Die wichtigen Entdeckungen, die in Saccharomyces cerevisiae gemacht wurden, wie beispielsweise die Zellzyklusregulation, Telomerase Aktivität und Autophagie, haben gezeigt, dass diese Hefeart ein wertvoller Modellorganismus für die Forschung ist.
Hefen können einfach kultiviert werden, und Hefeplasmide und Hefestämme sind kommerziell erhältlich. Auch wenn es relativ billig ist Hefe zu kultivieren, ist die richtige Haltung wichtig, um erfolgreiche Experimente durchzuführen. Dieses Video gibt einen Einblick in die Verfahren, um Hefezellen zu kultivieren und S. cerevisiae Stämme im Labor zu erhalten.
In der Biologie geben Wachstumskurven die Veränderung einer Population in einer bestimmten Zeiteinheit an. In der Hefe wird die Wachstumskurve durch die graphische Darstellung der optischen Dichte (OD) einer Zellkultur bei 600 nm auf der y-Achse und der Zeit auf der x-Achse erstellt. Die optische Dichte, oder Absorbanz, ist das logarithmische Verhältnis der in die Hefesuspension eintretenden Lichtintensität zu der durchgehenden Lichtintensität. Die OD einer bestimmten Lichtwellenlänge kann mit einem Spektrophotmeter gemessen werden.
Wenn man mit Hefe arbeitet, erstellt man eine Wachstumskurve durch das Messen der OD Werte bei verschiedenen Zeitintervallen. Die Hefe Wachstumskurve wird in 3 verschiedene Phasen unterteilt: die Anlaufphase, die exponentielle Phase und die stationäre Phase. In der Anlaufsphase passen sich die Zellen an die Umgebung an, wachsen von der Größe her, teilen sich aber nicht. In der exponentiellen Phase teilen sich die Zellen aktiv, was zur Verdopplung der Zellzahl führt. Wenn die vorhandenen Nährstoffe aufgebraucht sind, geht das Wachstum in die stationäre Phase über, in welcher sich die Zellteilung verlangsamt und die Population konstant bleibt.
Mit der Wachstumskurve kann die Verdopplungszeit mit der folgenden Gleichung berechnet werden: OD1 und OD2 sind die Messungen der optischen Dichte, und T1 und T2 ist die Zeit zwischen den Messungen. Die Verdopplungszeit ist definiert als die Zeit, in welcher sich die Zellpopulation mit Hinsicht auf die Anzahl der Zellen verdoppelt. Die Berechnung für zwei OD Werte in der exponentiellen Wachstumsphase, die 0.2 und 0.5 betragen, wird hier gezeigt. Für wildtyp Hefe sollte die Verdopplungszeit etwa 90 Minuten betragen.
Die Verdopplungszeit zu kennen ist vorteilhaft, denn man kann Experimente darauf beruhend für den Tag planen.
Nun das wir uns mit dem A und O der Hefe Wachstumskurve beschäftigt haben, gehen wir ins Labor und schauen uns an, wie man Vorbereitungen trifft, um mit Hefe zu arbeiten. Die Hauptbestandteile des reichhaltigen Hefewachstumsmediums - auch als Hefefutter bekannt – sind: Hefeextrakt, Pepton und eine Zuckerquelle. Der Hefeextrakt enthält Hefezellbestandteile und stellt Aminosäuren, Vitamine, Kohlenhydrate, und andere Nährstoffe für das Wachstum zur Verfügung. Pepton wird von Tierfleisch oder Milch gewonnen und ist die Hauptquelle von Aminosäuren in dem Hefemedium. Eine Zuckerquelle, normalerweise Glukose, wird hinzu gegeben, um die wachsenden Zellen mit Energie zu versorgen.
Nachdem man den Hefeextrakt und das Pepton in Wasser aufgelöst hat, sterilisiert man die Mischung durch Autoklavieren. Um Hefe-Mediumplatten herzustellen, gibt man Agar zu dem flüssigen Medium, füllt es in Platten, und lässt es bei Zimmertemperatur fest werden. Diese Platten können benutzt werden, um Ausstriche von Hefestämmen herzustellen, die dann zu Hefekolonien werden.
Nun dass wir unser Medium vorbereitet haben: wie kultivieren wir die Hefe von Null angefangen? Zuerst sollte man sicherstellen, dass alle Instrumente, Lösungen, und Medien steril sind.
