Wir danken Bernard Foucart für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung (FRS-FNRS) und von der Königin Elisabeth Fonds für medizinische Forschung unterstützt. Agnès Villers ist Research Fellow an der belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung.

Alle tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung und mit der Zustimmung der lokalen Ethikkommission durchgeführt. 1. Herstellung künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit Die gleichen Medien verwendet wird, zu sezieren, geschnitten und perfundieren Scheiben (1 ml / min) während der Ruhezeit und der elektrophysiologischen Ableitungen. Diese Medien werden von 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4 und 10 mM D-Glucose. <ol><li> Wägen Sie die verschiedenen Komponenten für 2 L von ACSF außer MgSO 4, das bereits in Lösung (1 M). Mit einem Standard-Lösung ermöglicht es, sicher sein, die genaue Konzentration der Mg 2 +, weil MgSO 4 in Pulver ist stark hygroskopisch. Ca 2 +: Mg 2 +-Verhältnis stark beeinflusst LTP Induktion und Aufrechterhaltung14 und damit die Proportionen müssen immer beachtet werden. </li><li> Setzen Sie alle Komponenten außer CaCl 2 in einem Glas Messzylinder und bringen bis 2 L mit destilliertem H 2 O. </li><li> Kräftig rühren. Wenn alles gelöst ist, fügen carbogen durch ein Aquarium Bubbler und Schlauch an den Tank (95% O 2, 5% CO 2). Warten Sie ein paar Minuten, und fügen Calciumchlorid bei pH 7.4 wird durch die Wirkung von Bicarbonat-Puffer fixiert. </li><li> Halten Sie 600 ml in einem gekühlten rechteckigen Glasschale und abkühlen auf 4 ° C mit Eis rund um den Teller. Diese Medien werden für Hippocampus Präparation verwendet werden. </li><li> Filtern Sie die verbleibenden 1.400 ml und halten in einem Erlenmeyerkolben. </li></ol> 2. Vorbereitung der elektrophysiologischen Rig und das Gehirn Scheibe Recording Kammer Die Perfusion Schaltung von 2 Schlauchpumpen, eine Pumpen frische Flüssigkeit aus einem Reservetank und das andere Pumpen verwendet Fluid von t gemachter Aufnahme Kammer zu einer bin. Frische Fluid einem hausgemachten Perfusion System, wo es wieder mit Sauerstoff erwärmt und vor dem Erreichen der Schnittstelle Aufnahme Kammer durch die Schwerkraft (Abbildung 1A) aufgenommen. Die Schnittstelle Aufnahme Kammer wurde von FST (Fine Science Tools, Vancouver, Kanada, 1B) ausgelegt. Gewebeschnitte Gewebeeinlagen Netzfilter an einem abnehmbaren Ring und kann auch kontinuierlich unter Bedingungen Schnittstelle werden durch Höhenverstellung der Saug-und Nadel gehalten wurde. Eine hausgemachte Kunststoffrohr an seinem Ende und perforierte seitlich (0,5 mm) blockiert wird dem Saugnadel auf Pegelfestigkeit in der Kammer zu erhöhen befestigt. Die Aufnahme Kopf über einem Wasserbad mit einer Gasdispersion Stein, pflegen eine feuchte Umgebung, indem feuchte Luft durch Ablenkung Häfen in der Schreibkopf (bis wasserspreitende verringern) hilft montiert. Bath und mittlere Temperatur werden durch kontinuierliches Variieren der Höhe des Gleichstroms th gesteuertgrobe Ein Silikonkautschuk eingebettet Heizelement im Wasserbad. Thermistoren im Wasserbad und die Aufnahme Brunnen ermöglichen Temperatur in der Kammer zu setzen und werden genau überwacht an diesen Stätten. Die Heizung der Kammer wird durch ein globales Heizungsanlage Steuern der Temperatur der gesamten Anlage abgeschlossen. Die Software, die von Forschern an der University of Edinburgh (entwickelt <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) überwacht und gleicht die Temperatur der Luft Sauerstoff, das Gehirn Scheibe, die Elektroden und die restlichen rig eine stabile Umgebung für Langzeit-Aufzeichnungen (1C) . Die Temperatur für Maus