Unterstützt durch NSF 0920060, NIH DC004395, NHMRC Zuschuss 1009482, NSW Office of Science and Medical Research, und dem Passe Garnett und Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Kopfstützenantrieb Überblick <ol><li> Um einen speziell angefertigten Kopf-post montieren, legen Sie eine 1/16 &quot;Edelstahl-Roll-Stift senkrecht in einem Loch in einer 3/32 gebohrt&quot; Stab aus rostfreiem Stahl, um ein Kreuz bilden. Die vertikale Teil des Kopf-Beitrag sollte etwa 20 mm und die horizontale Quersteg etwa 15 mm betragen. Tippen einem Ende der vertikalen Stange, um eine # 1-72 Schraube. (Abb. 1). </li><li> Während der Operation und der Aufnahme wird die Kopf-Beitrag in einer speziell angefertigten Messing oder Aluminium Montage Bar mit # 1-72 Schraube (Abb. 2) gesichert. Das lange Stück der Montageschiene sollte etwa 90 mm lang und 5-10 mm breit. Der Kopf-Beitrag passt in einer Nut in eine 15 mm breite von der langen Stange, die bei 45 ° abgewinkelt ist. Um Drehung des Kopfes, der Steg der Kopf-Beitrag eingebettet in einer kleinen Rille auf der Unterseite des Befestigungsstabes verhindern. </li><li> Der Befestigungsstab in dann in eine maßgeschneiderte Aluminium-Halterung befestigt block (Abb. 3). Der Befestigungsblock von etwa 30 mm x 30 mm x 25 mm. Diese Montageblock mit einem Mikromanipulator angebracht, so dass die Position des Kopfes-Beitrag genau entlang der Mittellinie und Bregma abgegeben werden. Der Befestigungsblock aus zwei Teilen mit Schrauben befestigt hat. Ein Ausschnitt in dem Block ermöglicht die Montage bar zu rutschen in und mit den Schrauben befestigt werden. Der Befestigungsstab parallel zu der Tischoberfläche. Während der Aufnahme sichern die Bar in einem benutzerdefinierten stereotaktischen Rahmen (Abb. 4). Die stereotax ausgebildet ist, um die Stange in der gleichen Position wie in dem Befestigungsblock während der Operation zu montieren. Diese Anordnung gewährleistet, dass die Maus immer wird dem stereotaktischen Rahmen in experimentellen Sitzungen ausgerichtet werden. </li><li> Schneiden Sie ein Wolfram-Stab (Durchmesser 0,010 &quot;) bis ca. 5 mm Länge, mit ca. 1 mm bei 45 ° gebogen. Dieser Stab dient als Masse-Pin (Abb. 1). </li></ol> 2. Stereotaktische Alignment für Kraniotomie Hinweis: Alle nachstehend beschriebenen Verfahren folgen der üblichen aseptischen chirurgischen Techniken und wurden von der Washington State University Animal Care und Use Committee und der Animal Ethikkommission der Garvan Institut genehmigt worden. <ol><li> Anesthetize der Maus, indem in einer Ansaugkammer mit 5% Isofluran. Das Fehlen einer Reaktion auf Schwanz und / oder Zehen Pinch stellt sicher, dass das Tier betäubt vollständig ist. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen Nagetier mit einem Maus-Adapter (Stölting) ausgestattet. Zur Ausrichtung der Maus richtig, legen Sie die Zähne in das Loch des Bisses Bar und ziehen Sie die Nase Klemme, sodass es eng wird. Platzieren Sie die Maus so gerade wie möglich in der Beißwulst und Nase Klemme. Platzieren Sie eine Maske aus einem Stück Latex-Handschuh über der Maus die Nase gemacht, und halten Sie die Isofluran bei 5% bis die Maus die Atemfrequenz liegt bei ca. 1 Atemzug / sec. Drehen Sie das Isofluran auf 1,5 bis 2,0%. Sichern Sie den Kopf mit tEr Ohr-Bars dabei darauf achten, nicht durchlöchern das Trommelfell. Bars müssen eng anliegen, aber nicht zu tiefes Eindringen in die Gehörgänge. </li><li> Setzen Sie ein Heizkissen der Unterseite der Maus. </li><li> Bewerben Augensalbe, um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Rasieren Sie die Kopfhaut aus zwischen den Ohren bis zu den Augen mit einem kleinen Rasierapparat oder feinen Schere-Punkt. </li><li> Reinigen und desinfizieren Sie die Kopfhaut durch Abwischen mit Chlorhexidin (oder Betadin) Peeling durch Alkohol abspülen 3 mal wiederholt. </li><li> Um die Haut über der Oberseite des Schädels entfernt einen Einschnitt entlang der Mittellinie von der Rückseite des Kopfes auf die Augen. </li><li> Kratzen Sie die Knochenhaut zu den Kanten des Einschnitts mit dem Skalpell. Bei Bedarf (je nach experimentellen Ziel), vorsichtig einfahren, die Muskulatur an der Rückseite des Halses mit einer Pinzette, wodurch die Muskeln entlang Faszikel reißen, um Blutungen zu minimieren. Bewerben Gelschaum unter Kopfhaut Gewebe, um Feuchtigkeit zu minimieren und zu verhindern, die Haut vor dem Überfahren des Schädels. </li><li> Trocknen Sie die Oberfläche mit einem Schädel Wattestäbchen mit Isopropylalkohol befeuchtet, um die Visualisierung von Landmarken Schädel zu verbessern. </li><li> Richten Sie den Schädel, um Standard-stereotaktischen Koordinaten 13. Legen Sie eine feine-Punkt-Sonde in den Elektrodenhalter und befestigen Sie es am stereotaktischen Mikromanipulator. Eine geschärfte Metallstab eignet sich gut für diesen Zweck (Abb. 5). </li><li> Verwenden Sie den Punkt zu Bregma (5A) und Lambda (5B) auf dem Schädel zu identifizieren. Bewegen Sie die