Diese Arbeit wurde von NIH NIDCD Y1-DC-8002 bis 01 unterstützt. Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des US-Department of Energy von Lawrence Livermore National Laboratory unter Vertrag DE-AC52-07NA27344 durchgeführt.

1. Versammlung der Sonde an Stiffener Dieser Abschnitt des Protokoll beschreibt die Herstellung eines Silizium Aussteifung und die Anordnung eines Dünnfilm-Polymer Sonde mit der Versteifung. Fig. 1 zeigt eine typische Polymer neuronalen Sonde zusammen mit der vorgeschlagenen Versteifungselement. Die Einzelheiten des Versteifungs Design sind in Abbildung 2 dargestellt. Das neue Merkmal dieser Konstruktion ist der flache &quot;Wicking&quot;-Kanal entlang seiner Länge, die verwendet wird, um Flüssigkleber bei der Montage zu verteilen läuft. Der breitere Abschnitt der Versteifung ist ein Register für die Handhabung bei der Montage und chirurgischen Insertion. Ein Reservoir auf der Registerkarte Verbindung mit dem Kanal. Die Komponente aus Silizium unter Verwendung von Standardmikrofabrikationsverfahren hergestellt. <ol><li> Die Siliziumversteifungs mit Dochtkanal aus einem Silizium-auf-Isolator (SOI)-Wafer mit einer Vorrichtung Schichtdicke gleich der gewünschten Dicke der Versteifung (hergestellt <strong&gt; 3A). Eine angemessene Auswahl von Versteifungs Dicke von 20 bis 100 um. Es wird empfohlen, dass die Breite des Versteifungs werden 20-30 &amp;mgr; m kleiner ist als die Breite Sonde, die ein Überlaufen des Klebstoffs von der Bindungsgrenzfläche zu der Spitze der Sonde zu verhindern hilft. Die erste Dochtwirkungskanäle trocken geätzt unter Verwendung des Standard-Bosch-Verfahren (Fig. 3B). Als nächstes wird die Versteifungsgeometrie eine längere ätzen, die auf der vergrabenen Oxidschicht (3C) stoppt definiert. Schließlich werden die Versteifungen durch Nass-Ätzen der vergrabenen Oxidschicht in 49% Fluorwasserstoffsäure (3D) freigegeben. Nach gründlichem Spülen der Versteifungen, genießen sie in VE-Wasser für 15 min. </li><li> Platzieren eines Pellets aus Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 10.000 g / mol in den Vorratsbehälter (4). Wärme die Versteifung auf 65 ° C, so daß das PEG schmilzt und leitet in den Kanal durch Kapillarwirkung. Dann Abkühlen auf Raumtemperatur verfestigt. </li&gt; <li> Abbildung 5 zeigt eine schematische Darstellung der Flip-Chip-Bonder einrichten. Legen Sie die Versteifung umgedreht auf die Basisstufe des Flip Chip Bonder, dann holen die Versteifung mit dem Werkzeugkopf. Legen Sie die Sonde nach oben auf der Basisstufe. Mit der Flip-Chip-Bonder, richten Sie die Versteifung und die Sonde und senken Sie dann die Versteifung und legen Sie es auf die Sonde. </li><li> Die Basisstufe des Flip-Chip-Bonder sollte ein Heizelement, um Wärme auf das Substrat anzuwenden. Nach dem Platzieren des Versteifungs erhitzen Anordnung wieder auf 65 ° C Eine Minute nach der PEG erneut zu schmelzen und zu beginnen, in der Schnittstelle zwischen der Sonde und der Versteifung zu füllen. Kühle zu verfestigen. </li><li> Drehen Sie die Baugruppe über und prüfen von der Spitze. Erwärmen als nötig ist, damit das PEG an die Schnittstelle zwischen der Sonde und dem Versteifungselement vollständig ausfüllt. Dies kann visuell bewertet werden, da die Sonde transparent. Da die Montage der Heizung sitzt Top-(probe-) Seite nach oben, manuell platzieren 1-3 Extra-Pellets von festen PEG auf die Registerkarte, so dass sie über die Sonde zu schmelzen, die Bereitstellung zusätzlicher Verstärkung in diesem Bereich (Abbildung 6). Schließlich erlauben die Montage auf so cool, dass die PEG erstarrt. An diesem Punkt ist die Montage bereit für chirurgische Insertion. </li></ol> 2. Ein-und Ausbau <ol><li> Einbau des Probe-Versteifungsanordnung an einem Mikromanipulator, wie in 7A durch Kleben der Rückseite der Versteifung auf den Mikromanipulator Arm an der Laschenbereich dargestellt. Dies kann mit doppelseitigem Klebeband oder Zement getan werden, aber darauf achten, dass die Sonde mit Klebstoff zu kontaktieren. Vorübergehend sichern das Anschlussende der Sonde an den Mikromanipulator mit einem kleinen Stück Klebemasse, so dass sie leicht mit geringer Kraft entfernt werden. </li><li> Positionieren Sie die Sondenanordnung über dem Ziel und führen Sie die Sonde mit der gewünschten Eintragsgeschwindigkeit. Insertion Geschwindigkeiten von 0,13 bis 0,5 mm / sec wurden verwendet, bei der Entwicklung dieses Protokoll. &lt;/ Li&gt; <li> Ziehen Sie sofort den Stecker des Sonde aus dem Mikromanipulator sanft und Ruhe es auf einem nahe gelegenen Oberfläche, wie einer zweiten Manipulatorarmes (Abbildung 7B). Dies muss