Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NIDCD Y1-DC-8002-01. Questo lavoro è stato svolto sotto l&#39;egida del Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti da Lawrence Livermore National Laboratory nell&#39;ambito del contratto DE-AC52-07NA27344.

1. Assemblaggio di sonda per Stiffener Questa sezione descrive il protocollo di fabbricazione di un rinforzo di silicio, e l&#39;assemblaggio di una sonda polimero film sottile al rinforzo. Figura 1 illustra una sonda tipica polimero neurale con il rinforzo proposto. I dettagli della progettazione rinforzo sono mostrati nella Figura 2. La caratteristica innovativa di questo motivo è poco profondo &quot;wicking&quot; canale che corre lungo la sua lunghezza che viene utilizzato per distribuire l&#39;adesivo liquido durante il montaggio. La porzione più ampia del rinforzo è una scheda per la movimentazione in fase di montaggio e inserimento chirurgico. Un serbatoio nella scheda si collega al canale. Il componente è realizzato con silicio mediante processi di microfabbricazione standard. <ol><li> Il rinforzo di silicio con un canale traspirante è stato fabbricato da una (SOI) wafer di silicio su isolante con uno spessore periferica uguale allo spessore desiderato del rinforzo ( <strong&gt; Figura 3A). Una gamma ragionevole di spessore del rinforzo è 20-100 micron. Si raccomanda che la larghezza del rinforzo sia 20-30 micron di ampiezza inferiore sonda, che aiuta a evitare overflow dell&#39;adesivo dall&#39;interfaccia legame alla sommità della sonda. In primo luogo i canali traspirazione sono a secco inciso utilizzando il processo Bosch standard (Figura 3B). Successivamente, la geometria rinforzo è definito da una etch più che ferma sullo strato di ossido sepolto (Figura 3C). Infine, i rinforzi sono rilasciate dai wet-attacco dello strato di ossido sepolto nel 49% di acido fluoridrico (Figura 3D). Dopo aver accuratamente sciacquato i rinforzi, metterli a bagno in acqua deionizzata per 15 min. </li><li> Posizionare un pellet di polietilene glicole (PEG) di peso molecolare 10.000 g / mol nel serbatoio (Figura 4). Riscaldare il rinforzo a 65 ° C in modo che il PEG si scioglie e stoppini nel canale per azione capillare. Poi raffreddare a temperatura ambiente a solidificare. </li&gt; <li> La figura 5 mostra uno schema del flip chip di bonder impostato. Posizionare il rinforzo a testa in giù sul palco base del bonder flip chip, poi prendere il rinforzo con la testa strumento. Posizionare la sonda a testa in giù sul palco di base. Utilizzando il bonder flip chip, allineare il rinforzo e la sonda e quindi abbassare il rinforzo e posizionarlo sulla sonda. </li><li> Lo stadio base del bonder flip chip dovrebbe avere un elemento riscaldante per applicare calore al substrato. Dopo aver posizionato il rinforzo, riscaldare l&#39;assieme ancora una volta a 65 ° C. Lasciare un minuto il PEG di rifusione e di iniziare a compilare l&#39;interfaccia tra la sonda e il rinforzo. Raffreddare a solidificare. </li><li> Girare il gruppo e ispezionare dall&#39;alto. Riscaldare necessaria per consentire il PEG per riempire completamente l&#39;interfaccia tra la sonda e il rinforzo. Ciò può essere valutato visivamente quanto la sonda è trasparente. Poiché il gruppo è seduto sulla riscaldatore superiore (sonda) rivolto verso l&#39;alto, inserire manualmente 1-3 epellets Xtra di solido PEG sulla scheda in modo che si sciolgono sulla sonda, fornendo un ulteriore rinforzo in questa regione (Figura 6). Infine, permettere al gruppo di raffreddare in modo che il PEG solidifica. A questo punto, il gruppo è pronto per l&#39;inserimento chirurgico. </li></ol> 2. Inserimento e estrazione <ol><li> Montare la sonda-rinforzo per un micromanipolatore come illustrato nella Figura 7A aderendo retro del rinforzo al braccio micromanipolatore in corrispondenza della zona tab. Questo può essere fatto con nastro biadesivo o cemento, ma fare attenzione a non contattare la sonda con adesivo. Fissare temporaneamente l&#39;estremità del connettore della sonda al micromanipolatore con un piccolo pezzo di mastice adesivo tale da poter essere facilmente rimosso con bassa forza. </li><li> Posizionare il gruppo sonda sul bersaglio e inserire la sonda con la velocità di inserimento desiderato. Velocità di inserimento di 0,13-0,5 mm / sec sono stati usati durante lo sviluppo di questo protocollo. &lt;/ Li&gt; <li> Rimuovere immediatamente l&#39;estremità del connettore della sonda dal micromanipolatore delicatamente e poggiare su una superficie vicina, come un secondo braccio manipolatore (Figura 7B). Questo deve essere fatto prima che il PEG comincia a