Stunden, um eine vollständige Einfrieren zu gewährleisten. </li><li> Wenn Sie bereit sind für den Einsatz (in der Regel weniger als 3 Monate), Tauwetter ein intaktes gefrorenes Schweinesperma Herz in Type 1 Wasser über Nacht in einem 4-Liter-Becher bei 4 ° C getaucht </li><li> Nachdem das Herz vollständig aufgetaut ist, klopfen die Herzen trockenen, wiegen das Herz, und das Gewicht aufgezeichnet. Das Herz eines Marktes Gewicht Schwein sollte wiegen etwa 375-450 g. </li><li> Schließen Sie Größe 18 Masterflex Schlauch mit dem ¼ &quot;Ende einer Stacheldraht Druckminderer. Legen Sie die Stacheldraht Druckminderer undSchlauch innerhalb der Aorta. Platz 2 Schlauchschellen oder sichere Kabelbinder um die Aorta, knapp unterhalb des Truncus brachiocephalicus. Der Druckminderer und Schlauch muss über der Aortenklappe bleiben, so die Koronararterien perfundiert können (Abbildung 1). </li><li> Verwenden Sie eine 30 oder 60-ml-Spritze, um den Schlauch mit Typ I Wasser zu füllen. Legen Sie den Schlauch in der Patrone eines Masterflex Schlauchpumpe in seiner ungefähren Mittelpunkt. Submerge der Zufluss Ende des Schlauches in den Boden eines 4 L-Becherglas mit 2,5 l Wasser gefüllt und sichern den Schlauch. </li><li> Legen Sie die Herzen im Becher mit Wasser gefüllt, und prime die Pumpe Luftblasen zu entfernen. Wenn Blasen beobachtet werden, die von der Aorta, wo der Schlauch eingelegt wird, kann die Aorta neu positioniert oder mit zusätzlichen Bindungen befestigt werden. Eine luftdichte Dichtung ist wichtig, um eine angemessene Druck während der Dezellularisierung Verfahrens (Abbildung 2) zu halten. </li><li> Legen Sie die 4 L Becherglas mit 3 L einer 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 Lösung auf Rührplatte und erwärmen auf 37 ° C bei der Vorbereitung der Dezellularisierung Prozess. </li></ol> 2. Tissue Spülen <ol><li> Die Pumpe auf einer Strömungsgeschwindigkeit von 400 ml / min, wobei auf die korrekte Größe Schlauch ausgewählt ist. Spülen Sie das Herz mit Typ I Wasser für 15-25 min. Da die Pumpe gestartet wird, sollte das Herz anschwellen und effuse Blut aus den Herzkammern. Frische Lösung sollte alle 5-10 min substituiert sein kann, oder als bezogen auf die Menge an Blut aus dem Herzen entnommen benötigt. Wenn Blut nicht vom Herzen ausgegossen, passen die Schläuche und Klemmen wie nötig. </li><li> Stoppen Sie die Pumpe und übertragen das Herz zu einem separaten Becherglas mit 2X Phosphat gepufferten Saline (PBS). Nachdem der Schlauch in der Lösung eingetaucht ist, starten Sie die Pumpe und erhöht den Durchfluss auf 700 ml / min. Das Herz sollte in-Lösung für 15 min bleiben, verändert die Lösung alle 5 min. Jede Lösung Wandel erfordert die Pumpe vorübergehend gestoppt werden, während das Gewebe und Schläuche bewegtauf den neuen Becherglas. </li><li> Übertragen Sie das Herz I Wasser für 10 min Geben und erhöhen den Durchfluss auf 750 ml / min. </li></ol> 3. Dezellularisierung und Solution Perfusion <ol><li> Übertragen Sie die Herzen in das Becherglas mit 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 bei 37 ° C. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 1.200 ml / min und starten Sie die Pumpe. Verwenden Sie einen Rührstab am Boden des Bechers zur Lösung im Becherglas zirkulieren platziert. Das Herz sollte im Bereich von 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-Lösung bei 37 ° C für insgesamt drei Stunden bleiben. Nach 1 Stunde erhöht die Drehzahl auf 1500 ml / min. Nach einer weiteren Stunde, erhöhen die Pumpendrehzahl bis 1.800 ml / min. Das Gewebe wird langsam auf erhöhte Geschwindigkeiten Perfusion zur Konditionierung des Gewebes ausgesetzt und verhindern Ruptur der Gefäße. Das Herz wird anschwellen