geschehen, bevor das PEG zu lösen beginnt, um zu vermeiden Verschieben der Sonde. </li><li> Nehmen Sie sich Zeit für PEG, sich aufzulösen. Diese Zeitdauer wird auf PEG-Molekulargewicht und der Kontaktbereich zwischen der Sonde und der Versteifung ab. Beispielsweise mit PEG-Molekulargewicht von 10.000 g / mol, eine Mikrosonde etwa 6 mm und einem passenden Versteifung, die 306 &amp;mgr; m breit ist, 15 min wurde festgestellt, daß eine ausreichende Menge an Zeit. Abschnitt 3 des Protokolls zeigt ein Verfahren, um die gewünschte Auflösungszeit zu prüfen. Während dieser Zeit gelten Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit Hilfe einer Pipette auf der Lasche und Einfügemarke jede PEG, die über dem Ziel (7C) ist, aufzulösen. </li><li> Mit einem motorisierten Mikropositionierer beginnen Extraktion der Versteifung, indem eine Verschiebung des100 &amp;mgr; m bei einer Geschwindigkeit von 5 mm / sec. Diese anfängliche schnelle Bewegung hilft, um statische Reibung zu überwinden und zu minimieren Sonde Verschiebung. Dann füllen Sie das Versteifung Extraktion mit einer langsameren Geschwindigkeit von ca. 0,1 mm / Sekunde (7D). </li><li> Im Fall einer tatsächlichen Operation, mit üblichen Verfahren weiterhin Gel, Silikon und / oder Zahnacryl an der Insertionsstelle Anwendung zur Sicherung und zum Schutz der Sonde, wie in 21 gezeigt. </li></ol> 3. Agarose-Gel-Test Dieser Abschnitt des Protokoll beschreibt eine Einrichtung und Verfahren, um die Extraktion der Versteifung in einem 0,6% Agarose-Gel, das die Groß mechanische Eigenschaften, pH-Wert und Salzgehalt des Hirngewebes 17,22 annähert zu untersuchen. Da das Gel ist durch kurze Wege fast transparent ist, kann Versteifung Trennung und Sonde Verschiebung beobachtet werden. <ol><li> Eine Lösung aus 0,6% Agarose in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Mischen Sie in einem eleviert Temperatur, um die Agarose-Pulver vollständig aufzulösen. Füllen Sie die Lösung in eine flache Acryl-Box; Gel sollte 3/4- 1 in tief sein. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur für eine Stunde eingestellt. </li><li> Sicherzustellen, dass die ausgehärtete Gel wird mit PBS gesättigt, so daß sie nicht austrocknen, und das Gel erwärmt auf 37 ° C. </li><li> Einrichten des Mikromanipulators Schachtel Agarosegel und mikroskopische Kamerasystem, wie in Fig. 8 gezeigt. </li><li> Legen Sie ein Glas Referenzbezugsmarkierung in den Strafraum von Gel, indem sie zwischen dem Gel und der Seite der Box (Abbildung 8). Verwenden Sie einen Zahnstocher, um die Funktionen auf der Referenzbezugs um das Blickfeld der Digital-Mikroskop-Platz. </li><li> Montieren Sie die Sondenanordnung auf die Mikromanipulator, wie in Schritt 2.1 beschrieben. </li><li> Positionieren Sie die Sondenanordnung über das Gel ca. 1 mm hinter dem Verweis Bezugs. </li><li> Führen Sie die Sonde in das Gel, mit der Kamera, um sie zu einer gewünschten Tiefe in das Blickfeld zu führen. &lt;/ Li&gt; <li> Unmittelbar bewegen Sie den Stecker des Sonde auf einem nahe gelegenen Oberfläche ruhen. </li><li> Nehmen Sie alle erforderlichen Anpassungen an das Kamerabild auf der Sonde (die Referenzbezugsmerkmale können etwas unscharf) konzentrieren. Machen Sie einen Schnappschuss der Sonde Lage. </li><li> PEG ermöglichen, sich aufzulösen (das Zeit kann variieren, und in der Tat kann ein Parameter, der getestet werden kann). Bewerben PBS in der Nähe der Registerkarte PEG aufzulösen, die über dem Gel ist. </li><li> Videoaufnahme zu starten, falls gewünscht, und beginnt die Extraktion des Versteifungs wie in Schritt 2.5 beschrieben. Wenn Extraktion abgeschlossen ist, eine endgültige Momentaufnahme der Sonde Lage. </li><li> Verwenden Sie Bildverarbeitungs-Tools, um die Bilder vor und nach der Extraktion Versteifung vergleichen. Verwenden Sie die Funktionen auf der Referenzbezugs, die in das Blickfeld zu registrieren sichtbar sind (ausgerichtet) der Bilder. Kalibrieren der Waage der Grundlage der Größe des bekannten Merkmalen auf dem Testbild. Messen Sie den Abstand der Sonde Verschiebung. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier beschriebene Methode bietet eine gut kontrollierten Prozess zu Dünnfilm-Polymersonden separate Versteifungen mit einem biodissolvable Klebstoff befestigen. Auch dargestellt ist die empfohlene chirurgischen Prozedur, um diese abnehmbar Steifen und ein Verfahren, das Verfahren in vitro für eine bestimmte Sondenversteifungs Konfiguration validieren implementieren. Da kann die Versteifung beliebig starr gemacht werden kann, kann das Verfahren Einführen relativ lange Sonden (&gt; 3 mm) zu erleichtern. So...