dissolversi per evitare di sostituirsi alla sonda. </li><li> Lasciare il tempo per PEG sciogliere. Questo tempo dipende dal peso molecolare PEG e l&#39;area di contatto tra la sonda e rinforzo. Ad esempio, con peso molecolare di PEG 10.000 g / mol, una sonda microelettrodo circa 6 mm e un rinforzo di corrispondenza che è 306 micron di larghezza, 15 min è stato trovato per essere una adeguata quantità di tempo. Sezione 3 del protocollo presenta un metodo per testare il tempo di dissoluzione desiderato. Durante questo tempo, applicare tampone fosfato salino (PBS) con un contagocce attorno al punto di inserimento scheda e per sciogliere qualsiasi PEG che è sopra la porta (Figura 7C). </li><li> Utilizzando una micropositioner motorizzato, iniziare l&#39;estrazione del rinforzo applicando uno spostamento di100 micron ad una velocità di 5 mm / sec. Questo rapido movimento iniziale aiuta a superare qualsiasi attrito statico e ridurre al minimo lo spostamento della sonda. Poi, completare l&#39;estrazione rinforzo ad una velocità più lenta di circa 0,1 mm / secondo (figura 7D). </li><li> Nel caso di un intervento chirurgico reale, continuare le normali procedure di applicare gel, silicone, e / o acrilico dentale nel sito di inserzione per assicurare e proteggere la sonda, come mostrato in 21. </li></ol> 3. Agarose Gel test Questa sezione del protocollo descrive una procedura di configurazione e di esaminare l&#39;estrazione del rinforzo in un gel di agarosio 0,6% che approssima le proprietà meccaniche bulk, pH, salinità e di tessuto cerebrale 17,22. Dal momento che il gel è quasi trasparente attraverso brevi distanze, possono essere osservati separazione rinforzo e lo spostamento della sonda. <ol><li> Preparare una soluzione di 0,6% agarosio in tampone fosfato salino (PBS). Mescolare in una eletemperatura vato per dissolvere completamente la polvere di agarosio. Versare la soluzione in una scatola di acrilico superficiale; gel dovrebbe essere 3/4- 1 in profonda. Lasciare il gel fissato a temperatura ambiente per un&#39;ora. </li><li> Assicurarsi che il gel indurito è saturo di PBS in modo che non si secchi, e riscaldare il gel a 37 ° C. </li><li> Impostare micromanipolatore, scatola di gel di agarosio, e sistema di telecamere microscopiche come illustrato nella Figura 8. </li><li> Inserire un fiducial riferimento vetro in area di gel facendolo scorrere tra il gel e il lato della scatola (Figura 8). Utilizzare un pick dentale per squadrare le caratteristiche sulla fiducial riferimento al campo visivo del microscopio digitale. </li><li> Montare la sonda al micromanipolatore come descritto al punto 2.1. </li><li> Posizionare il gruppo sonda sopra il gel di circa 1 mm dietro l&#39;fiduciale di riferimento. </li><li> Inserire la sonda nel gel, utilizzando la macchina fotografica per guidare ad una profondità desiderata nel campo visivo. &lt;/ Li&gt; <li> Spostare immediatamente l&#39;estremità del connettore della sonda a riposare su una superficie vicina. </li><li> Apportare le modifiche necessarie per l&#39;immagine della telecamera di concentrarsi sulla sonda (le caratteristiche fiduciali di riferimento possono essere leggermente fuori fuoco). Prendete uno snapshot della posizione della sonda. </li><li> Lasciare PEG per sciogliere (questo tempo può variare, e in effetti può essere un parametro da testare). Applicare PBS vicino alla scheda per sciogliere PEG che è sopra il gel. </li><li> Inizia acquisizione video se lo si desidera, e iniziare l&#39;estrazione del rinforzo come descritto al punto 2.5. Quando l&#39;estrazione è completa, prendere una fotografia istantanea finale della posizione della sonda. </li><li> Utilizzare strumenti di elaborazione delle immagini per confrontare le immagini prima e dopo l&#39;estrazione rinforzo. Utilizzare le caratteristiche sulla fiduciale di riferimento che sono visibili nel campo di vista registrarsi (allineare) le immagini. Calibrare la scala dell&#39;immagine in base alle dimensioni di caratteristiche note sulla sonda. Misurare la distanza dello spostamento della sonda. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Il metodo qui descritto fornisce un processo ben controllato per collegare le sonde polimero a film sottile di rinforzi separati con un adesivo biodissolvable. Inoltre ha presentato è la procedura chirurgica raccomandata per attuare queste stecche estraibili e una tecnica per convalidare la procedura in vitro per una data configurazione della sonda-rinforzo. Poiché il rinforzo può essere fatta arbitrariamente rigida, il metodo può facilitare l&#39;inserimento di sonde relativamente lunghe (&gt; 3 mm). Come ...