und fast doppelt so groß bei diesem Schritt des Protokolls. Das Gewebe verliert seine natürliche Farbe, fortschreitend von den Vorhöfen zu den Scheitelpunkt gesamten the-Protokoll (Abbildung 3). </li><li> Nach jeder Lösung Perfusion wird ein zweistufiger Spülen durchgeführt wird, um Zelltrümmer, chemischer Rest ist, und Hilfsmittel Zelllyse zu entfernen. Jedes Spülen besteht aus einem 10 min Spülen in Typ I Wasser durch eine 10 min abspülen mit 2X PBS-Lösung bei Raumtemperatur. Jede Wäsche besteht in der Entfernung von Lösung aus dem ursprünglichen Becherglas Zugabe Spüllösungen, und Zirkulieren des Perfusats in den Becher mit dem untergetauchten Herzens. Nach 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3-Lösung, Wasser bei perfuse 1900 ml / min und dann perfundieren 2X PBS auf 1950 ml / min. </li><li> Übertragen das Herz zu einer Lösung von 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN3 bei Raumtemperatur. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2.000 ml / min und perfuse Lösung für eine Stunde. Entfernen Sie die Lösung aus dem Becherglas und ersetzen mit frischer Lösung, erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2100 ml / min, und versorgen die frische Lösung für eine weitere Stunde und eine Hälfte, womit sich die gesamte Zeit in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 bis 2,5 Stunden. </li><li> Spülen Sie das Gewebe in Typ I Wasser bei 2150 ml / min und 2X PBS bei 2180 ml / min für jeweils 10 Minuten. </li><li> Übertragen das Herz auf eine 4% Natriumdesoxycholat Lösung bei Raumtemperatur. Erhöhen der Pumpgeschwindigkeit, um 2200 ml / min und perfuse Lösung für 3 hr. </li><li> Spülen des Gewebes in Wasser bei Typ I und 2X PBS bei 2200 ml / min für 15 Minuten jeweils, Ändern der Lösungen nach 5-10 min für jede Lösung. Die beschriebenen Schritte Perfusion kann über mehrere Tage durch Durchführen der Spülschritt zweimal und Speichern des Herzens mit aufgesetzter Schlauch über Nacht bei 4 ° C gespalten werden, und eingetaucht in Typ I Wasser. </li><li> Am folgenden Tag, führen Sie eine 5 min mit Typ I Wasser spülen bei 750 ml / min, gefolgt von einer 5 min Spülen in 1X PBS bei 1.500 ml / min. Das Protokoll kann dann bei der beschriebenen Strömungsrate in der richtigen Lösung fortgesetzt. </li></ol> 4. Desinfektion und Endfertigung <ol><li> Übertragen Sie das Herz einer 0,1% peracessigsäure / 4% Ethanol-Lösung und perfuse Lösung für 1,5 h bei 2200 ml / min. </li><li> Die Endspülungen für das Gewebe alle auf 2200 ml / min durchgeführt. Perfundieren des Gewebes mit 1X PBS für 15 min, gefolgt von zwei Waschungen in 5 min Typ I Wasser. Diese Reihe von Spülungen wird noch einmal wiederholt, um die Lösung Perfusion abzuschließen. </li><li> Schalten Sie die Pumpe aus und entfernen Sie das Herz aus der Lösung, um das Herz zu entleeren. Schneiden Sie die Bindungen aus der Aorta, entfernen Sie alle Schläuche, und legen Sie das Herz in ein leeres Becherglas für 1 Stunde abtropfen lassen. Überschüssige Flüssigkeit wird müssen regelmäßig entleert werden. Legen Sie das Herz auf eine saugfähige Unterlage vollständig entleeren das Herz (Abbildung 4). </li><li> Nachdem der größte Teil des Wassers entfernt wird, das Gewicht aufgezeichnet des kardialen extrazellulären Matrix (ECM-C). Das Herz kann erwartet werden ca. 20-25% des ursprünglichen Gewichts während der Dezellularisierung Prozess verliert. </li><li> Sezieren die rechte und linke Herzkammer, sowie die ventrikuläre Septum zur DNA quantificatiauf und histologischen Bearbeitung, um zu bestätigen komplette Dezellularisierung des Gewebes (Abbildung 5). </li><li> Einfrieren der C-ECM bei -80 ° C für mindestens 2 h vor der Lyophilisation. </li></ol>

