Drosophila melanogaster Embryos und Larven sind einfach hand zuhaben und ihre Entwicklung ist ähnlich derer in anderen Organismen, wie zum Beispiel den Säugetieren. Das Erlernen der Gewinnung und Präparation der Embryos und Larven ist ein wichtiger erster Schritt in vielen Experimenten, die von Verhaltensbiologie bis Entwicklungsbiologie reichen. Dieses Video behandelt die Standardmethoden um Drosophila Embryos und Larven zu Gewinnen und zu Ernten, welche wichtige Verfahren für die Verwendung dieses vielfältigen Modellorganismus sind.
Durch die Untersuchungen von Drosophila Embryos konnten viele neue Einblicke in die Mechanismen, wie Gene die Entwicklung beeinflussen, erlangt werden. Diese reichen von der mRNA, die als Gradient in der Eizelle exprimiert wird, bis hin zu den Genen, welche das anterior-posteriore Segment des Körperplans bilden. Einige dieser Gene, wie die Homeobox Gene, sind streng konserviert zwischen diesem Insekt und den Säugetieren.
Die robusten Eigenschaften der Drosophila Embryos ermöglicht es ihnen den Kontakt mit rauen Bedingungen und Chemikalien zu überstehen, weshalb sie sehr praktisch für die Forschung sind.
Nach der Befruchtung kann eine weibliche Fliege bis zu 100 Embryonen pro Tag legen, welche nach 12-15 Stunden als Larve schlüpfen.
Um mit den Drosophila Embryos zu arbeiten, müssen sie zuerst gesammelt werden.
Embryos werden in sogenannten Eilegekammern, die oft auch „Eilegebecher“ genannt werden, gewonnen.
Um die Eilegekammer herzustellen, macht man zuerst Löcher in ein Behältnis, oder man schneidet ein Stück davon aus, und bedeckt es mit einem porösen Material für die Belüftung. Dann braucht man eine Apfel- oder Traubensaft-Agarplatte, die man mit Hefepaste bestreicht, und in der Mitte zerkratzt. Die Hefepaste führt zu dem Eierlegen.
Nun gibt man schnell Fliegen zu der Eilegekammer hinzu, dreht die Kammer um (so dass die Platte auf dem Boden steht), und inkubiert diese. Nach der gewünschten Inkubationszeit dreht man die Eilegekammer um und schlägt sie ein paar Mal auf die Laborbank. Die Fliegen fallen dann auf den Boden und sind kurzzeitig desorientiert. Nun ersetzt man die alte Agarplatte mit einer frischen Agarplatte, auf der auch Hefepaste ist. Um die Embryos im besten Alter zu sammeln, sollte man die Platten etwa alle 1-3 Stunden austauschen.
Die Platten enthalten hunderte von Embryos, speziell neben den Kratzern und der Hefe. 20 Fliegen beider Geschlechter sollten 100-200 Embryos pro Stunde produzieren. Nun können die Embryos geerntet werden.
Die Arbeitsgeräte, die man für die Embryogewinnung braucht sind ein Durchschlag oder ein Sieb, welche sehr in Größe und Komplexität variieren können, ein Pinsel und destilliertes Wasser.
Zuerst lockert man die Embryos, indem man die Platte in destilliertes Wasser legt. Nun bürstet man die Oberfläche sanft mit einem Pinsel. Danach filtert man das Wasser aus, indem man die Mischung durch ein Sieb gibt. Nun wäscht man die Embryos mit Wasser.
Dem Waschen folgt oft das Dechorionieren – also dem Entfernen der harten, äußeren Membran, oder dem Chorion.
Das Dechorionieren kann von Hand durch das Sezieren des Embryos aus dem Chorion stattfinden. Alternativ können die Embryos auch in eine 50% Bleichlösung gelegt werden. Es dauert 2-10 Minuten bis sich das Chorion zersetzt hat, was man durch das Verschwinden des dorsalen Anhangs erkennt. Nun wäscht man die Embryonen gründlich mit destilliertem Wasser, um sicherzustellen, dass der „nackte“ Embryo nicht von der Bleichlösung beschädigt wurde. Die Dechorionierung ist eine wichtige Voraussetzung um eine Mikroinjektion oder Echtzeitmikroskopie auszuführen.
Nun das wir etwas über die Embryobiologie, das Sammeln und das Ernten wissen, beschreiben wir das nächste Stadium in dem Drosophila Lebenszyklus: die Larve.
