Die Autoren bedanken sich bei Keith Michel des MD Anderson Small Animal Imaging Facility für seine technische Unterstützung bei der Mikro-CT-Bildgebung, Edward TH Yeh, MD, für chirurgische Hilfe, und Rebecca Bartow, PhD danken, für die redaktionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil von der American Heart Association unterstützt.

1. Priming der osmotischen Pumpe <ol><li> Verwenden Sie sterile Techniken (z. B. Handschuhe, Laminarströmungshaube) bei der Herstellung der Pumpen. Entfernen Sie die Pumpe und Durchfluss Moderator aus der Verpackung. Wiegen Sie die Pumpe leer und das Gewicht aufgezeichnet (mg). </li><li> Füllen Sie die Pumpe langsam, um zu vermeiden, Luftblasen, mit einem kleinen 1cc Spritze und stumpfe Spitze 27G Füllrohr. Wenn die Lösung der oben auf der Pumpe erreicht, stoppen Füllung. </li><li> Wischen Sie die überschüssige Lösung und wiegen die Pumpe gefüllt. Für die meisten wässrigen Lösungen ist das Gewicht in mg gleich dem Volumen in ul. Der Unterschied in der leeren gegen gefüllte Gewicht sollte mehr als 90% der angegebenen mittleren Füllvolumen sein. Wenn nicht, räumen die Pumpe mit der Spritze und nachfüllen. Wenn Sie technische Schwierigkeiten haben entnehmen Sie bitte dem Abschnitt zur Fehlerbehebung der Pumpe Anweisungen an http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um den weißen Flansch von der Strömung moderat brechenoder; darauf achten, nicht zu verbiegen oder quetschen Sie das Rohr. Bringen Sie eine P50 Katheter entweder Ende des Moderators, die etwa 3-4 mm. Verwenden Sie eine Spritze, um den Katheter und die angeschlossenen Moderator füllen und lassen Sie die Spritze an dem distalen Teil des Katheters. </li><li> Legen Sie den Fluss Moderator in die Pumpe, bis der Katheter ist bündig mit der Oberfläche Pumpe. Dann entfernen Sie die Spritze aus dem distalen Ende des Katheters. Stellen Sie die Pumpe in einem sterilen 0,9% iger Kochsalzlösung oder PBS Lösung in einem 37 ° C-Inkubator für ein Minimum von 6 Stunden (vorzugsweise O / N) prime die Pumpe vor der Implantation in die Maus. Die Fördermenge der Pumpe variiert mit der Modell-Nummer (dh Modell 1002 = 0,25 ul / h für 14 Tage). </li></ol> 2. Erstellen Einseitige hinteren Gliedmaßen Ischämie in der Maus <ol><li> Anesthetize die Mäuse mit Isofluran Satz zwischen 2-4% in 100% O 2 bei einer Flussrate von 0,4 L / min und entfernen die Haare (vorzugsweise am Tag vor der Operation) auf der hinteren Gliedmaßen und Rückenbereich mit einer Wollereparaturflüssigkeitry Sahne. </li><li> Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen vor der Operation. Platzieren Sie die Maus in der Induktion Anästhesie Kammer. Verwenden Sie die gleichen Narkose Einstellungen im Abschnitt 2.1 beschrieben. </li><li> Warten Sie, bis sich die Maus nicht mehr reagiert auf äußere Reize und dann legen Sie sie in Bauchlage auf dem OP-Tisch mit einer Einbauküche Bugnase, die einen kontinuierlichen Fluss von Isofluran (1,5-2,0%) liefert. </li><li> Injizieren Sie die empfohlene Dosis des Anästhetikums (Bupivacaine; 0,25% (&lt;1 ml / kg)) an der Einstichstelle; behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol. Einen Schnitt 4-6 mm auf der Rückseite (an der Seite der Wirbelsäule, in den Schulterblättern region). Trennen Sie die subkutane Membran mit feinen Pinzette, dann drehen Sie die Maus auf der Rückenlage behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol und machen 0,8-1 cm Schnitt mit mikrochirurgischen Schere über dem Knie in Richtung der medialen Oberschenkel, nach dem Weg der Oberschenkelarterie. </li><li> Tunnel bis dieSeite des Rumpfes mit kleinen Mantel-Schlauch (6-Französisch) aus dem medialen Oberschenkel zum Einschnitt auf der Rückseite. </li><li> Platzieren Sie die Maus in der Bauchlage. Entfernen Sie die grundierte osmotische Pumpe / Katheter aus der PBS-Lösung und führen den Katheter durch die Hülle Schlauch, bis zum Oberschenkel. </li><li> Positionieren Sie die Pumpe in den Rücken und schließen Sie die hintere Schnitt mit 6-0 Prolene Nahtmaterial (behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol). Platzieren Sie die Maus wieder in die Rückenlage, zu entfernen den Mantel Schlauch, so dass der Katheter durch den Schnitt am Oberschenkel ausgesetzt. Sichern Sie das Bein mit Heftpflaster. </li><li> Trennen Sie das subkutane Fettgewebe, um die Gefäße zu offenbaren. Zur besseren Visualisierung des Gefäßsystems, verwenden Sie ein Retraktor, um den Schnitt zu öffnen. </li><li> Pierce die membranöse femoralen Hülle vorsichtig mit feiner