Mikroelektroden-Arrays sind ein unverzichtbares Werkzeug in den Neurowissenschaften sowie neue klinische Anwendungen wie Prothetik. Insbesondere, durchdringenden Mikroelektrodensonden ermöglichen Stimulation und Ableitung neuronaler Aktivität durch den engen Kontakt mit den Zellen im Gehirn, Rückenmark und peripheren Nerven. Eine große Herausforderung für implantierten neuronalen Sonden ist die Stabilität und Langlebigkeit der Stimulation und Aufnahme-Funktionen. Modellierung und experimentelle Untersuchungen über die Wechselwirkung zwischen Mikrosonden und Nervengewebe haben vorgeschlagen, dass ein Mechanismus zum Abbau Mikroreißen von Nervengewebe aufgrund einer geringfügigen Relativbewegung zwischen der Sonde und dem Gewebe 1-3. Eine Lösung ist die flexible Sonden, die stärker die Großsteifigkeitseigenschaften von Nervengewebe, um eine relative Mikrobewegung zu minimieren entsprechen herzustellen. Als solche haben biokompatiblen Dünnschicht Polymere, wie Polyimid, Parylene und als Substrate für günstige Mikroelektronik übernommentrode Sonden 4-8. Ein Kompromiss von flexiblen Sonden ist, dass sie schwer in das neuronale Gewebe einzufügen sind. Forscher haben verschiedene Ansätze verfolgt, um die Einführung von flexiblen Sonden ermöglichen, unter Beibehaltung der mechanischen Eigenschaften wünschenswert. Eine Klasse von Designs modifiziert die Polymersondengeometrie, um die Steifigkeit in bestimmten Abschnitten oder Achsen zu erhöhen, während in anderen Teilen der Einhaltung. Dies wurde durch den Einbau von Rippen oder Schichten aus anderen Materialien 9,10 erreicht. Ein weiterer Ansatz integriert ein 3-D-Kanal in die Polymersondenkonstruktion, die mit biologisch abbaubaren Material 11 gefüllt ist. Diese Sonde kann vorübergehend versteift werden, und nach dem Einführen des Materials in den Kanal löst und abfließt. Jedoch solche Verfahren, die die Geometrie des endgültigen implantierten Vorrichtung permanent ändern können einige der wünschenswerten Eigenschaften der flexiblen Sonde beeinträchtigen. Eine Methode, die funktioniert not den endgültigen Sondengeometrie zu verändern ist, um die Polymervorrichtung mit biologisch abbaubarem Material, die Vorrichtung 12-14 vorübergehend versteifen kapseln. Jedoch haben typische biologisch abbaubaren Materialien Elastizitätsmodule um Größenordnungen kleiner als die von Silizium und würde folglich erfordern größere Dicke, um die gleiche Steifigkeit zu erreichen. Ausreichend Beschichtung kann die Sonde in einer abgerundeten oder stumpfen Spitze führen, was Einsetzen schwieriger. Da lösliche Beschichtungen ausgesetzt sind, besteht die Gefahr, dass sie unmittelbar nach dem Kontakt Auflösen oder auch nahe, mit dem Gewebe. Eine weitere Klasse von Methoden verwendet neuartige Sonde Substratmaterialien, die nach der Implantation in das Gewebe in der Steifigkeit zu reduzieren. Solche Materialien umfassen Formgedächtnispolymere 15 und eine mechanisch adaptive Nanokomposit-16. Diese Materialien sind in der Lage, E-Modul deutlich nach dem Einsetzen zu verringern, und können Sonden, die enger matC führenh die mechanischen Eigenschaften des Nervengewebes. Allerdings ist die erzielbare Reichweite der Steifigkeit noch begrenzt, so dass sie nicht in der Lage, sehr hohe Steifigkeit entspricht Silizium-oder Wolframdrähten bereitzustellen. So ist in dem Fall von flexiblen Sonden, die sehr lange (z. B.