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	<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung.">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li><li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation.">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart.">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization.">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li><li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+tissues+and+organs.">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li><li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization:+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities.">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li><li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds.">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li><li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation.">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li><li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction.">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li><li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds.">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li><li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold.">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li></ol>

Dr. Gilbert war auf dem Scientific Advisory Board bei ACELL, Inc. während der Studie getan wurde, und vor kurzem wurde die VP für Forschung und Entwicklung. ACELL, Inc. vertreibt Harnblase Matrix und hat keine kommerziellen Interessen in der vorliegenden Studie.

Die aktuelle Studie beschriebene Methodik für eine konsistente und effiziente Dezellularisierung eines Schweine Herzen. Das Protokoll war eine Änderung an einem zuvor veröffentlichten Bericht 1 und enthalten längerer Exposition zu fließen und erhöhtem Druck, die mehr wiederholbare Ergebnisse geliefert. Die resultierende dezellularisierten Gewebe erfüllt alle veröffentlichten Kriterien für eine erfolgreiche Dezellularisierung von Gewebe 2. Häufige Änderungen Lösung wurden durchgeführt, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Sigma </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Fischer </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> Peressigsäure </td><td> Pfaltz und Bauer </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Masterflex Pump Drive </td><td> Cole Parmer </td><td> SI-07.524-50 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Tubing </td><td> Cole Parmer </td><td> 96400-18 </td><td> Größe 18 </td></tr><tr><td> Barbed Reducer </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30.612-20 </td><td></td></tr><tr><td> 4L Beaker </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion

Perfusion-basierte ganzen Organs Dezellularisierung hat kürzlich Interesse im Bereich des Tissue Engineering als Mittel zur ortsspezifischen extrazellulären Matrix Gerüsten erstellen, gewann unter weitgehender Erhaltung der einheimischen Architektur des Gerüsts. Bisher hat dieser Ansatz in einer Vielzahl von Organsysteme verwendet worden, einschließlich Herz, Lunge, Leber und 1-5. Vorherige Verfahren zur Dezellularisierung Gewebe ohne eine leicht zugängliche Gefäßnetz haben bei längerer Exposition von Gewebe, Lösungen von Detergentien, Säuren oder enzymatische Behandlungen als Mittel, um die zellulären und atomare Bestandteile aus dem umgebenden extrazellulären Umgebung 6-8 entfernen gestützt. Allerdings ist die Wirksamkeit dieser Verfahren gelenkig auf der Fähigkeit der Lösungen das Gewebe durch Diffusion eindringen. Im Gegensatz dazu Perfusion von Organen durch die natürliche Gefäßsystem wirksam reduziert den Diffusionsweg und erleichtert den Transport von decellularizatiMittel zum in das Gewebe und zellulären Komponenten aus der Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode, um vollständig decellularize eine intakte Schweine Herzen durch koronare retrograde Perfusion. Das Protokoll ergab ein voll dezellularisierte kardialen extrazellulären Matrix (ECM-c) Gerüst mit der dreidimensionalen Struktur des Herzens intakt. Unser Verfahren verwendet eine Reihe von Enzymen, Detergentien und Säuren mit hypertonischen und hypotonischen Spülungen gekoppelt in der Lyse und Entfernung von Zellen unterstützen. Das verwendete Protokoll eine Trypsin-Lösung, um Zellen von der Matrix durch Triton X-100 und Natriumdesoxycholat Lösungen gefolgt, um die Entfernung von Zellmaterial unterstützen lösen. Die beschriebene Protokoll verwendet auch Perfusion Geschwindigkeiten von mehr als 2 l / min für verlängerte Zeiträume. Die hohe Strömungsgeschwindigkeit, mit der Lösung Änderungen erlaubt den Transport von Agenten des Gewebes ohne Kontamination von Zelltrümmern und gekoppelt gewährleistet effektive Spülung des Gewebes. Das beschriebene Verfahren entfernt alle Kernmaterial von native porcinen Herzgewebe, die Schaffung eines ortsspezifischen kardialen ECM Gerüst, das für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann.