Hippocampus verwendet ist 28 ° C. <ol><li> Spülen Sie alle Perfusionskreislauf mit destilliertem H 2 O für mindestens 20 min und starten Sie die Heizungsanlagen. </li><li> Starten Sie den carbogen sprudelnden in der Schaltung. Carbogen kommt in den hausgemachten Perfusion Rohre durch filter Kerzen und im Wasserbad unter der Aufnahme Kammer. Die Strömungsgeschwindigkeit im Wasserbad wird durch einen Durchflussmesser gesteuert wird. Ist der Durchfluss ist zu langsam, konnte Gewebe werden hypoxischen. Umgekehrt, wenn die Strömung zu hoch ist, kann das Gas nicht ausreichend erwärmt und befeuchtet, was zu Trocknen des Gewebes. Hohe Gasdurchflussrate könnte auch die Chance erhöhen, Wasser Sprühen über das Gewebe aus dem Wasserbad unten führt zu osmotischen Schock. Dies kann durch Hinzufügen von Bits feinmaschiges (100 um) am Ausgang der Auslenkung Anschlüsse verhindert werden. </li><li> Kreislauf entleeren und füllen Sie mit gefiltertem ACSF. </li><li> Setzen Sie den Ring, der die Scheibe in der Abstehkammer unterstützen wird. Ein gewebtes Netz Filter mit Maschenweite im Bereich von 500 bis 750 um gedehnt und an dem Ring mit zwei Teil-Harz-Komponenten-Kleber. Das gewebte Netz Filter besteht aus 87% Polyamid und 13% Elasthan (Höschen 15 den) gemacht. Kleber sorgfältig angewendet werden, um die Bildung von Reliefs an der Oberfläche des rin vermeideng. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen aus dem Kreislauf. </li><li> Stellen Sie den Pegel ACSF in der Aufnahme Kammer mit der Schraube des Saugnadel. Die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpen auf 1 ml / min für die Zulaufpumpe und 5 ml / min für die Ablaufpumpe eingestellt. </li></ol> Der Perfusionsdruck wird auf einem starren rüttelfest Tisch gelegt und von einem Faraday-Käfig. 3. Vorbereitung der Präparation Gebiet Chirurgische Instrumente: ein Skalpell mit einem # 11 Klinge, kleine Standard Präparierscheren, Feder Schere, gebogenen Pinzette, zwei Heidemann Spatel und ein Löffel. Zusätzliches Material: eine Guillotine, eine Unterlage, eine McIlwain Gewebe Chopper mit einer Rasierklinge, Filterpapier, ein Glas Pasteurpipette mit einem Gummi-Sauger, Pipetten 2 Kunststoff-Pasteur von denen einer mit einem breiten Mund, eine Petrischale, einem metallischen Zylinder 7 mm Durchmesser (2A). <ol><li&gt; In dem Sezieren Schüssel mit kaltem ACSF (hergestellt in Schritt 1) ​​gefüllt, tauchen ein gekühltes Glas Deckel aus einer Färbung Gericht, in Filterpapier gewickelt. Entfernen Sie vorsichtig Luftblasen und Sauerstoff die ACSF durch ein Aquarium Bubbler (Abbildung 2A). </li><li> Legen Sie Instrumente in der Reihenfolge der Verwendung. In drei Lagen Filterpapier auf das Gewebe Chopper Platte und einer neuen Rasierklinge mit destilliertem Wasser und Ether (2B) gereinigt. Die Rasierklinge muss waagerecht sein, wenn sie das Papier berührt. Auflagedruck auf den halben Maximalwert und Geschwindigkeit auf etwa ein Drittel des maximalen Wert eingestellt. </li><li> Aufmerksam überprüfen, ob alles bereit ist (Instrumente, Temperatur ...), weil Sie nicht haben, Zeit danach. </li><li> Bitten Sie jemanden, der Dissektion mit einer Pasteurpipette mit kaltem ACSF gefüllt sprühen. </li><li> Anesthetize die Maus mit Nembutal IP (100 mg / kg) vor Enthauptung. Halothananästhesie können ebenfalls verwendet werden. Wir haben beide Methoden verglichen und obtainiert gleichen Ergebnisse. Enthauptung muss unter Vollnarkose durchgeführt werden, aber Genickbruch können ebenfalls verwendet werden. Allerdings Genickbruch braucht eine sehr gute Übung, um das Leiden der Tiere zu vermeiden. </li><li> Präparieren Sie auf der Unterlage so schnell wie möglich unter kaltem ACSF kontinuierlichen