Dieses Protokoll bietet mikrostrukturelle Einblicke in strukturelle pathologische Erkrankungen auf der gesamten Organskala mittels Mikrocomputertomographie. In diesem Protokoll wird eine spezielle Gewebepräparationsmethode implementiert, um die hochauflösende Bildgebung ganzer Herzproben aus translationalen großen Säugetiermodellen beim Menschen mit selektiver Kontrastverstärkung von Strukturerkrankungen zu optimieren. Die kardiale Mikrostruktur wie die Verteilung der Fibrose und die Organisation des erregbaren Myokards liegen einem breiten Spektrum von Herzerkrankungen zugrunde und bilden die Voraussetzungen für die lebensbedrohliche Arrhythmie.
Nestor Pallares-Lupon, Postdoc und Doktorand für mein Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Bereiten Sie zunächst eine kardioplegiöse Lösung vor, die Natriumheparin enthält, und lagern Sie die Lösung bei vier Grad Celsius. Als nächstes bereiten Sie PBS / EDTA vor, indem Sie zuerst EDTA zu einem Liter destilliertem Wasser für eine Endkonzentration von 10 Millimolar hinzufügen.
Erhöhen und halten Sie dann den pH-Wert der Lösung bei 12, indem Sie Natriumhydroxid verwenden, um die EDTA aufzulösen. Sobald das EDTA vollständig gelöst ist, senken Sie den pH-Wert mit Salzsäure auf 7,4. Dann fügen Sie einen Folienbeutel PBS hinzu, um eine 0,01 molare Lösung mit einem pH-Wert von 7,4 zu erhalten.
Lagern Sie die vorbereitete Lösung bei Raumtemperatur. Bereiten Sie schließlich eine 1% ige PMA-Kontrastmittellösung vor, indem Sie 10 Gramm PMA zu einem Liter absolutem Ethanol hinzufügen. Lagern Sie die vorbereitete Lösung bei Raumtemperatur.
Bereiten Sie einen Ein-Liter-Behälter vor, der 80 Zentimeter über einer Sezierschüssel liegt, und koppeln Sie ein thermoplastisches Rohr an einen Abflussanschluss des Reservoirs. Befestigen Sie einen Drei-Wege-Wasserhahn am Entwässerungsschlauch und koppeln Sie weitere thermoplastische Schläuche an jeden freien Anschluss am Drei-Wege-Wasserhahn. Befestigen Sie Zwei-Wege-Wasserhähne an den freien Enden des Schlauches.
Als nächstes füllen Sie das Reservoir mit der kardioplegikerigen Lösung, die mit Heparin ergänzt wird. Öffnen Sie die Wasserhähne, damit die kardioplegiker-Lösung abfließen und alle Luftblasen entfernen kann. Schließen Sie dann die Zwei-Wege-Wasserhähne.
Nachdem Sie das Herz einem eingeschläferten Tier entnommen haben, legen Sie es in kalte kardioplegische Lösung, die auf Eis gelagert wird, bis es zur Dissektion bereit ist. Bereiten Sie dann die Kanüle für den linken und rechten Koronarosteo vor, indem Sie fünf Zentimeter PTFE-Schlauch schneiden und ein Ende erhitzen, indem Sie die Spitze neben eine offene Flamme legen. Sobald ein Millimeter der Spitze zu schmelzen beginnt und durchscheinend wird, drücken Sie die Spitze gegen eine harte, hitzebeständige Oberfläche, um einen Grat an der Kanülenspitze zu formen, um zu verhindern, dass die Kanüle aus den Behältern rutscht, und führen Sie dann einen Zentimeter des nicht beheizten Endes jeder Kanüle in die beiden Enden des Abflussbehälter-Entwässerungsschlauchs ein.
Als nächstes entfernen Sie die Aortenkanüle und lokalisieren Sie den linken und rechten Osteo der Koronararterien unter der kalten kardioplegischen Lösung. Trennen Sie die Aortenwurzel vorsichtig mit einer spitzen Schere vom umgebenden Gewebe oberhalb und unterhalb des Koronarosteo, um das Einfädeln einer Seidennaht ohne Gauge unter dem Koronargefäß zu ermöglichen. Öffnen Sie dann die Zwei-Wege-Wasserhähne und setzen Sie die Kanülenspitzen in die Koronararosteo ein.