Die Wirkung der Dezellularisierung auf ganze Schweineherzen variiert natürlich aufgrund der Unterschiede in der Größe, Drücke und Behälteranordnung. Daher wird die genaue Zusammensetzung der extrazellulären Matrix abgeleiteten Gerüsten nicht dasselbe vom Herzen zum Herzen. Der Abschluss der beschriebenen Protokoll erbringt ein Herz, das weiße oder durchscheinende zeigt an, den Verlust an Zellmaterial. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass ein Gewebe angesehen werden &quot;dezellularisierte&quot; auf die Kombin...

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Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.7K Aufrufe.  McGowan Institute for Regenerative Medicine. Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.

Serie: Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Forschung

Biotechnik

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ultimately rejection can occur. Creating a functional, autologous bio-artificial heart could solve these challenges. Biofabrication of a heart comprised of scaffold and cells is one option. A natural scaffold with tissue-specific composition as well as micro- and macro-architecture can be obtained by decellularizing hearts from humans or large animals such as pigs. Decellularization involves washing out cellular debris while preserving 3D extracellular matrix and vasculature and allowing &#34;cellularization&#34; at a later timepoint. Capitalizing on our novel finding that perfusion decellularization of complex organs is possible, we developed a more &#34;physiological&#34; method to decellularize non-transplantable human hearts by placing them inside a pressurized pouch, in an inverted orientation, under controlled pressure. The purpose of using a pressurized pouch is to create pressure gradients across the aortic valve to keep it closed and improve myocardial perfusion. Simultaneous assessment of flow dynamics and cellular debris removal during decellularization allowed us to monitor both fluid inflow and debris outflow, thereby generating a scaffold that can be used either for simple cardiac repair (e.g. as a patch or valve scaffold) or as a whole-organ scaffold.

This method enables decellularization of a complex solid organ using a simple protocol based on osmotic shock and perfusion of ionic detergent with minimal organ matrix disruption. It comprises a novel decellularization technique for human hearts inside a pressurized pouch with real-time monitoring of flow dynamics and cellular debris outflow.

Decellularization des ganzen menschlichen Herz in einem unter Druck stehenden Beutel in eine umgekehrte Orientierung

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an allogeneic or xenogeneic source with human cells. A demonstration of methods for the efficient dissection, decellularization, and recellularization of porcine pancreas might benefit the field. Akin to human pancreases, porcine pancreases have a special anatomical arrangement with three lobes (splenic, duodenal, and connection) rounded by the duodenum and small intestine. The duodenal lobe of the pancreas connects to the duodenum by several small blood vessels. Tissue engineering of the pancreas is complicated because of its exocrine and endocrine nature. In this paper, we show a detailed protocol to dissect the whole porcine pancreas and decellularize it with detergents while saving its structure and some extracellular matrix components. To achieve complete perfusion, the aorta is chosen as inlet and the portal vein as outlet. The other blood vessels (hepatic artery, splenic vein, splenic artery,&#160;mesenteric artery and vein tree) and bile duct are ligated. To prevent the formation of thrombus, the pig is heparinized and, immediately after dissection, the organ is flushed with cold heparin. To inhibit the action of exocrine enzymes, the pancreas decellularization is set at 4 &#176;C. The decellularization is performed by perfusion of Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease, with an intermittent and final extensive washing. With a successful decellularization, the pancreas appears white, and a histological evaluation with hematoxylin and eosin shows an absence of nuclei with a preserved extracellular matrix structure. Thus, the proposed method can be used to successfully dissect and decellularize whole porcine pancreas.