Sonde zurück und Her zwischen diesen Punkten, die Überprüfung, dass die lateral-medial-Koordinate für jeden Ort um nicht mehr als 50 um unterscheidet. Positionieren Sie den Kopf, als durch vorsichtiges Lösen der Ohr-Bars, Verschieben des Kopfes und Ohres-Bars seitlich und Nachziehen der Ohr-Bars benötigt. </li><li> Überprüfen, ob der dorso-ventralen Höhe an jeder Stelle um nicht mehr als 50 um unterscheidet. Stellen Sie die Höhe der Nase-Clamp wird, welche den Schädel um die Achse der Ohr-Bars zu drehen,, um die Tonhöhe des Schädels, wenn notwendig, zu nivellieren. Die Höhe des Ohr-Bar könnte auch angepasst werden müssen. </li><li> Verwendung eines Atlas 13, um die Koordinaten des Zieles von Interesse (5C) relativ zu Bregma identifizieren. Markieren Sie den Schädel über dem Ziel (zB ein &quot;X&quot; oder verwenden Tusche auf Punkt vier Ecken eines Quadrats), wo eine Kraniotomie gemacht wird (5D) werden. </li></ol> 3. Head-Post und Ground Pin-Installation <ol><li> Verwenden Sie Etch Gel auf Schädel zu reinigen. Verwenden Sie den Applikator zu schrubben und zu verbreiten Etch Gel über die Oberfläche (10 Sek.). Mit Wasser abwaschen und vollständig trocknen. Die Grundierung für Zahnzement an der Kopfoberfläche mittels Applikator. Kleberbett mit neuen Applikator. Den Klebstoff mit einem UV-Licht-gun (1 Zyklus). </li><li> Wählen Sie einen Speicherort für die Erdung, die distal der Ziel-Site ist. Vorsichtig trug ein kleines Loch in den Schädel mit der Spitze eines # 65 Miniblade Skalpell gerade breit genug für das kurze Ende der Erde S.zu betreten und in Ruhe auf den Hirnhäuten. Der Erdungsstift sollte so ausgerichtet sein, dass es verweist weg von Bregma und die Zukunft Kopf-Beitrag (6A). </li><li> Sichern Sie die Kopf-Beitrag an die Montageschiene und zu blockieren und heften sich an dem Mikromanipulator. Durch Bewegen der Mikromanipulator in drei Dimensionen, positionieren Sie den Kopf-Beitrag über Bregma, gerade berührt den Schädel (Abb. 6B). Die Basis des Kopf-Beitrag sollte liegen auf dem Schädel flach. </li><li> Mit Dissektion Sonden, eine kleine Menge von Zahnzement um den Kopf-post-und Masse-Pin (6C). Drücken Sie die Zement nach unten um einen guten Kontakt mit dem Schädel zu gewährleisten. Hinweis: Verwenden Sie nicht zu viel Zement oder es wird nicht gleichmäßig hart werden. Cure den Zement mit einem UV-Licht-gun (3-4 Zyklen aus verschiedenen Blickwinkeln). </li><li> Tragen Sie die zweite Stufe der Zement-und Aufbau der Basis um den Kopf-post-und bedecken Sie die Rillen des Kopf-Beitrag (6D). </li></ol> 4. Kraniotomie <ol><li> Suchen Sie nach der Kraniotomie Referenzmarke, die teilweise durch den Primer wird verdeckt werden. Verwenden Sie ein Skalpell Nr. 65 zu einem 3 mm x 3 mm zu kennzeichnen Platz um diese Stelle herum und einen Tropfen Lidocain, um die Empfindlichkeit zu reduzieren und die Blutungen zu minimieren. </li><li> Machen Sie mehrere Noten auf jeder Seite des Platzes (so viele wie 10), man aufpassen, nicht durch den Knochen und in das Gehirn geschnitten (Abb. 7A). </li><li> Sobald der Knochendeckel wird locker mit der Spitze des Skalpells, um es zu hebeln und hinterlässt die Dura mater intakt (Abb. 7B). </li><li> Deckel mit Knochenwachs. </li></ol> 5. Post-Chirurgie <ol><li> Schalten Sie Gas Anästhesie und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. </li><li> Verwenden Sie ein Wattestäbchen zu Lidocain Salbe um ausgesetzte Haut gelten für Aufsehen rund um Wunde betäuben. Verwenden Sie ein weiteres Wattestäbchen anwenden Neosporin auf die unbedeckte Haut. Inject Ketoprofen (5 mg / kg IM oder IP auf Bevorzugung einzelner IACUC Tierärzte basierend) alsein Post-Operation Schmerzmittel. Maus wird im allgemeinen nach oben und bewegt nur wenige Minuten von Gas Aufhören. </li><li> Bewegen Sie die Maus an einem warmen Käfig und Monitor, bis es bereit ist, für Tierhaltungen zurückzukehren. </li><li> Das Tier sollte auf mindestens einmal geprüft werden pro Tag, nachdem sie von der Operation erholt hat. Achten Sie auf Anzeichen von schlechter Ernährung und / oder Trink-und lustlos Verhalten. Sollten die Schmerzen vermutet wird, bieten Ketoprofen alle 24 Stunden (gleiche Dosis wie am Ende der postoperativen) bis gemildert. Lidocain kann lokal auf die Wunde, wenn das Tier kratzt angewendet werden oder zeigt Anzeichen von Unwohlsein. Tiere in der Regel von der Operation ohne Komplikationen oder Schmerzen zu erholen. </li></ol> 6. Aufnahme-und Dye Injection <ol><li> Warten Sie mindestens einen Tag nach der Haupt-post-Chirurgie, bevor Sie die Maus für die Aufnahmen. </li><li> Bewegen Sie die Maus in einem Schaum-Haltevorrichtung auf die Maus den Körper geformt. Die Maus hat bereits an diesem Gerät angepasst worden, wodurch seine Angst. Typische Anpassung istum die Maus zu verarbeiten jeden Tag nach dem Absetzen und für etwa eine Woche vor der Operation und Experimente, platzieren Sie die Maus in die Schaum-Gerät für 1-5 Minuten. Suspend-Gerät in der