&gt; 3 mm), oder dass eine extrem geringe Steifigkeit sind, kann ein Verfahren zum zeitweiligen Anbringen eines starren Versteifungs noch erforderlich. Noch ein weiteres vielversprechendes Verfahren berichtet, ist die Beschichtung ein Versteifungs Shuttle mit einem Permanentselbstorganisierende Monoschicht (SAM), die Oberflächenwechselwirkung zwischen dem Shuttle und der flexiblen Sonde 17 anpassen. Wenn es trocken ist, hält sich die Sonde auf die elektrostatisch beschichtet Shuttle. Nach dem Einführen wandert Wasser auf der hydrophilen Oberfläche, Abtrennen der Sonde von der Shuttle, so dass der Shuttle extrahiert werden. Shuttle-Extraktion mit reduziertem Hubraum Sonde nachgewiesen (85 um). Doch mit nur elektrostatische Wechselwirkungen Halten der Sonde zu ter-Shuttle, besteht das Risiko von Sonden Schlupf relativ zum Shuttle vor und während der Einführung. Wir haben ein Verfahren, bei dem die flexible Sonde mit einer Versteifung mit einem temporären biodissolvable Klebematerial, das sicher hält die Sonde während des Einführens angebracht entwickelt. Die verwendeten Sonden waren aus Polyimid, das ein Elastizitätsmodul in der Größenordnung von 2-4 GPa aufweist. Die Versteifung aus Silizium hergestellt ist, mit einem Elastizitätsmodul von ca. 200 GPa. Wenn angebracht, die Steifigkeit des Silizium dominiert, das Einführen. Sobald sie in das Gewebe eingeführt wird, löst das Haftmaterial und das Verstärkungs extrahiert wird, um die Sonde in die Ausgangs Flexibilität wiederherzustellen. Wir wählten Polyethylenglykol (PEG) als biodissolvable Klebstoff. PEG wurde in implantierten Anwendungen wie neuronale Sonden, Tissue Engineering und Drug-Delivery 11,18,19 verwendet. Einige Beweise hat vorgeschlagen, dass PEG kann neuroinflammatorischen Antwort in Gehirn dämpfenGewebe 18,20. Im Vergleich zu anderen möglichen Materialien, einschließlich Saccharose, Polymilchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) und Polyvinylalkohol (PVA), PEG hat eine Auflösungszeit in biologischen Flüssigkeiten, der aus einem geeigneten Maßstab für viele Implantat Operationen ist (in der Größenordnung von zehn Minuten, je nach Molekulargewicht). Darüber hinaus ist es bei Raumtemperatur fest und flüssig bei Temperaturen im Bereich von 50 bis 65 ° C. Diese Eigenschaft macht sie besonders geeignet für unsere Präzisionsmontageprozesses. In 17 außerdem ähnlich dem SAM beschrieben, ist die hydrophile PEG gelöst, Erleichterung der Extraktion des Versteifungs. Diese vorteilhafte Ansatz wird durch ein neuartiges Design und methodische Versteifung Montageprozess die eine gleichmäßige Klebeabdeckung und genaue und wiederholbare Ausrichtung zu gewährleisten aktiviert. Zusätzlich zu den Montageprozess, präsentieren wir die Methode der Durchführung des entfernbaren Versteifungs während der Operation sowie ein in vitro-Verfahren zur Extraktion der STI auswertenffener. Die hier vorgestellte Protokoll geht davon aus, dass der Benutzer eine flexible Polymermikrosonde besitzt. Der Teil des Protokolls über die Herstellung der Versteifung und Montage dieser Sonde zu einer Versteifung nimmt Zugriff auf gemeinsame Werkzeuge in einer Mikroanlage gefunden. Das Protokoll über die Steck-und Zieh würde wahrscheinlich in einem Neuroorientierten Labor durchgeführt werden.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Polyethylene glycol, 10,000 g/mol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flexible Sub-micron Die Bonder</td>
			<td>Finetech</td>
			<td>Fineplacer lambda</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1760-61</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital Microscope</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>KH-7700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual Illumination Revolver Zoom Lens</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>MXG-2500REZ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Motorized Actuator</td>
			<td>Newport</td>
			<td>LTA-HS</td>
			<td>w/ CONEX-CC controller</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