Spitze Pinzette, um die Leitbündel zugreifen. Präparieren und trennen Sie die Arteria femoralis aus der Vena femoralis und Nerven in der Nähe der Leiste, kümmert sich nicht um zu bewirken, exübermäßigen Blutungen. </li><li> Platz zwei 8-0 Prolene benachbarten Fäden zu unterbrechen die Arteria femoralis 2-3 mm proximal der Bifurkation femoralis (der Ursprung des profunda femoris und epigastrica Arterien). </li><li> Schneiden Sie den Katheter auf die entsprechende Länge und legen Sie die Spitze auf den anterolateralen Bereich des Oberschenkels, befestigen Sie sie mit einem 6-0 Prolene Naht an der oberflächlichen Faszie gezielte Abgabe des Stoffes zu gewährleisten. Schließen Sie das Bein Schnitt mit einem 6:0-Lauf Naht. Verwalten einer endgültigen subkutane Injektion von Schmerzmittel (Buprenorphin, 0,1 mg / kg), behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol und kehren Sie die Maus auf den Käfig. Verwenden Sie eine Wärmelampe während der Wiederherstellung. </li><li> Nach einem 30-Minuten Erholungsphase, bereiten Sie die Maus für die Laser-Doppler-Bildgebung, um die Erstellung von hindlimb Ischämie bestätigen. </li><li> Überwachen Sie das Tier zweimal täglich für 5 Tage nach der Operation. Mobilität des Tieres wird beobachtet, um Schmerzen zu analysieren, Abfälle in den Käfig wird als indic dienenator des Essens. Auch während dem Monitor Zeitraum festzustellen, ob das Tier Schmerzen oder Beschwerden und geben eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0.1mg/kg) zweimal täglich. </li></ol> 3. Imaging Probenvorbereitung <ol><li> Anesthetize die Maus, wie in Abschnitt 2.1 angegeben. Übertragen Sie die Maus auf dem OP-Tisch in der Rückenlage. Spritzen 1.000 IE Heparin subkutan zu verhindern Blutgerinnung im Gefäßsystem. Während sich die Maus an den nosecone angebracht ist, einen Einschnitt groß genug, um die Brusthöhle und den unteren Bauch freizulegen. Bewegen Sie die Bauchorgane an der linken Seite des Tieres, um die infrarenalen Bauchaorta (IAA) freizulegen. Sorgfältig trennen die Aorta von der unteren cava Vene. </li><li> Ligieren des proximalen IAA zu Blutungen während der Einführung des Katheters zu reduzieren. Dann machen Sie einen kleinen Schnitt auf der IAA. Legen Sie eine 27 ½ G stumpfen Nadel (an einem P10 Katheter) in die IAA und sichern Sie es mit einem 6-0 Faden. </li><li> Füllen Sie zwei20cc Spritzen mit Heparin Kochsalzlösung und 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF). Füllen Sie eine Spritze mit einer 5cc Gegensatz radiopaken Silikonkautschukverbindung. Mischen Sie die drei Bestandteile des MV-Verbindung: MV-Verdünnungsmittel: MV-Härter arbeiten in Verhältnissen von 1:1.25:0.5. Da die Mischung (Microfil) hat nur eine Verarbeitungszeit von 20 min bevor der Agent polymerisiert, wird empfohlen, die MV-Härter bis kurz vor der Injektion fügen in das Gefäßsystem. </li><li> Machen Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof und verwalten eine Überdosis Isofluran, Sterbehilfe zu induzieren und für die Entwässerung von überschüssiger Flüssigkeit zu ermöglichen. Befestigen Sie die Kochsalzlösung gefüllte Spritze an der Nadelspitze und beginnen, die Gefäße für 5 min spülen. Achten Sie darauf, alle Blut aus der Gefäße gespült; schalten Sie die Isofluran und trennen Sie das nosecone einmal die Spülung beginnt. Anschließend befestigen Sie die Formalin-Fertigspritze mit dem Katheter zuvor dargelegten (3.2) und Druck perfuse für weitere 5 min. Schließlich perfundiert das letzte Spritze, mit dem KontrastAgenten, langsam in die Maus für 5 min. </li><li> Optional: Fotografieren Sie das Microfil im Gefäßsystem mit einer Kamera, um sicherzustellen, dass nur die arterielle Struktur durchblutet wird. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einem Behälter mit 10% NBF und lagern bei 4 ° CO / N für Kontrastmittel gefüllt Polymerisation. Nach 24 Stunden, entfernen Sie die Haut auf die untere Hälfte des Rumpfes (distal der unteren Bauchaorta Ligation) mit Dissektion Werkzeuge, aktualisieren Sie die 10% NBF, und platzieren Sie die Maus zurück in den Behälter für 4 Tage bei RT. </li><li> Sezieren die Gegenseite und ischämische Hinterbeine, und legen Sie die Proben in einer Ameisensäure-Lösung (Cal-Ex II) für 48 Stunden zu Entkalkung des Knochens zu erleichtern. Dann spülen Sie die Proben unter fließendem Wasser für 1 Stunde und Rückkehr zu 10% NBF und fahren Sie mit Faxitron (x-ray Systems verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Knochen entkalkt wird) und Mikro-CT-Bildgebung. </li></ol>

