Die Autoren sind dankbar für die experimentelle Hilfe bei der Entwicklung der Methode der intralymphatische Immunisierung bei Mäusen von Iris Erdmann, Barbara von Beust und Julia Maria Martínez-Gómez. Vielen Dank auch an Maggy Arras und Nikola Cesarovic, dass Sie uns nutzen ihre Operationssaal für diese Video-Produktion.

1. Anästhesie Mäuse <ol><li> Bereiten Sie die Anästhetika durch Mischen von Ketamin (dissoziative Anästhetikum) und Xylazin (Sedativum und Analgetikum) in Kochsalzlösung. Die Konzentrationen von Ketamin und Xylazin in der fertigen Lösung werden 12,5 und 2 mg / ml. </li><li> Injizieren Anästhetika an die Mäuse durch intraperitoneale Verabreichung unter Verwendung einer Spritze mit einer Nadel von 25-30 G. Verwenden Sie 0,1 ml/10 g Körpergewicht. </li><li> Tragen Sie eine Augensalbe, um die Mäuse die Augen, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. </li><li> Sicher, dass die Maus ausreichend durch Kneifen seinem Fuß-oder Zehen mit der Zange betäubt. Wenn die Maus nicht mit Reflexen auf die Prise zu reagieren, Operation fortzufahren. Wenn die Maus reagiert auf die Prise mit Reflexen oder Muskelkontraktionen, warten Sie 1-2 Minuten und wiederholen Sie den Pinch-Test. Wenn die Maus immer noch reagiert, ersetzen Sie die Maus mit einem neuen Tier, und wiederholen Sie die Prozeduren ab Schritt 1.2 ab. </li></ol> 2. Chirurgische ichncision der Leistengegend der Maus <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken. </li><li> Befeuchten Sie ein Leistenbereich mit Desinfektions Ethanol (70%). Um eine bessere Desinfektion bereitzustellen, kann der Leistenregion rasiert werden, um Fell vor der Desinfektion mit Ethanol zu entfernen. </li><li> Nehmen Sie die Hinterbein und beugen das Hüftgelenk zu einem etwa 90 °-Winkel des Hüftgelenks zu produzieren. </li><li> Mit einer gebogenen Pinzette microdissecting, nehmen Sie die Maus Haut in der Leistengegend, wo das Hüftgelenk gebeugt und leicht nach oben ziehen die benetzte Haut. </li><li> Während bis halten die Haut mit der Zange, schneiden Sie einen kleinen Schnitt (&lt;5 mm) durch die Haut mittels chirurgischer Schere. </li><li> Setzen Sie die Spitze der geschlossenen Schere in der Schnittführung und den Schnitt weiter zu öffnen, durch das Öffnen der Schere, während es in den Schnitt halten. Dies bewirkt, dass die Haut zu reißen und sollte einen Durchmesser von weniger als 10 mm zu produzieren. Hinweis: Eine Kaltlichtquelle mit flexiblem Lichtleiter verwendet werden, um die Sichtbarkeit zu verbessern. In älterenMäuse, besonders Männern kann die Identifizierung des Lymphknotens schwierig, da viel Fettgewebe in der Leiste sein. </li></ol> 3. Intralymphatische Injection <ol><li> Bereiten Sie eine Spritze (0,5 ml oder weniger) mit einem 28-30 G Injektionsnadel, eine kurze Abschrägung kann bevorzugt sein, eine lange Kegel sein. Saugen Sie 10 ul der Impfstoff injiziert werden und sicherzustellen, dass die Spritze ist frei von Luft. </li><li> Lokalisieren der Leistenlymphknoten mit Hilfe der gekrümmten Pinzette und der Spitze der geschlossenen Schere. Die Lymphknoten werden im Fettgewebe mehr weißlich grau angezeigt und kann weiter durch zu-und abführenden Kapillaren Betreten und Verlassen der Lymphknoten identifiziert werden. </li><li> Immobilisieren, den Lymphknoten, indem sie zwischen den Zweigen der gebogenen Pinzette. </li><li> Nehmen Sie die Spritze und die Nadel in den Lymphknoten mit der Kegel nach oben, machen, dass der ganze Kegel in den Lymphknoten. </li><li> Spritzen Sie die Impfstoff (10 ul). Wenn die Lymphe Nickene Schwellungen (Sprengung), kann die Injektion erfolgreich angenommen werden. Wenn die Nadel nicht tief genug in die Lymphknoten platziert, können einige oder die gesamte Impfstoff austreten und nicht in die Lymphknoten. Wenn die Nadel zu tief eingeschoben, wird der Impfstoff subkutan injiziert unterhalb der Lymphknoten erscheinen. Im Falle der letzteren, wiederholen Sie die Injektion oder ersetzen Sie die Maus mit einem neuen unbehandelten Maus. </li></ol> 4. Das Schließen der Inzision durch Naht <ol><li> Öffnen Sie eine Packung von sterilen OP-Naht. </li><li> Fassen der Nähnadel mit einem Nadelhalter