Danach nimmt man eine Platte, um Hefezellen auszustreichen. Nicht diese Art des Streichens! Streichen ist der Prozess, durch welchen flüssige Hefekulturen mit einem sterilen Instrument auf einer Agarplatte verteilt werden, wie hier zu sehen ist. Um die Ausstriche bilden sich vereinzelte Kolonien, welche von einer einzigen Hefezelle abstammen, welche dann selektiert werden kann, um eine reine Hefezellpopulation zu erhalten. Wenn die Platten ausgestrichen sind, dreht man sie um und platziert sie für 2-3 Tage in einem 30°C Inkubator. Das ist die optimale Temperatur für Hefewachstum.
Wenn sich die Kolonien gebildet haben, impft man die Hefezellen in einem kleinen Volumen von Wachstumsmedium. Impfen bedeutet eine einzelne Kolonie in Medium zu transferieren und es kurz zu vermischen. Die Kultur wird dann für 48 Stunden in einem 30°C Schüttler oder Rotierer inkubiert.
Um größere Zellkulturen herzustellen, misst man erst die OD600 der 2 Tage alten Hefekultur mit einem Spektrophotometer. Nun stellt man die angemessenen Verdünnungen her, so dass die OD am Anfang zwischen 0.1-0.2 beträgt. Nach dem Verdünnen der Zellen platziert man den Behälter in einen 30°C Schüttler und kultiviert die Zellen bis zu der gewünschten OD.
In der nächsten wichtigen Lektion nach der Kultivierung der S. cerevisiae, zeigen wir wie sie für die zukünftige Benutzung gelagert wird. Hefe, die auf Platten gewachsen ist, kann bis zu 3 Monate bei 4°C gelagert werden. Wenn man jedoch mit einer frischen Kultur anfangen will, sollte man vor der Impfung eine frische Platte ausstreichen.
Um Hefestämme langfristig zu lagern, verteilt man die Zellen in Kryogefäße, die Glycerol enthalten. Die Zellen können dann bei -80°C gelagert werden, wo sie für mehrere Jahre erhalten bleiben.
Nun dass ihr Experten für die Hefekultivierung seid, schauen wir uns an wie wir diese wichtigen Verfahren für die wissenschaftliche Forschung anwenden können. Zellen in der stationären Phase können benutzt werden, um Gene zu untersuchen, welche die genomische DNA Instabilität während der Alterung regulieren. Dieses Video zeigt die Auswahl der Zellen von einer 3 Tage alten Kultur. Diese werden dann auf Selektiermedium gewachsen, auf welchem normale Hefezellen nicht wachsen können. Nur Zellen, welche eine Mutation erworben haben, können auf dieser Platte Kolonien bilden. Die Zahl der Kolonien auf der Platte ist proportional zu dem Level der genomischen Instabilität in der Kultur.
Ein anderes Beispiel, um das Altern zu untersuchen, ist die chronologische Lebensspanne der Hefezellen zu analysieren. Beim chronologischen Altern verringert sich die Zellviabilität in einer bestimmten Zeit, was durch die Kultivierung von flüssigen Kulturen bestimmt werden kann. In diesem Video lädt ein Wissenschaftler verschiedene Kulturen in ein Spektrophotometer, um die Zellwachstumskurven zu erstellen, welche dabei helfen die Viabilität zu bestimmen.
Wildtyp Hefezellen in der exponentiellen Phase sind gesunde und normale Zellen, die man benutzen kann, um eukaryotische Organellen, wie zum Beispiel die Ribosomen, zu untersuchen. In diesem Video kann man sehen, wie ein Zelllysat, von Zellen in der exponentiellen Phase auf einen Sukrosgradienten geladen wird. Danach werden die Zellen zentrifugiert, um die Ribosomen zu sedimentieren, und die Absorbanz wird gemessen, um das Ribosomenprofil zu erstellen.
Das war die Einführung von JoVe in die Erhaltung und Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae. In diesem Video haben wir die Hefe Wachstumskurve wiederholt und gezeigt wie man Zellkulturen wächst und einen Hefestamm erhält. Danke für eure Aufmerksamkeit, und vergesst nicht das Video an eure Freunde weiterzuempfehlen.