stereotaktischen Rahmen (Abb. 4). </li><li> Sichere Kopf-Beitrag zu Einbau-Bar, die nun auf den stereotaktischen Rahmen (Abb. 4) befestigt ist. </li><li> Verbinden Sie mit dem Erdungsstift mit einem Draht mit einem stumpfen 22-Gauge-Injektionsnadel Spitze abgebrochen. </li><li> Entfernen Sie Knochenwachs über die Kraniotomie. Entfernen Sie ggf. Dura mit der Spitze eines Miniblade Skalpell. </li><li> Ansteuerelektrode, um eine ordnungsgemäße stereotaktischen Ort und starten Sie die Aufnahme (Abb. 8). Für nur elektrophysiologischen Ableitungen, kann eine Vielzahl von Elektroden verwendet werden. Die Wahl der Elektrode ist abhängig von der Lage und Art der Aufnahmen erforderlich. Die Wahl der Elektrode für die wach-Maus-Aufnahmen wird das gleiche wie das, was ein Forscher nutzt in einer narkotisierten Maus sein. Bei kombinierten elektrophysiologischen Ableitungen mitFarbstoff / Tracer Injektionen, wird eine Mikropipette Elektrode 10 verwendet. Die Pipette wird mit dem Farbstoff / Tracer der Wahl, so dass es iontophoretisch kann am Ende der elektrophysiologischen Experimenten injiziert werden gefüllt. Mehrgehäusigen Elektroden können auch verwendet werden, so dass die pharmakologische Manipulationen vorgenommen werden können. Die mehrgehäusigen Elektrode auf einer einzigen Aufnahme Mikropipette (8) angebracht ist. Diese Techniken sind Standard in der Literatur und unterscheiden sich nicht für narkotisierten gegen wach-Aufnahmen. </li><li> Die Aufnahmen können für 4-5 Stunden über 3-4 aufeinander folgenden Tagen durchgeführt werden. </li><li> Am Ende der Aufzeichnung, kann der Farbstoff / Tracer werden. Da es keine Schmerzen Rezeptoren im Gehirn sind, ist die iontophoretische mit dem Farbstoff oder Tracer in das Gehirn wahrscheinlich Unbehagen zu verursachen. Sobald jedoch die elektrophysiologische Reaktion Eigenschaften des Bereichs, wo die Injektion vorgenommen werden soll dadurch gekennzeichnet sind, kann das Tier mit Isofluran foder die Injektion. Dadurch würden die mögliche unerwünschte Empfindungen. Da der Farbstoff / Tracer ist bereits in der Mikropipette, können die aktiven und Masseleitungen der elektrophysiologischen Aufnahme eingeschaltet sein Aufbau an den Stromgenerator zur iontophoretischen injizieren Farbstoff / Tracer. Verwenden Sie geeignete Protokoll für die Farbstoff / Tracer in der Elektrode. Entfernen Sie das Tier aus der headpost Zurückhaltung und Körper Zurückhaltung und Rückkehr zu seinen eigenen Käfig. </li><li> Am Ende des Experiments, folgen entsprechende Protokoll für Euthanasie und Tissue verarbeitende an der Injektionsstelle und Kennzeichnung zu erholen. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Erfolgreiche Installation des Kopf-Beitrag kann der Experimentator zu Einzel-und Mehrfach-Antworten von einem nicht narkotisierten, wach Maus aufzeichnen über mehrere Tage. Das Rückhaltesystem ermöglicht einen stabilen elektrophysiologischen Ableitungen einzelner Nervenzellen im Gehirn. Hervorragende Isolierung einzelner Einheiten und starke Reaktionen to Stimuli können aus dem gleichen Gehirnstruktur über mehrere Tage aufgezeichnet werden, zum Beispiel bei der Maus Colliculus inferior (9A, Tag, 9B, zweiten Tag). Mit einem guten Kopf-post-Installation wird jede Maus konsequent an den stereotaktischen Apparat und der Maus stereotaktischen Atlas, 13 führen zu zuverlässigen Lokalisierung von bestimmten Hirn-Kerne ausgerichtet werden. Dies ermöglicht zuverlässige Lokalisierung für die Injektion von Farbstoffen und Tracer in spezifischen Strukturen nach dem Multiple Recording Tage. Zum Beispiel, zu beurteilen, absteigend Projektionen aus dem auditorischen Mittelhirn der auditorischen Hirnstamm, biotinylierte Dextran Amin (visualisiert mit Diaminobenzidin als Chromogen) können in der Maus Colliculus inferior (Abb. 10A) nach elektrophysiologisch Identifizierung neuronale Antwort Eigenschaften an der Injektionsstelle injiziert werden (in Fig.. 10A ist ein Neuron mit einer besten Frequenz von 51 kHz aufgenommen), und nach Gewebebearbeitung, einnterograde Kennzeichnung in der kontralateralen dorsalen Nucleus cochlearis kann visualisiert und aufgezeichnet wurde (Abb. 10B). Mikrophotographien einer höheren Auflösung kann auch erhalten werden, um anterograd markierten Axone und Anschlüsse (10C) ansehen zu können. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Abbildung 1. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Abbildung 2. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Abbildung 3. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Abbildung 4. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Abbildung 5. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <sTrong&gt; Abbildung 6. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Abbildung 7. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> 8. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Abbildung 9. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Abbildung 10.