Matrici di microelettrodi sono uno strumento essenziale nel campo delle neuroscienze, così come applicazioni cliniche emergenti come protesi. In particolare, penetrante sonde micro-elettrodi permettono di stimolazione e registrazione dell&#39;attività neuronale attraverso lo stretto contatto con le cellule del cervello, midollo spinale e nervi periferici. Una sfida importante per le sonde neurali impiantate è la stabilità e la longevità delle funzioni di stimolazione e registrazione. Studi di modellistica e sperimentale dell&#39;interazione tra le sonde di microelettrodi e tessuto neurale hanno suggerito che un meccanismo di degradazione è micro-lacerazione del tessuto nervoso a causa di leggero movimento relativo tra la sonda e il tessuto 1-3. Una soluzione consiste nel fabbricare sonde flessibili che hanno più strettamente le proprietà di rigidezza massa di tessuto neurale per minimizzare relativa micromovimenti. Come tale, polimeri biocompatibili film sottile come poliimmide e parylene sono stati adottati come substrati favorevoli per MICROELECdell&#39;elettrodo indaga 4-8. Un compromesso di sonde flessibili è che sono difficili da inserire nel tessuto neurale. I ricercatori hanno preso vari approcci per facilitare l&#39;inserimento di sonde flessibili preservando le proprietà meccaniche desiderabili. Una classe di disegni modifica la geometria della sonda polimero per aumentare la rigidità in alcune sezioni o assi, pur mantenendo il rispetto in altre parti. Questo è stato realizzato incorporando nervature o strati di altre materie 9,10. Un altro approccio integra un canale 3-D nel disegno sonda polimero che viene riempito con materiale biodegradabile 11. Questa sonda può essere irrigidita temporaneamente, e dopo l&#39;inserimento del materiale nelle dissolve canale e scaricata. Tuttavia, i metodi come questi che modificano permanentemente la geometria del dispositivo finale impiantato possono compromettere alcune delle caratteristiche desiderabili della sonda flessibile. Un metodo che fa not alterare la geometria della sonda finale è di incapsulare il dispositivo polimero con materiale biodegradabile per irrigidire temporaneamente il dispositivo 12-14. Tuttavia, materiali tipici biodegradabili hanno ordini di Young di moduli di grandezza inferiore a quella del silicio e sarebbero quindi necessari spessore maggiore per ottenere la stessa rigidità. Adeguatamente rivestimento della sonda può provocare una punta più arrotondata o smussata, rendendo più difficile inserimento. Inoltre, poiché i rivestimenti solubili sono esposte, vi è il rischio di loro dissoluzione immediatamente, a contatto, o anche vicinanza, con il tessuto. Un&#39;altra classe di metodi utilizza sonde romanzo substrato materiali che riducono in rigidezza dopo essere stato impiantato nel tessuto. Tali materiali comprendono polimeri a memoria di forma 15 e un nanocomposito meccanicamente adattativo 16. Questi materiali sono in grado di diminuire in modulo elastico significativamente dopo l&#39;inserimento, e possono causare sonde che più strettamente MatCh le proprietà meccaniche del tessuto neurale. Tuttavia, la gamma di rigidezza ottenibile è ancora limitata, in modo che non può essere in grado di fornire elevata rigidezza equivalente ai fili di silicio o di tungsteno. Pertanto, nel caso di sonde flessibili che sono molto lunghi (ad esempio&gt; 3 mm) o che hanno estremamente bassa rigidità, potrebbe essere necessario prestare un modo di fissare temporaneamente un rinforzo più rigida. Ancora un altro metodo promettente segnalato è per rivestire una navetta irrigidimento con una permanente auto-assemblaggio monostrato (SAM) per personalizzare l&#39;interazione superficie tra la navetta e la sonda flessibile 17. Una volta asciutta, la sonda aderisce alla navetta rivestito elettrostaticamente. Dopo l&#39;inserimento, acqua migra sulla superficie idrofila, separando la sonda dalla navetta in modo che la navetta può essere estratto. Estrazione Shuttle con cilindrata ridotta sonda è stata dimostrata (85 micron). Tuttavia, con sole interazioni elettrostatiche tenendo la sonda di tegli navetta, vi è un certo rischio di sonda scorrimento relativo alla navetta prima e durante l&#39;inserimento. Abbiamo sviluppato un metodo in cui la sonda flessibile è collegata a un rinforzo con un materiale adesivo biodissolvable temporaneo che tiene saldamente la sonda durante l&#39;inserimento. Le sonde utilizzate erano fatte di poliimmide, che ha un modulo elastico dell&#39;ordine di 2-4 GPa. Il rinforzo è stato fabbricato da silicio, con un modulo elastico di ~ 200 GPa. Se collegato, la rigidità del silicio domina, facilitando l&#39;inserimento. Una volta inserita nel tessuto, il materiale adesivo si dissolve e il rinforzo viene estratto per ripristinare la sonda alla sua duttilità iniziale. Abbiamo scelto polietilenglicole (PEG) come il materiale adesivo biodissolvable. PEG è stato utilizzato in applicazioni impiantati quali sonde neurali, ingegneria tessutale, e la somministrazione di farmaci 11,18,19. Alcune prove ha suggerito che PEG può attenuare la risposta neuroinfiammatorie nel cervellotessuto 18,20. Rispetto ad altri materiali possibili, tra cui saccarosio, lattico-co-glicolico acido poli (PLGA), e l&#39;alcool polivinilico (PVA), PEG ha un tempo di dissoluzione in fluidi biologici che è una portata tale per molti interventi implantari (dell&#39;ordine di decine di minuti, a seconda del peso molecolare). Inoltre, è solido a temperatura ambiente e liquido a temperature comprese 50-65 ° C. Questa struttura rende particolarmente adatto per il nostro processo di assemblaggio di precisione. Inoltre, simile alla SAM descritto in 17, il PEG disciolto è idrofilo, facilitando l&#39;estrazione del rinforzo. Questo approccio vantaggioso è attivata da un design rinforzo romanzo e metodico processo di assemblaggio che garantiscono una copertura adesiva uniforme e allineamento preciso e ripetibile. Oltre al processo di assemblaggio, presentiamo il metodo di applicazione del rinforzo rimovibile durante l&#39;intervento chirurgico, come pure un procedimento in vitro per valutare l&#39;estrazione della stiffener. Il protocollo qui presentata si presuppone che l&#39;utente possiede una sonda flessibile polimero microelettrodo. La parte del protocollo riguardante la fabbricazione del rinforzo e montaggio di questa sonda ad un rinforzo assume accesso a strumenti comuni presenti in una struttura microfabbricazione. Il protocollo relativo ai inserimento e l&#39;estrazione sarebbe probabilmente essere effettuata in un laboratorio di neuroscienze-oriented.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Polyethylene glycol, 10,000 g/mol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flexible Sub-micron Die Bonder</td>
			<td>Finetech</td>
			<td>Fineplacer lambda</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1760-61</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital Microscope</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>KH-7700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual Illumination Revolver Zoom Lens</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>MXG-2500REZ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Motorized Actuator</td>
			<td>Newport</td>
			<td>LTA-HS</td>
			<td>w/ CONEX-CC controller</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