Tissue engineering of the whole pancreas is a challenge because of its exocrine and endocrine functions. We show a method for the dissection of an intact porcine pancreas and the process of successful decellularization by perfusion of detergents Triton X-100, sodium deoxycholate, and deoxyribonuclease.

Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

Zeitaufgelöste In vivo Messung der Neuropeptiddynamik mittels kapazitiver Immunsonde im Schweineherzen

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction can be performed using autologous free flap transfer or vascularized composite allotransplantation (VCA), such methods also have disadvantages. Issues such as donor site morbidity and tissue availability limit autologous free flap transfer, while immunosuppression is a significant limitation of VCA. Engineered tissues in reconstructive surgery using decellularization/recellularization methods represent a possible solution. Decellularized tissues are generated using methods that remove native cellular material while preserving the underlying extracellular matrix (ECM) microarchitecture. These acellular scaffolds can then be subsequently recellularized with recipient-specific cells.
This protocol details the procurement and decellularization methods used to achieve acellular scaffolds in a pig model. In addition, it also provides a description of the perfusion bioreactor design and setup. The flaps include the porcine omentum, tensor fascia lata, and the radial forearm. Decellularization is performed via ex vivo perfusion of low concentration sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent followed by DNase enzyme treatment and peracetic acid sterilization in a customized perfusion bioreactor.
Successful tissue decellularization is characterized by a white-opaque appearance of flaps macroscopically. Acellular flaps show the absence of nuclei on histological staining and a significant reduction in DNA content. This protocol can be used efficiently to generate decellularized soft tissue scaffolds with preserved ECM and vascular microarchitecture. Such scaffolds can be used in subsequent recellularization studies and have the potential for clinical translation in reconstructive surgery.

The protocol describes the surgical procurement and subsequent decellularization of vascularized porcine flaps by the perfusion of sodium dodecyl sulfate detergent through the flap vasculature in a customized perfusion bioreactor.

Beschaffung und Perfusions-Dezellularisierung von porcinen vaskularisierten Klappen in einem maßgeschneiderten Perfusionsbioreaktor

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

Bewertung der hydrodynamischen Eigenschaften in montierten Porcine Aortenklappen

An Ex Vivo Porcine Model for Hydrodynamic Testing of Experimental Aortic Valve Procedures and Novel Medical Devices

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a method for mounting a porcine aortic valve in a pulse duplicator to evaluate its hydrodynamic properties. These properties can then be evaluated before and after the procedure under investigation is performed and/or the investigative medical device is applied. Securing the inflow segment presents some difficulty owing to the lack of circumferential myocardium in the left ventricular outflow tract. This method addresses that issue by securing the inflow segment using the anterior leaflet of the mitral valve and then suturing the left ventricular free wall around the inflow fixture. The outflow segment is secured simply by inserting the fixture into an incision in the superior aspect of the aortic arch. We found that specimens had significantly different hydrodynamic properties before and after tissue fixation. This finding induced us to use fresh specimens in our testing and should be considered when using this method. In our work, we used this method to test novel intracardiac patch materials for use in the valvular position by performing an aortic valve neocuspidization procedure (Ozaki procedure) on the mounted porcine aortic valves. These valves were tested before and after the procedure to assess the change in hydrodynamic properties in comparison to the native valve. Herein, we report a platform for hydrodynamic testing of experimental aortic valve procedures that enables comparison with the native valve and between different devices and techniques used for the procedure under investigation.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von Tests kardialer Verfahren vor Beginn von Großtierstudien 

We present a method for mounting a porcine aortic valve on a pulse duplicator to test its hydrodynamic properties. This method can be used to determine the change in hydrodynamics after the application of an experimental procedure or novel medical device prior to use in a large animal model.

Ein ex vivo Schweinemodell für die hydrodynamische Erprobung experimenteller Aortenklappenverfahren und neuartiger Medizinprodukte

The options for testing new cardiac procedures and investigative medical devices prior to use in an animal model are limited. In this study, we present a ...