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	<li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state.">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat.">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li><li>Populin, L. 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E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat.">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li><li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA/CaJ+mouse.">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li><li>Felix, R. A., Portfors, C. 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Wir haben nichts zu offenbaren.

Der Vorteil des Kopf-post-Rückhaltesystem für elektrophysiologische und neuroanatomische Experimente in der Maus ist, dass Experimente mit nicht narkotisierten, wach Mäusen durchgeführt werden kann, sodass potenzielle Reaktion Kontamination durch Anästhetika. Darüber hinaus kann der Aufbau über mehrere Tage verwendet werden, um eine effizientere Nutzung von Tieren zu ermöglichen. Die meisten Komponenten für den Kopf-Beitrag zur Verfügung off-the-shelf. Nur der Kopf-post-und Vorrich...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Etch Gel zur Reinigung Schädel vor dem Zahnzement </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk mit 1,2-ml-Spritzen </td></tr><tr><td> Primer für Dentalzement </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25881 </td><td> 8 ml Flasche </td></tr><tr><td> Kleber für Zahnzement </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25882 </td><td> 8 ml Flasche </td></tr><tr><td> Applikatoren für Zahnzement </td><td> Kerr Optibond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Dentalzement </td><td> Charisma, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> 4gm Spritze Refill </td></tr><tr><td> Wolframstab (Ground Pin) </td><td> AM-Systeme </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0,010 &quot;Durchmesser </td></tr><tr><td> Economy UV-Härtung Licht </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Head-Beitrag </td><td> Erbaut im eigenen Haus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montageschiene </td><td> Erbaut im eigenen Haus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montageblock </td><td> Erbaut im eigenen Haus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stereotaktischen Rahmen </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Maus und Ratte Neonatale Adapter </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaPhase Isotherme Pad </td><td> Braintree Scientific, Inc. </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers

Es ist bekannt, dass die Narkose Nervenreaktion Eigenschaften verändert in verschiedenen Regionen des Gehirns. 13. Im auditorischen System werden grundlegende Eigenschaften der Reaktion Neuronen des Hirnstamms einschließlich Schwelle, Frequenz Spezifität und inhibitorischen Seitenbänder in signifikanter Weise unter Narkose 2.1 verändert. Diese Beobachtungen veranlassten Physiologen an Möglichkeiten, von einzelnen Neuronen, ohne dass die Kontamination Auswirkungen der Narkose aufnehmen zu suchen. Ein Ergebnis war ein decerebrate Herstellung, wobei der Hirnstamm vollständig auf der Ebene der Mittelhirn 4 wurde durchtrennt. Die Nachteile dieser Vorbereitung sind eine gewaltige Operation, die Beseitigung der absteigenden Projektionen aus dem Vorderhirn, und die Unfähigkeit, sensorische Stimulation zu verwenden, um Strukturen oberhalb des Mittelhirns zu untersuchen. Eine andere Strategie bestand darin, Elektroden-Arrays chronisch implantieren, um aus einzelnen Neuronen und Mehrfach-Cluster aufnehmen, während das Tier wach ist und / oder verhalten 5,6 </sup&gt;. Diese Techniken sind jedoch nicht kompatibel mit Tracer-Injektion von Farbstoffen nach dem ersten elektrophysiologisch Charakterisierung einer Hirnstruktur. Um zu vermeiden, zu verändern neuronale Antwort Eigenschaften mit Anästhetika während der Aufzeichnung von elektrophysiologischen Reaktion Eigenschaften einzelner Neurone, haben wir eine Kopfstütze Technik lange in Fledermäuse 09.07 bis 12.10 Maus verwendet werden, angepasst. Mit dieser Methode können wir elektrophysiologische Ableitungen über mehrere Tage in der nicht narkotisierten Maus befragen. Am Ende der Aufnahme-Sessions, können wir dann einen Farbstoff zu injizieren Elektrodenpositionen und Aufzeichnung Seiten zu rekonstruieren oder ein Tracer injiziert, so dass Wege von und zu den Aufnahme-Loci bestimmt werden kann. Diese Methode erlaubt es gut isoliert einzelnes Neuron Aufnahmen über mehrere Tage ohne den Einsatz Anästhetika.