Wenn sich die Kanülenspitzen ein bis zwei Zentimeter in den Osteo und über die Nahtplatzierung hinaus erstrecken, binden Sie die Kanüle ab. Als nächstes spülen Sie das Herz, während Sie die Ventrikel 15 Minuten lang sanft massieren, bis das Herz von Blut befreit ist. Schließen Sie nach dem Spülen die Zwei-Wege-Wasserhähne, trennen Sie sie vom Drei-Wege-Wasserhahn und geben Sie das Herz in einen Ein-Liter-Kunststoffbehälter mit 500 Millilitern PBS / EDTA-Lösung.
Rezirkulieren Sie die PBS/EDTA-Lösung im thermoplastischen Schlauch unter einem Abzug mit einer Peristaltikpumpe mit zwei Kanälen. Grundieren Sie den Pumpenschlauch, bis der Schlauch keine Luftblasen mehr hat. Dann lesen Sie jede Koronararterienkanüle durch Rezirkulation bei Raumtemperatur für zwei Stunden mit 80 Millilitern pro Minute.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass der Abzug betriebsbereit ist, stoppen Sie die Pumpe, lassen Sie die Lösung aus dem Behälter und ersetzen Sie sie durch 10% Formalin zur Fixierung für eine Stunde bei 80 Millilitern pro Minute. Durchstöbern Sie das Herz mit einer Reihe von zunehmenden Ethanolkonzentrationen, beginnend mit 20% Ethanol für mindestens drei Stunden. Ersetzen Sie dann das 20% Ethanol durch 30% Ethanol und perfusionieren Sie für zwei Stunden.
Setzen Sie die Perfusion fort, indem Sie die Ethanolkonzentration bei jeder Iteration mit einer minimalen Perfusion von einer Stunde bei jeder Konzentration erhöhen. Um das Herzgewebe vor der Lufttrocknung zu stärken, rezirkulieren Sie eine gleiche Mischung aus Ethanol und HMDS für 10 Minuten, gefolgt von 100% HMDS für weitere zwei Stunden. Stoppen Sie die Perfusionspumpe, trennen Sie dann die Kanüle vom Schlauch und hängen Sie das Herz an einer Aortennaht im Abzug.
Schieben Sie vorsichtig einen Reißverschlussbeutel über das Herz und schließen Sie die Beuteldichtung über der Naht, um die Exposition des Herzens gegenüber der zirkulierenden Luft zu reduzieren. Lassen Sie das Herz eine Woche lang durch Verdunstung trocknen. Entfernen Sie bei diffusionsbelasteten Kontrastmitteln den Beutel.
Waschen Sie das Herz 15% in 100% Ethanol für 15 Minuten mit Rühren, bevor Sie es 48 Stunden lang unter Vakuum in 100% Ethanol eintauchen, ergänzt mit 1% PMA, dann bedecken Sie das Herz mit einem Reißverschlussbeutel, wie zuvor gezeigt, und lassen Sie es trocknen. Montieren Sie das luftgetrocknete Herz auf einen geeigneten Probenhalter. Um jede Bewegung während der Röntgenmikro-CT-Messungen zu verhindern, verwenden Sie eine Klemme, die am Probenhalter verankert ist, und sichern Sie das Herz über die getrocknete und starre Aorta.
Montieren Sie den Probenhalter in den Mikro-CT-Scanner. Öffnen Sie als Nächstes die Software und starten Sie das Röntgen-Mikro-CT-System. Stellen Sie dann den Röntgenfilter Aluminium auf einen Millimeter ein.
Röntgenquellenspannung bis 60 Kilovolt und Strom bis 120 Mikroampere. Stellen Sie zusätzlich die Bildabmessungen auf 2.016 x 1.344 Pixel und die Pixelgröße auf 20 Mikrometer ein. Scouten Sie Röntgenübertragungsbilder entlang der Länge der Unterstützung, um das gesamte Bildfeld im Längszugang des Herzens zu bestimmen.