insertion of flexible neural probes using rigid stiffeners attached with biodissolvable adhesive

Matrici di microelettrodi per i dispositivi di interfaccia neurali che sono fatti di polimero biocompatibile a film sottile sono tenuti ad avere esteso durata funzionale perché il materiale flessibile può minimizzare reazione avversa al tessuto causata da micromovimenti. Tuttavia, la loro flessibilità ne impedisce accuratamente inserito nel tessuto neurale. Questo articolo viene illustrato un metodo per collegare temporaneamente un microelettrodo sonda flessibile per un rinforzo rigido utilizzando biodissolvable polietilene glicole (PEG) per facilitare preciso, inserimento chirurgico della sonda. Un disegno unico permette rinforzo per la distribuzione uniforme della colla PEG lungo la lunghezza della sonda. Flip-chip bonding, uno strumento comune utilizzato negli imballaggi microelettronica, permette l&#39;allineamento preciso e ripetibile e fissaggio della sonda al rinforzo. La sonda e rinforzi sono impiantati chirurgicamente insieme, poi il PEG è disciolta in modo che il rinforzo può essere estratto lasciando la sondaal suo posto. Infine, un metodo di prova in vitro viene utilizzato per valutare l&#39;estrazione rinforzo in un modello gel di agarosio del tessuto cerebrale. Questo approccio dell&#39;impianto è dimostrato particolarmente vantaggioso per le sonde più flessibili (&gt; 3 mm). Esso fornisce anche un metodo fattibile per impiantare sonde flessibili su due lati. Ad oggi, la tecnica è stata utilizzata per ottenere varie vivo dati registrati dalla corteccia di ratto.