Dusche. </li></ol> 4. Gehirn Removal <ol><li> Halten Sie immer noch den Kopf mit dem Zeigefinger und dem Daumen einer Hand auf die Schnauze, einen Einschnitt mit den Präparierscheren entlang der Mitte der Oberseite des Kopfes beginnend am Rand der Guillotine und läuft rostral zum Stirnbein . </li><li> Durchtrennen Hautmuskel auf jeder Seite des Kopfes vollständig aussetzen Schädel Platten und entfernen Sie die Muskeln an der kaudalen Seite des Kopfes. </li><li> Mit den Präparierscheren, schneiden Sie den M. temporalis auf jeder Seite, entlang der temporalis Platte, dann schneiden Sie die frontalen Platten in der Mitte, quer. Dann machen Sie einen kleinen Schnitt am Hinterhauptbein, zwischen den beiden plAtes. </li><li> Für jede Seite, am kaudalen Basis der okzipitalen Platten geschnitten. </li><li> Schneiden Sie entlang der Sagittalnaht mit Feder Schere. </li><li> Mit Pinzette, entfernen Sie die Schädel Hälften, indem sie diese voneinander entfernt. </li><li> Mit dem Skalpell geschnitten quer kurz nach dem Riechkolben und kurz bevor das Kleinhirn dann stürzen die extrahierte Gehirn in das Sezieren Schüssel mit kaltem ACSF. </li></ol> 5. Hippocampal Dissection <ol><li> Sobald das Gehirn im Sezieren Gericht eingetaucht ist, trennen die beiden Hemisphären voneinander mit einem Skalpell in der Mitte eingesetzt. </li><li> Die Präparation des Hippocampus mit Spatulae unter Sichtkontrolle durch ein Fernglas Operationsmikroskop (X25, 2A) durchgeführt. Auf der einen Hemisphäre, sorgfältig verteilt, die Strukturen, um die lateralen Ventrikel zu sehen. Entfernen Sie den Hirnstamm und Zwischenhirn. Dies wird durch die Anwendung der Spatulae auf dem frontalen Kortex auf der einen Seite und auf der Zwischenhirn auf das getananderen Seite. Achten Sie darauf, nicht zu berühren den Hippocampus mit dem Spatel und nicht strecken sie während Gewebe Schnitte. </li><li> Trenne die Fornix dann vorsichtig den Hippocampus aus dem Kortex (wegrollen), indem Sie einen Spachtel in die Herzkammer. </li><li> Wenn der Hippocampus extrahiert wird, entfernen überschüssiges Gewebe und Kortex verbleibenden Blutgefäße. </li></ol> 6. Schneiden der Scheiben <ol><li> Mit einem breiten Mund Kunststoff Pasteurpipette übertragen den Hippocampus in einem Löffel mit seinen alvear Oberfläche nach oben (konvexe Seite). </li><li> Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette. </li><li> Tipp den Löffel senkrecht fast berühren das Filterpapier des Choppers (2B) und Drop-off den Hippocampus vom Löffel, durch schnelles Berühren des Filterpapier bewegen Sie dann wieder den Löffel. </li><li> Richten Sie den Hippocampus und schneiden Sie es quer bis 400 um mit dem Chopper (siehe Abbildung 2C für Ausrichtung des HippocampusEiter gegenüber der Rasierklinge). Gesetz so schnell wie möglich. </li><li> Entfernen Sie das Filterpapier mit den in Scheiben geschnittenen Hippocampus und wickeln Sie es um den Metallzylinder zu verbreiten die Scheiben ein wenig. Dann geben sie die Scheiben mit Sprays von ACSF mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette und sammeln sie in einer Petrischale mit kaltem ACSF gefüllt. </li></ol> 7. Inkubation von Slices im Interface <ol><li> Wählen Scheiben mit einem Standard-Kunststoff-Pasteurpipette und schnell legen Sie sie in der Aufnahme Kammer. Scheiben von der Dissektion Trauma direkt in der Aufnahme Kammer erholen, in der Schnittstelle bei 28 ° C </li><li> Die Scheibe wird höchstwahrscheinlich Waschbecken. Senken Sie den Füllstand, die Slice-Level zu erreichen, und dann heben Sie es, um es zu schweben. </li><li> Drehen Sie die Scheibe in der richtigen Position, während das Absenken. Slices sind immer in der gleichen Weise, um die Positionierung