insertion of flexible neural probes using rigid stiffeners attached with biodissolvable adhesive

Mikroelektroden-Arrays für neuronale Interface-Geräte, die von biokompatiblen Dünnschicht-Polymer hergestellt werden, werden erwartet, um funktionelle Lebensdauer verlängert haben, weil das flexible Material kann negative Gewebereaktion durch Mikrobewegungen zu minimieren. , Jedoch verhindert, dass sie ihre Flexibilität aus, die genau in das Nervengewebe eingesetzt. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um vorübergehend befestigen ein flexibles Mikrosonde an einem starren Versteifung mit biodissolvable Polyethylenglykol (PEG), um präzise, ​​chirurgische Einführen der Sonde zu erleichtern. Eine einzigartige Versteifungs Design ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung der PEG-Klebstoff entlang der Länge der Sonde. Flip-Chip-Bonden, ein übliches Werkzeug in der Mikroelektronik Verpackung, ermöglicht eine genaue und wiederholbare Ausrichtung und Befestigung der Sonde an der Versteifung. Die Sonde und Versteifung werden chirurgisch implantiert zusammen, dann ist die PEG wird sich auflösen, so dass die Versteifung extrahiert werden, so dass die Sondean Ort und Stelle. Schließlich wird ein in vitro-Testverfahren verwendet werden, um Versteifungs Extraktion in einem Agarosegel Modell des Hirngewebes zu beurteilen. Für mehr flexible Sonden besonders vorteilhaft hat sich dieser Ansatz der Implantation nachgewiesen (&gt; 3 mm). Es stellt auch eine praktikable Methode, um zweiseitige flexible Sonden implantieren. Bisher wurde die Technik verwendet, um verschiedene In-vivo-Aufnahme von Daten aus der Rattenhirnrinde zu erhalten.