Questa tecnica di inserimento è stato usato in combinazione con LLNL film sottile sonde poliimmidi, che hanno superato ISO 10993 standard di biocompatibilità e sono destinati ad essere impiantati cronica. Una sonda poliimmide tipico film sottile è illustrato nella figura 1 con un rinforzo di silicio che è di circa 10 mm di lunghezza nella regione stretta. Questo rinforzo ha un canale traspirante che corre lungo la sua lunghezza, come mostrato nella Figura 2. Figura 3 illustra il pro...

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Inserimento di sonde flessibili microelettrodi neurali è attivata collegando sonde di rinforzi rigidi con polietilene glicole (PEG). Un processo di assemblaggio unica assicura uniformità e l&#39;attaccamento ripetibile. Dopo l&#39;inserimento nel tessuto, il PEG dissolve e il rinforzo viene estratto. Un metodo di prova in vitro valuta la tecnica in gel di agarosio.

Inserimento di Flexible Neural Sonde Uso Rinforzi rigida collegata con Biodissolvable adesivo

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K Views.  Lawrence Livermore National Laboratory.  Inserimento di sonde flessibili microelettrodi neurali è attivata collegando sonde di rinforzi rigidi con polietilene glicole (PEG). Un processo di assemblaggio unica assicura uniformità e l'attaccamento ripetibile. Dopo l'inserimento nel tessuto, il PEG dissolve e il rinforzo viene estratto. Un metodo di prova in vitro valuta la tecnica in gel di agarosio. 

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Collegamento sonde biologiche ai biosensori ottici che utilizza silice agenti di accoppiamento silanici

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

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Bioingegneria

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabbricazione e impianto di miniatura a doppio elemento Estensimetri per misurazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinale Contrazioni nei roditori.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

Sistema con verticale V-curve forza: una valutazione 3D In Vitro di archi rettangolari elastici e rigidi

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other etiologies of comparable arthrofibrosis. The model includes extra-articular fixation of the shoulder in rats via scapular to humeral suturing, resulting in a secondary contracture without invading the intra-articular space and resulting in decreased rotational ROM and increased joint stiffness.
We used 10 Sprague-Dawley rats for the purpose of this study. Baseline ROM measurements were taken before glenohumeral immobilization. The rats were subjected to 8 weeks of immobilization before the fixation sutures were removed and changes in ROM and joint stiffness were evaluated. To evaluate whether immobilization resulted in a significant reduction in ROM, changes in kinematics were calculated. ROM was measured at each time point in the follow-up period and was compared to the baseline internal and external ROM measurements. In order to evaluate the stiffness, joint kinetics were calculated by determining the differences in torque (text and tint ) needed to reach the initial external rotation of 60&#176; and initial internal rotation of 80&#176;.
After the removal of the extra-articular suture fixation on follow-up day 0, we found a 63% decrease in total ROM compared to baseline. We observed continuous improvement until week 5 of follow-up, with the progress slowing down around a 19% restriction. On week 8 of follow-up, there was still an 18% restriction of ROM. Additionally, on follow-up day 0, we found the torque increased by 13.3 Nmm when compared to baseline. On week 8, the total torque was measured to be 1.4 &#177; 0.2 Nmm higher than initial measurements. This work introduces a rat model of shoulder adhesive capsulitis with lasting reduced ROM and increased stiffness.

This protocol presents an in vivo rat model of adhesive capsulitis. The model includes an internal fixation of the glenohumeral joint with extra-articular suture fixation for an extended time, resulting in a decreased rotational range of motion (ROM) and increased joint stiffness.

Modello del ratto di capsulite adesiva della spalla

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Una camera flessibile per l'imaging di cellule vive time-lapse con microscopia a diffusione Raman stimolata

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

Sintesi di idrogel adesivo forte, gelatina O-nitrosobenzaldeide

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...