der Elektroden (2 anregenden und eine Aufnahme-Elektroden) in der CA1-Region zu erleichtern orientiert. </li><li> Stoppen Sie, wenndie Flüssigkeit ist in-Schnittstelle. A &quot;Meniskus&quot; der Medien auf der Scheibe ist, das einen ausreichenden Grad von Medien. Die Netto-Filter muss mit Medien gesättigt, aber nicht vollständig untergetaucht. </li><li> Halten Sie die Kammer mit Filterpapier über den perforierten Deckel platziert abgedeckt. </li><li> Lassen Sie die Scheibe Rest für mindestens 1,5 h bei 28 ° C. </li></ol> 8. Aufnahme der synaptischen Antworten <ol><li> Aufnahme-Elektrode: Glaskapillaren gezogen werden, um eine Spitze von 2-5 MOhm Widerstand zu erhalten, wenn sie mit ACSF gefüllt. Ein kleines Stück Filterpapier wird auf der Spitze der Elektrode angeordnet und Knochenwachs wird an dem Ende, um Kondensation zu verringern aufgebracht. Stimulierenden Elektroden: Platin-Iridium-Cluster bipolaren Elektroden mit einer 12,5 Mikrometer Durchmesser von FHC (USA) erworben. Mit der richtigen Pflege kann jede Elektrode mindestens 30 mal (Abbildung 1B) verwendet werden. </li><li> Positionieren Sie die Elektroden in das Stratum radiatum der CA1-Region, gesäumt alle Elektrodenbis (3A). Elektroden 75 bis 150 um unter der Oberfläche der Scheibe mit Narishige Mikromanipulatoren abgesenkt. Die beiden stimulierenden Elektroden gesetzt werden, um zwei unterschiedliche Bündel von Schaffer Kollateralen stimulieren. Wenn die Elektroden auf die Scheibe abgesenkt werden Filterpapier sorgfältig rundum, um die Kammer zu schließen platziert. </li><li> Zweiphasige Stimulation (0,08 ms Pulsdauer pro Halbwelle) wird bei konstanter Spannung mit einem Grass-Stimulator verbunden SIU-V Isolierung Einheiten durchgeführt. Maximal Reaktion durch Erhöhung Reizstärke von 2 V bis maximal 12 V Feld EPSPs 1000 mal mit einer WPI ISO-Verstärker 80 verstärkt und gefiltert bei 10 Hz und 10 kHz überprüft. Das Signal wird dann an einen PC durch ein National Instrument A / D-Wandler gesendet. Stimulation, Datenerfassung und Analyse werden unter Verwendung des WinLTP Programm ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). Feld EPSPs bei 40% der maximalen Amplitude erhalten in einem Eingangs-out aufgezeichnetKurve setzen. Für jede Scheibe, werden die fEPSP Pisten gegen die mittlere Steigung über die 30 min vor LTP Induktion normalisiert. </li><li> LTP durch Anlegen einer einzigen Folge von Stimulationsimpulsen (100 Hz) auf Prüfkraft auf einen Weg, während die zweite Bahn dient als Kontrolle ausgelöst. </li></ol> 9. Reinigung des Setup <ol><li> Spülen all die Schaltung mit einer 3% igen Lösung von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) für mindestens 10 min, dann abtropfen. Die Schaltung wird sorgfältig mit destilliertem Wasser werden vor Beginn eines jeden Versuchs gespült. Die Verwendung von H 2 O 2 ist nicht zwingend erforderlich, da andere Labore nur destilliertes Wasser verwenden für die Reinigung, aber wir haben die Ablagerung von dunklen Rückstände im Schlauchsystem bemerkt, wenn nur mit Wasser. </li><li> Ersetzen Wasser im Wasserbad unter der Aufnahme Kammer. </li><li> Bath die stimulierenden Elektroden Tipps in Alkohol für 5 min. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben in unserem Labor ein Protokoll aus der Kombination von Methoden entwickelt und eingesetzt von anderen Laboratorien mit einem großen Know-how in LTP Aufnahmen 11,17 entwickelt. Dieses Protokoll wird zur adulten Maus Hippocampus angepasst und kann bei Tieren jeden Alters und jeder Genotyp Hintergrund verwendet werden. Es ermöglicht auch die Analyse von LTP in transgenen Mäusen Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit 18,19. Die Verw...