Drosophila Larven durchlaufen 3 Stadien. Das erste Stadium dauert einen Tag, das zweite Stadium dauert nochmals einen Tag, und das dritte Stadium dauert zwei weitere Tage. Larven im ersten oder zweiten Stadium findet man im Futter des Behältnisses 1-3 Tage nachdem man das Kreuz angesetzt hat. Am 4. Tag migrieren die Larven im dritten Stadium an die Seiten des Behältnisses, wo sie sich schließlich verpuppen, und somit Puppen genannt werden.
Larven werden oft wegen ihrer Imaginalscheiben für Experimente benutzt. Imaginalscheiben sind teilweise entwickelte Organe, welche später ganze Teile der erwachsenen Fliege darstellen. Zum Beispiel wird eine Imaginal- Augenscheibe zu dem Auge der erwachsenen Fliege, Antennen-Scheiben werden zu Antennen, und die Imaginal- Flügelscheiben werden zu Flügeln. Das Untersuchen der Imaginalscheiben in Drosophila hat zu wichtigen Entdeckungen geführt, wie zum Beispiel der Funktion der Homeobox Gene in der Segmentierung.
Die Larvengewinnung ist einfacher als die Gewinnung der Embryos, da man die Fliegen nicht in spezielle Behausungen überführen muss.
Einzelne Larven können mit einer Pinzette oder einem Spatel entnommen werden. Wenn man eine größere Anzahl von Larven im Frühstadium benötigt, kann man auch als alternative Methode eine Sukroselösung benutzen, welche eine höhere Dicht als die Larven hat, und auf der die Larven dann schwimmen.
Man gibt die Sukroselösung zu dem Behältnis, auf welcher dann die Larven schwimmen. Das Futter löst man, indem das Behältnis auf eine rotierende Platte gestellt wird. Dann werden die Larven mit einer Bürste oder einer Pipette für Experimente entnommen.
Nun das wir Sammel- und Erntemethoden für Embryos und Larven besprochen haben, schauen wir uns an, wie diese in Experimenten genutzt werden.
Da sie mobil sind, können Drosophila Larven für verhaltensbiologische Experimente benutzt werden.
Hier sieht man ein „Krabbelexperiment“, in welchen das Bewegungsverhalten der Drosophila bei bestimmten Bedingungen gemessen wird. Mit dem Krabbelexperiment misst man die Entfernung, welche die Larve zurücklegt, um zum Beispiel Effekte eines Medikaments auf den Bewegungsapparat zu beobachten. Die gewonnenen Larven werden in eine Medikament-Sukroselösung eingetaucht, von welcher man erwartet, dass sie deren Beweglichkeit einschränkt.
Mikroinjektionen werden ausgeführt um genetisch modifizierte Fruchtfliegen, auch als transgene Fliegen bekannt, herzustellen. Dafür fügt man spezielles genetisches Material als kreisförmiges DNA Plasmid ein.
Diese Embryos werden dechorioniert, indem man sie auf einem doppelseitigen Klebeband hin und herrollt, so dass Chemikalien sie nicht beschädigen. Embryonen können dann mit Plasmiden transfiziert werden, die Proteine, wie beispielsweise Tubulin, das an ein fluoreszentes Reporterprotein wie GFP gebunden ist, kodieren. Danach kann man Experimente machen, in denen man Prozesse wie die Mitose in transgenen Fliegen visualisiert.
Embryos können auch benutzt werden, um die Anwesenheit von bestimmten Transkripten durch Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung nachzuweisen.
In diesem Experiment werden ganze Embryos auf die Anwesenheit eines bestimmten mRNAs Transkripts hin mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Embryos werden mit einer biphasischen Lösung dechorioniert, und damit für die Einfärbung vorbereitet. Die „nackigen“ Embryos sind auf der unteren Schicht. Nach der Immunofluoreszensfärbung kann die Anwesenheit des gewünschten Proteins mit der Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden.
Das war die Einführung in das Sammeln und Ernten von Embryos und Larven von JoVE. Wir haben das Sammeln, die Ernte und die Vorbereitung von Embryos und Larven, und einige wichtige Anwendungen mit Hinsicht auf die frühe Entwicklung von Organismen, wiederholt. Danke Fuer Eure Aufmerksamkeit!