<ol>
	<li>Epstein, S. E., Fuchs, S., Zhou, Y. F., Baffour, R., Kornowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+interventions+for+enhancing+collateral+development+by+administration+of+growth+factors:+basic+principles,+early+results+and+potential+hazards.">Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic principles, early results and potential hazards.</a> Cardiovasc. Res. 49, 532-542 (2001).</li><li>Esaki, J., Marui, A., Tabata, Y., Komeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+release+systems+of+angiogenic+growth+factors+for+cardiovascular+diseases.">Controlled release systems of angiogenic growth factors for cardiovascular diseases.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 4, 635-649 (2007).</li><li>Bentley, M. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACC/AHA+Guidelines+for+the+Management+of+Patients+with+Peripheral+Arterial+Disease+(lower+extremity,+renal,+mesenteric,+and+abdominal+aortic):+a+collaborative+report+from+the+American+Associations+for+Vascular+Surgery/Society+for+Vascular+Surgery,+Society+for+Cardiovascular+Angiography+and+Interventions,+Society+for+Vascular+Medicine+and+Biology,+Society+of+Interventional+Radiology,+and+the+ACC/AHA+Task+Force+on+Practice+Guidelines+(writing+committee+to+develop+guidelines+for+the+management+of+patients+with+peripheral+arterial+disease)--summary+of+recommendations.">ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (lower extremity, renal, mesenteric, and abdominal aortic): a collaborative report from the American Associations for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (writing committee to develop guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease)--summary of recommendations.</a> J. Vasc. Interv. Radiol. 17, 1383-1397 (2006).</li><li>Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+vessels+in+mouse+models+of+disease.">Molecular imaging of vessels in mouse models of disease.</a> Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).</li><li>Losordo, D. W., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109, 2487-2491 (2004).</li><li>Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. 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Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt. Alle tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt.

Hier präsentieren wir eine Methode zur osmotischen Medikament / Substanz Lieferung in einem Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie. Darüber hinaus beschreiben wir ein Gießverfahren, bei dem wir Microfil verwendet wurden, um eine 3D-Rekonstruktion für die Analyse des vaskulären Netzwerk herzustellen. Der Grad oder die Schwere der Ischämie variiert je nachdem, wo die arterielle Ligation / Exzision ist. Wir haben eine doppelte Ligatur in der A. femoralis communis proximal der Urspr...

Periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine Krankheit, die atherosklerotischen unzureichende Blutversorgung in den Beinen 4 verursacht. Es wirkt 8-12.000.000 Amerikaner und aktuellen medizinischen Behandlungen bieten nur begrenzte Linderung 5,6. Neuartige Therapeutika, die Blutzirkulation in den Beinen verbessern würde nicht nur zurückhalten Fortschreiten der Krankheit, sondern auch die Lebensqualität verbessern. Die Inzidenz der PAD ist höher bei Personen im Alter von über 50 Jahren ist so lokale pharmakologische Therapie ein wünschenswerter Behandlungsform, weil die reduzierte Nieren-und Leberfunktion häufig bei älteren Patienten gesehen Arzneimittelstoffwechsel verringern können und erhöhen Nebenwirkungen systemischer Verabreichung. So haben wir ein Mausmodell der PAD zu prüfen, ob lokal verwaltete Mittel hindlimb Ischämie lindern durch die Förderung der Angiogenese und mikrovaskulären Umbau. Insbesondere haben wir eine katheterisierte osmotische Pumpe kontinuierlich liefern das therapeutische Mittel zurischämischen Oberschenkelmuskel von Mäusen. Mit unserem Delivery-System, waren wir in der Lage, optimale Konzentration des Medikaments in der lokalen Umgebung aufrecht zu erhalten; Dieser Ansatz ermöglicht eine entsprechende medikamentöse Bioaktivität, vermeidet mögliche systemische Nebenwirkungen, und überwindet den Nachteil der begrenzten lokalen Drogen-Zugang mit systemischer Verabreichung verbunden. Zusätzlich zu beurteilen, ob lokal verwaltete Mittel Revaskularisierung zu fördern, haben wir fortschrittliche Gießen und High-Definition-Imaging-Techniken, die die Quantifizierung von Veränderungen in der Mikrozirkulation aktivieren. Zusammengenommen ist die Kombination von Methoden in diesem Artikel verwendeten Video nützlich in präklinischen Studien, um das Verständnis pharmakologisch induzierte Revaskularisation bei pAVK-Patienten 7-9 unterstützen.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puritan sterile cotton swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-029-499</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Betadine (povidone-iodine)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-065534</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>70% Alcohol pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9926371</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>6-0 prolene suture</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>8709</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-0 prolene suture</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2775</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmotic pump</td>
			<td>ALZET</td>
			<td>1002</td>
			<td>Type: Tool, 14 day release</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vinyl catheter</td>
			<td>ALZET</td>
			<td>7760</td>
			<td>Type: Tool</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heparinized saline (0.9%)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B0944</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>5705</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microfil (silicone rubber contrast agent)</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-112</td>
			<td>Type Reagent, Microfil White</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cal-Ex II (formic acid solution)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CS511-1D</td>
			<td>Type: Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Buprenex</td>
			<td>CIII</td>
			<td>7571</td>
			<td>Type: Analgesic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bupivicaine</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>381</td>
			<td>Type: Analgesic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging</td>
			<td>Zeiss Stemi 2000-C</td>
			<td>Type:Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>Perimed Inc.</td>
			<td>Periscan PIM3 </td>
			<td>Type:Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micro-CT imaging system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Explore Locus SP </td>
			<td>Type:Equipment</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

osmotic drug delivery to ischemic hindlimbs and perfusion of vasculature with microfil for micro-computed tomography imaging

Präklinische Forschung in Tiermodellen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit spielt eine wichtige Rolle bei der Prüfung der Wirksamkeit von Therapeutika entwickelt, um die Mikrozirkulation zu stimulieren. Die Wahl der Versandart für diese Mittel ist wichtig, weil die Art der Verabreichung zutiefst beeinflusst die Bioaktivität und Wirksamkeit dieser Mittel 1,2. In diesem Artikel zeigen wir, wie man vor Ort ein Medikament verabreicht in ischämischen Hinterbeine mit einem katheterisiert osmotische Pumpe. Diese Pumpe kann ein festes Volumen der wässrigen Lösung kontinuierlich liefern für einen vorgegebenen Zeitraum. Wir präsentieren auch unsere Mausmodell der einseitigen hindlimb Ischämie durch Unterbindung der A. femoralis communis proximalen zum Ursprung des profunda femoris und epigastrica Arterien im linken Hinterbein induziert. Schließlich beschreiben wir die in vivo-Kanülen sowie Unterbindung der infrarenalen Bauchaorta und Perfusion des hindlimb Gefäßsystem mit Microfil, ein Silikon radiopaken Casting-Agenten. Microfil können perfundieren und füllen das gesamte Gefäßsystem (arterielle und venöse), und weil wir den größten Gefäßleitung für die Ausreise ligiert haben, kann der Agent in das Gefäßsystem für zukünftige ex-vivo-Bildgebung mit dem Einsatz von kleinen Mikro-CT-Probe 3 beibehalten werden .