an dem distalen Teil des Nadelkörpers. Ziehen Sie die Nadelhalter, indem Sie ihn bis zu den ersten Ratschen Fänge. </li><li> Fassen der Haut auf einer Seite des Einschnitts mit einer Pinzette (je nach der Präferenz des Operateurs, Zahn-oder Zahn un-Zange oder Haken Haut verwendet werden können). Führen Sie die Nadel ca. 2-3 mm vom Rand des Einschnitts, der Eingabe von der Außenseite der Haut. </li><li> Loosen Halt der Haut mit der Zange und erreichen die gegenüberliegende Seite des Einschnitts mit der Zange. Führen Sie die Nadel ca. 2-3 mm vom Rand des Einschnitts, der Eingabe von der Innenseite der Haut. </li><li> Lösen Sie die Nadelhalter und fassen Sie den Nadelende mit der Zange. Ziehen Sie die Nadel mit der Lauffläche durch die Haut, so dass eine bequeme Länge der Lauffläche außerhalb des ersten Nadel Einfügemarke (wenn mehrere Mäuse behandelt werden sollen, lassen Sie einen kürzeren Ende, 5-10 Mäuse können mit einer Nähnadel betrieben werden / treten). </li><li> Machen Sie den bevorzugten Knoten nach Standardprotokollen Chirurg. Eine Masche ist ausreichend, wenn der Schnitt nicht größer ist als 10 mm. Für größere Einschnitte, einen zweiten Stich. </li></ol> 5. Post-operative Behandlung <ol><li> Platzieren Sie die Maus in den Käfig und Abdeckung mit Gewebe warm zu halten. Bei der Behandlung von mehreren Mäusen, legen Sie sie nahe beieinander warm zu halten. Alternativ legen Sie die Mäuse an einem warmen Kissen, bis sie aufgewachtauf. </li><li> Beachten Sie die Mäuse, bis sie aufwachen. </li><li> Beachten Sie die Mäuse täglich mit Bezug auf die Heilung sowie andere klinische Symptome, wie Wundinfektionen gewickelt. Die Wunde wird in der Regel innerhalb von zwei Tagen ausreichend geschlossen und innerhalb von sieben Tagen nach dem Verfahren geheilt. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+MHC+class+II+pathway+of+antigen+presentation+enhances+immunogenicity+and+safety+of+allergen+immunotherapy.">Targeting the MHC class II pathway of antigen presentation enhances immunogenicity and safety of allergen immunotherapy.</a> Allergy. 64, 172-178 (2009).</li><li>Mohanan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+routes+affect+the+quality+of+immune+responses:+A+cross-sectional+evaluation+of+particulate+antigen-delivery+systems.">Administration routes affect the quality of immune responses: A cross-sectional evaluation of particulate antigen-delivery systems.</a> J. 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Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).</li><li>Schwaab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+immunologic+effects+of+intranodal+autologous+tumor+lysate-dendritic+cell+vaccine+with+Aldesleukin+(Interleukin+2)+and+IFN-{alpha}2a+therapy+in+metastatic+renal+cell+carcinoma+patients.">Clinical and immunologic effects of intranodal autologous tumor lysate-dendritic cell vaccine with Aldesleukin (Interleukin 2) and IFN-{alpha}2a therapy in metastatic renal cell carcinoma patients.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4986-4992 (2009).</li><li>Senti, G., Johansen, P., Kundig, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intralymphatic+immunotherapy.">Intralymphatic immunotherapy.</a> Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 9, 537-543 (2009).</li><li>Catron, D. M., Itano, A. A., Pape, K. A., Mueller, D. L., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+first+50+hr+of+the+primary+immune+response+to+a+soluble+antigen.">Visualizing the first 50 hr of the primary immune response to a soluble antigen.</a> Immunity. 21, 341-347 (2004).</li><li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node.">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nat. Immunol. 4, 733-739 (2003).</li><li>Johansen, P., Mohanan, D., Martinez-Gomez, J. M., Kundig, T. 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TMK ist als Erfinder der Patente, die sich mit intralymphatische Immuntherapie beim Menschen benannt. TMK ist wissenschaftlicher Berater und hat die Reisekosten von ImVisioN GmbH, Cytos Biotechnology, Mannkind Corporation und XBiotech USA Inc. PJ hat kein Interesse Konflikt offen zu legen empfangen.