Diese Insertion Technik wurde in Verbindung mit LLNL Dünnschicht-Polyimid-Sonden, die ISO 10993 Biokompatibilität Normen bestanden haben und für chronische Implantation bestimmt ist. Ein typisches Dünnschicht-Polyimid-Sonde ist in Fig. 1 zusammen mit einem Silizium-Versteifung, die etwa 10 mm lang in der schmalen Region ist dargestellt. Diese Versteifung eines Dochtkanals entlang seiner Länge verläuft, wie in Fig. 2 gezeigt. Fig. 3 zeigt die mimcrofabrication Verf...

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Einführen des flexiblen neuralen Mikrosonden durch Anbringen Sonden starre Versteifungen mit Polyethylenglykol (PEG) aktiviert. Eine einzigartige Montageprozess gewährleistet eine einheitliche und wiederholbare Anhang. Nach dem Einführen in das Gewebe löst sich das PEG und das Versteifungselement herausgezogen. Ein in vitro-Testverfahren beurteilt die Technik in Agarosegel.

Einfügen von Flexible Neural Sonden mit starren Versteifungen Biodissolvable mit Klebstoff befestigt

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K Aufrufe.  Lawrence Livermore National Laboratory.  Einführen des flexiblen neuralen Mikrosonden durch Anbringen Sonden starre Versteifungen mit Polyethylenglykol (PEG) aktiviert. Eine einzigartige Montageprozess gewährleistet eine einheitliche und wiederholbare Anhang. Nach dem Einführen in das Gewebe löst sich das PEG und das Versteifungselement herausgezogen. Ein in vitro-Testverfahren beurteilt die Technik in Agarosegel. 

Serie: Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Anbringen biologischen Sonden zur Silica Optische Biosensoren Mit Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Forschung

Biotechnik

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Herstellung und Implantation von Miniatur-Zweielement Dehnungsmessstreifen für Mess<em&gt; In Vivo</em&gt; Magen-Darm-Kontraktionen in Nagetiere.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

System mit vertikal V-Kurven zu zwingen: eine 3D In-vitro- Bewertung der elastisch und starr rechteckigen Bögen

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other etiologies of comparable arthrofibrosis. The model includes extra-articular fixation of the shoulder in rats via scapular to humeral suturing, resulting in a secondary contracture without invading the intra-articular space and resulting in decreased rotational ROM and increased joint stiffness.
We used 10 Sprague-Dawley rats for the purpose of this study. Baseline ROM measurements were taken before glenohumeral immobilization. The rats were subjected to 8 weeks of immobilization before the fixation sutures were removed and changes in ROM and joint stiffness were evaluated. To evaluate whether immobilization resulted in a significant reduction in ROM, changes in kinematics were calculated. ROM was measured at each time point in the follow-up period and was compared to the baseline internal and external ROM measurements. In order to evaluate the stiffness, joint kinetics were calculated by determining the differences in torque (text and tint ) needed to reach the initial external rotation of 60&#176; and initial internal rotation of 80&#176;.
After the removal of the extra-articular suture fixation on follow-up day 0, we found a 63% decrease in total ROM compared to baseline. We observed continuous improvement until week 5 of follow-up, with the progress slowing down around a 19% restriction. On week 8 of follow-up, there was still an 18% restriction of ROM. Additionally, on follow-up day 0, we found the torque increased by 13.3 Nmm when compared to baseline. On week 8, the total torque was measured to be 1.4 &#177; 0.2 Nmm higher than initial measurements. This work introduces a rat model of shoulder adhesive capsulitis with lasting reduced ROM and increased stiffness.

This protocol presents an in vivo rat model of adhesive capsulitis. The model includes an internal fixation of the glenohumeral joint with extra-articular suture fixation for an extended time, resulting in a decreased rotational range of motion (ROM) and increased joint stiffness.

Rattenmodell des anhaftenden Capsulitis der Schulter

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

Erhöhung der Haltbarkeit dissoziierter neuronaler Zellkulturen unter Verwendung biologisch aktiver Korallenmatrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Automatisierte zweidimensionale raumzeitliche Analyse mobiler Einzelmolekül-FRET-Sonden

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Eine flexible Kammer für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...