Die Animation zeigt die osmotische Pumpe Einsetzen und hindlimb Ischämie Chirurgie im Protokoll aufgeführt. Abbildung 1 zeigt Laser-Doppler-Bilder der Perfusion der hinteren Gliedmaßen, bestätigt Ischämie. Nach vaskulären Gießen mit Microfil zeigt eine 3D-Mikro-CT-Bild des vaskulären Netzwerk, Microfil können die Gefäße effektiv zu füllen (Fig. 2A), aber das Diskontinuitäten auftreten (2B) durch verschiedene verfahrenstechnische Faktoren (zB Luftbl...

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Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Wir zeigen hier die<em&gt; In vivo</em&gt; Einsetzen einer osmotischen Pumpe für konstante local drug delivery und die Schaffung von hindlimb Ischämie in einem Maus-Modell. Darüber hinaus ist das Hinterbein Gefäßsystem mit Microfil ein Silicon röntgendichte Mittel perfundiert, um Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) vorzubereiten.

Osmotic Drug Delivery zu ischämischen Hinterbeine und Perfusion von Blutgefäßen mit Microfil für Mikro-Computertomographie

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

osmotic-drug-delivery-to-ischemic-hindlimbs-perfusion-vasculature

Research

JoVE Journal

Medicine

12.2K Aufrufe.  The Texas Heart Institute at St. Luke's Episcopal Hospital. Wir zeigen hier die In vivo Einsetzen einer osmotischen Pumpe für konstante local drug delivery und die Schaffung von hindlimb Ischämie in einem Maus-Modell. Darüber hinaus ist das Hinterbein Gefäßsystem mit Microfil ein Silicon röntgendichte Mittel perfundiert, um Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) vorzubereiten.

Serie: Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for imaging vasculature, few are able to visualize the vascular network as a whole while extending to a resolution that includes the smaller vessels1,2. Additionally, many vascular casting techniques destroy the surrounding tissue, preventing further analysis of the sample3-5. One method which circumvents these issues is micro-Computed Tomography (&mu;CT). &mu;CT imaging can scan at resolutions &lt;10 microns, is capable of producing 3D reconstructions of the vascular network, and leaves the tissue intact for subsequent analysis (e.g., histology and morphometry)6-11. However, imaging vessels by ex vivo &mu;CT methods requires that the vessels be filled with a radiopaque compound. As such, the accurate representation of vasculature produced by &mu;CT imaging is contingent upon reliable and complete filling of the vessels. In this protocol, we describe a technique for filling mouse coronary vessels in preparation for &mu;CT imaging.
Two predominate techniques exist for filling the coronary vasculature: in vivo via cannulation and retrograde perfusion of the aorta (or a branch off the aortic arch) 12-14, or ex vivo via a Langendorff perfusion system 15-17. Here we describe an in vivo aortic cannulation method which has been specifically designed to ensure filling of all vessels. We use a low viscosity radiopaque compound called Microfil which can perfuse through the smallest vessels to fill all the capillaries, as well as both the arterial and venous sides of the vascular network. Vessels are perfused with buffer using a pressurized perfusion system, and then filled with Microfil. To ensure that Microfil fills the small higher resistance vessels, we ligate the large branches emanating from the aorta, which diverts the Microfil into the coronaries. Once filling is complete, to prevent the elastic nature of cardiac tissue from squeezing Microfil out of some vessels, we ligate accessible major vascular exit points immediately after filling. Therefore, our technique is optimized for complete filling and maximum retention of the filling agent, enabling visualization of the complete coronary vascular network &#x2013; arteries, capillaries, and veins alike.

Visualization of the coronary vessels is critical to advancing our understanding of cardiovascular diseases. Here we describe a method for perfusing murine coronary vasculature with a radiopaque silicone rubber (Microfil), in preparation for micro-Computed Tomography (&mu;CT) imaging.

Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Forschung

Medizin

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Mit Micro-Computertomographie-zur Beurteilung der Tumorentwicklung und Follow-up der Reaktion auf die Behandlung in einem Maus-Modell von Lungenkrebs

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Intraluminale Drug Delivery auf die Maus arteriovenöse Fistel Endothel

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

Methode der direkten segmentale Intra-Leber-Lieferung Mit einer Rattenleber Hilar Clamp Modell

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

Gewebepräparationstechniken für die kontrastverstärkte Mikro-Computertomographie-Bildgebung von Herzmodellen großer Säugetiere mit chronischen Erkrankungen

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.