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Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Elektrophysiologische Charakterisierung von neuronalen Antworten ist für das Verständnis der Gehirnfunktion und für das Führen der Anordnung von Farbstoffen für die Ablaufverfolgung Weg wichtig. Allerdings sind viele Studien an narkotisierten Tieren durchgeführt. Um die Hirnfunktion ohne Betäubung zu verstehen, entwickelten wir eine Methode, um neuronale Antwort Eigenschaften zu erfassen und zu injizieren Farbstoffe in wach-Maus.

Die Erstellung eines Awake Mausklick für Aufnahme neuronalen Antworten und Einspeisen von Tracer

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

preparation-an-awake-mouse-for-recording-neural-responses-injecting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Elektrophysiologische Charakterisierung von neuronalen Antworten ist für das Verständnis der Gehirnfunktion und für das Führen der Anordnung von Farbstoffen für die Ablaufverfolgung Weg wichtig. Allerdings sind viele Studien an narkotisierten Tieren durchgeführt. Um die Hirnfunktion ohne Betäubung zu verstehen, entwickelten wir eine Methode, um neuronale Antwort Eigenschaften zu erfassen und zu injizieren Farbstoffe in wach-Maus.

Serie: Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

Neuronalen Schaltkreis-Aufnahme von einem intakten Nervensystem Schabe

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Die Herstellung von High-Kontakt-Dichte, Flach-Interface Nerve Elektroden für die Aufnahme und Stimulation Anwendungen

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Bau eine verbesserte Multi-Tuberkuloseinfektion Hyperdrive für groß angelegte neuronalen Aufnahme in Ratten Verhalten

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...