Verwenden Sie für das Scannen einen Rotationsschritt von 0,18 Grad, einen Rahmendurchschnitt von fünf und eine Probendrehung von 180 Grad, indem Sie die Option für eine 360-Grad-Erfassung deaktivieren. Wählen Sie den Offset-Scanmodus aus, um die gesamte Breite der Beispielunterstützung abzubilden. Verwenden Sie nach dem Scannen die Software zur tomographischen Rekonstruktion eines isotropen dreidimensionalen Bildvolumens.
Am Ende verwendet die Aufklärungssoftware eine erfassungsbezogene Artefaktkorrektur, einschließlich Strahlhärtungseffekte von 10% und Ringartefaktreduktion von acht. Als nächstes visualisieren Sie mit der Data Viewer-Software den rekonstruierten Datenstapel. Richten Sie die Probe innerhalb der Bildgrenzen digital aus, um die Proben mit der Drei-Achsen-A-Achse des Bildvolumens neu auszurichten.
Schneiden Sie schließlich das Bildvolumen in allen drei Achsen zu, um äußere Hintergrundebenen des Bildes zu entfernen und die Gesamtbildgröße maximal zu reduzieren. Röntgenübertragungsbilder von luftgetrockneten Schweineherzen zeigen wichtige anatomische Wahrzeichen, einschließlich der Ventrikelhöhlen und der Muskelwand. Tomographische Rekonstruktionen dreidimensionaler Bildvolumina zeigten eine deutliche Trennung zwischen Gewebe und Hintergrund an epikardialen und endokardialen Grenzen.
Masons trichrome Färbung zeigte eine kollagenpositive Färbung an den Epithel- und Endothelschichten paravaskulär im subepikardialen Gewebe. Die Hellfeldbeleuchtung zeigte nach der PMA-Färbung eine dunklere Färbung in kollagenen Strukturen, was die bevorzugte Akkumulation von PMA unterstützt. PMA-gefärbte fluoreszierende Bilder von ventrikulären Gewebeschnitten hatten PMA-induzierten Fluoreszenzverlust an Kollagenstellen.
Wo eine Herzprobe vor der Lufttrocknung durch Perfusion mit einem Kontrastmittel gefärbt wurde, zeigte die Bildrekonstruktion eine stark fleckige Färbung im Myokardkompartiment. Darüber hinaus zeigte kontrastarmes Gewebe eine schlechte Trennung von der Hintergrundintensität. Die Mikro-CT-Bildgebung eines Schafteils, das an einem chronischen Myokardinfarkt leidet, zeigte eine zentrale dichte fibrotische Läsion, die von einer lockeren und heterogenen Grenzzone umgeben ist.
Hier werden die größten Signalintensitäten rekonstruierter Bildvolumina an den Gewebegrenzen und Narbenregionen gezeigt. Kontrastmittel färbten das gesunde Myokard schlecht, aber der mikrostrukturelle Kontrast blieb erhalten. An der Grenzzone wurde Narbengewebe mit überlebendem Myokard durchsetzt.
Dichte Fibrose erschien transmural, aber texturiert, was auf Varianzen in der Zusammensetzung hinweist. Die transmurale linksventrikuläre Region der PMA-gefärbten Gewebepräparation zeigte eine selektive Färbung für Kollagen und keine Färbung in Regionen des überlebenden Myokards. Längere Durchblutungszeiten mit Ethanol werden empfohlen, um den vollständigen Austausch des Wassergehalts des Herzens mit Ethanol zu gewährleisten.
Wechselwirkungen zwischen HMDS und dem Wasser erzeugen Wärme, die die Probe beschädigen kann. Ein großer Vorteil dieses Verfahrens ist die Möglichkeit, die Mikro-CT-Bildgebung mittels Histologie zu validieren. Luftgetrocknete Proben können direkt in Paraffin eingebettet werden, um die Färbung zu schneiden und die Bildgebung im Mikroskop zu verbessern.