Heutzutage gibt es nur begrenzte Verständnis davon, wie komplex Erinnerungen gespeichert und abgerufen am neuronalen Schaltkreis-Niveau. Allerdings ist eine einheitliche Hypothese von Speicher verfügbar und breit akzeptiert: Erinnerungen werden als Änderungen in der Stärke der synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen im zentralen Nervensystem gespeichert. Auf seiner eigenen, hat die Forschung auf die synaptische Plastizität im Wesentlichen aus zwei bahnbrechende Entdeckungen profitiert. (1) In ein bahnbrechendes Experiment, Bliss und Lomo 1, mit dem intakten narkotisierten Kaninchen, festgestellt, dass die Lieferung von einer kurzen Hochfrequenz-(1 sec, 100 Hz) Stimulation des perforant Pfad des Hippocampus eine dauerhafte (mehrere verursacht Stunden) erhöhen in den zugehörigen synaptischen Verbindungen. Dieses faszinierende Phänomen wurde &quot;Langzeit-Potenzierung&quot; oder LTP von Douglas und Goddard als in 1975 2. (2) später, wurde festgestellt, dass ein ähnliches Phänomen in Gehirnscheiben ausgelöst werden konnte (0,4 mm) künstlich aufrechterhalten in vitro lebendig </em&gt;. Die am häufigsten untersuchten LTP wurde in vitro durch die Bereitstellung einer oder mehrerer tetani, um ein Bündel von Axonen (die sogenannten Schaffer-Kollateralen) bei der Aufnahme das resultierende Feld erregenden synaptischen Potential in den Pyramidenzellen der sogenannten CA1-Region hervorgerufen beobachtet. Die Mechanismen der LTP Induktion weitgehend aufgedeckt worden. Grundsätzlich aktiviert ein Ca 2 +-Einstrom durch den NMDA-Rezeptoren Enzyme mit zwei Folgen: eine Phosphorylierung von AMPA-Rezeptoren (die steigert so deren Effizienz) und eine Aufnahme von zusätzlichen AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran 3. Im Gegensatz dazu sind die Mechanismen der Erhaltungsphase der LTP weitgehend unbekannt, vor allem weil es experimentell sehr viel schwieriger, eine Scheibe gesund für viele Stunden als für 30 bis 60 min zu halten ist. Viele Studien haben zum Verständnis der Mechanismen LTP und interessante Theorien gewidmet haben über die Jahre 4-11 ausgearbeitet. Aber unbis jetzt, haben die genauen molekularen Mechanismen der stabilen Anstieg der synaptischen Stärke nicht geklärt. Dies kann zum Teil auf die Schwierigkeit mit vorherigen Messungen in verschiedenen Laboratorien mit verschiedenen Techniken zur Herstellung reproduzieren und die Aufrechterhaltung des Hippocampus. In ihrer Methodik Papier betonte Sajikumar et al. 12 die Bedeutung von experimentellen Bedingungen für die Herstellung von Ratte Hippocampus und der Aufnahme stabil LTP. In diesem Video stellen wir Ihnen alle Optimierungsschritte in unserem Labor im Laufe der Jahre entwickelt, um der Lage sein, eine sehr stabile LTP in Maus Hippocampus aufzeichnen. Diese Optimierung wurde von Protokollen entwickelt und erfolgreich eingesetzt von anderen Laboratorien, die LTP-Mechanismen Studie an Mäusen und Ratten 13 11 vorgenommen. Es ermöglicht erfahrenen Forscher zu induzieren und aufzeichnen eine sehr lang anhaltende LTP in erwachsenen Mäusen mit einer hohen Erfolgsquote. Die physiological Grundlage der induzierten LTP wurde sorgfältig geprüft und nachgewiesen 14. In dieser Methodik Papier zeigen wir, dass alle Änderungen der experimentellen Bedingungen, wie Temperatur oder Sauerstoffsättigung kann eine tief greifende Auswirkungen auf die LTP Wartung haben während der Dissektion Verfahren stark verändern können Scheiben Erregbarkeit. Es muss auch betont werden, dass die präzise Steuerung all dieser Parameter eine Ausbildung von mehreren Monaten für unerfahrene Studenten benötigt werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

Langzeitpotenzierung (LTP) ist eine Art der synaptischen Plastizität durch eine Erhöhung der synaptischen Stärke aus und vermutlich in Gedächtniscodierung einbezogen werden. LTP ausgelöst in der CA1-Region des akuten Schnitten des Hippocampus ist eingehend untersucht worden. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Erhaltungsphase für dieses Phänomen sind noch weitgehend unverstanden. Dies könnte teilweise auf den verschiedenen experimentellen Bedingungen durch verschiedene Laboratorien. Tatsächlich ist der Erhaltungsphase der LTP stark von äußeren Parametern wie Sauerstoffversorgung, Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Es hängt auch von internen Parametern wie Orientierung der Schnittebene und Scheibe Lebensfähigkeit nach der Sektion. Die Optimierung all dieser Parameter ermöglicht die Induktion einer sehr reproduzierbar und sehr stabile Langzeit-Potenzierung. Diese Methode bietet die Möglichkeit, weiter zu erforschen die molekularen Mechanismen in der stabilen Anstieg beteiligtder synaptischen Stärke in Hippocampus. Es unterstreicht auch die Bedeutung der experimentellen Bedingungen in in vitro Untersuchung der neurophysiologischen Phänomene.

Diese Methode wurde verwendet, um die Eigenschaften von langlebigen Langzeit-Potenzierung im Hippocampus von akuten Erwachsenen C57BL/6J-Mäusen (JANVIER SAS, Frankreich) 14 induziert analysieren. Überraschenderweise hat die Verbesserung der experimentellen Bedingungen zu einer neuen Sichtweise auf LTP geführt. Wir zeigten, dass lang anhaltende Erhöhung der synaptischen Stärke nicht verlangen, die Synthese neuer Proteine. Hier zeigen wir, dass LTP Induktion auf Scheiben Lebens...

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Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Dieser Beitrag stellt eine komplette Methode für die Vorbereitung und die Erhaltung<em&gt; In vitro</em&gt; Akuten Schnitten des Hippocampus von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufnahme von sehr stabilen langlebigen Langzeit-Potenzierung (LTP) für mehr als 8 Stunden mit einer Erfolgsquote von 95%.

Verbesserte Zubereitung und Konservierung von Hippocampus Maus Slices für eine sehr stabile und reproduzierbare Erfassung der Langzeit-Potenzierung

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K Aufrufe.  University of Mons. Dieser Beitrag stellt eine komplette Methode für die Vorbereitung und die Erhaltung In vitro Akuten Schnitten des Hippocampus von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufnahme von sehr stabilen langlebigen Langzeit-Potenzierung (LTP) für mehr als 8 Stunden mit einer Erfolgsquote von 95%.

Serie: Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Die Erstellung eines Awake Mausklick für Aufnahme neuronalen Antworten und Einspeisen von Tracer

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ein vereinfachtes Verfahren für Ultra-Low Density, Long-Term Primäre Hippocampus Kultur

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...