Immunisierung und intralymphatische Immuntherapie hat sich gezeigt, zur Stimulation der Antikörperantworten und den beiden T-Zell-Reaktionen geeignet. Wie in diesem Video-Beitrag gezeigt hat, ist die intralymphatische Verfahren der Impfung eine schnelle und einfache Methode für die Stimulierung starke Immunantwort in Mäusen. Ein ausgebildeter Chirurg kann das Verfahren während 3-4 min durchzuführen. Die Sitzung kann auch zwischen zwei Chirurgen, wo man in der Regel tun, Anästhesie und die Naht und die zweite Chiru...

Impfstoffe werden typischerweise zur Stimulation von Immunantworten subkutan oder intramuskulär injiziert. Der Erfolg dieses Verfahrens erfordert effiziente Entwässerung des Impfstoffs Lymphknoten, wo Antigen-präsentierenden Zellen mit Lymphozyten zur Erzeugung von T-und B-Zellantworten zu interagieren. Darüber hinaus ist die Stärke und die Art der Immunantwort induziert auch von der Dichte oder Häufigkeit solcher Wechselwirkungen sowie der Mikroumgebung selbst, insbesondere der Gehalt an Cytokinen. Da nur ein kleiner Bruchteil eines Impfstoffs in eine periphere Gewebe injiziert in einen Lymphknoten erreicht, Impfungen von Mäusen und Menschen durch direkte Injektion des Impfstoffes in den Lymphknoten, dem Ort wurden Immunantworten erzeugt werden, durchgeführt. Beim Menschen wird das Verfahren durch Ultraschall, ein Verfahren auch für die Verabreichung von Bildgebungsmittel zur Visualisierung und Diagnose in der lymphatischen Systems verwendet geführt. Bei Mäusen ist das Verfahren invasiv. Hier eine kleine (5-10 mm) incision in der Leistengegend des betäubten Tieren 1 erfolgt, wird der Lymphknoten lokalisiert und mit einer Pinzette immobilisiert, und ein Volumen von 10-20 ul der Impfstoff wird unter Sichtkontrolle injiziert; 10 ul zur ersten Injektionen verwendet und bei jungen Mäusen mit kleinen Lymphknoten, während 20 ul kann in Lymphknoten von älteren oder bereits grundiert Mäuse, die größere Lymphknoten injiziert werden. Der Schnitt kann mit einem einzelnen Stich mit chirurgischen Nähten geschlossen werden. Durch dieses Verfahren haben Mäuse mit Plasmid-DNA 2,3 Boten-RNA 4, 1,3,5,6-Peptid, Protein 7-10, 11-Partikel, Bakterien 12 sowie Hilfsstoffe 7,13 und einer starken Verbesserung der Immun geimpft Antworten gegen alle Arten von Impfstoffen beobachtet worden. Die intralymphatische Verfahren der Impfung besonders geeignet in Situationen, in denen herkömmliche Impfung produziert nicht genügend Immunität oder wo die Menge der zur Verfügung stehenden Impfstoff begrenzt ist, oder ist very teuer. Beim Menschen hat die intralymphatische Immunisierungsverfahren zur Allergiepatienten 14,15 oder um Patienten mit Krebs 16-21 angewandt. Obwohl die aktuelle Vorstellung ist, dass die intralymphatische Methode ist invasiv als andere injizierbare Methoden wie intramuskuläre und subkutane Injektionen, die Schmerzwahrnehmung nicht höher als nach einer Venenpunktion 15. Es wird erwartet, dass intralymphatische Impfung eine Alternative oder Ergänzung zu anderen Methoden der prophylaktischen und therapeutischen Impfungen besonders geworden. Dieser Artikel beschreibt im Detail, wie das Verfahren der intralymphatische Impfung bei Mäusen durchgeführt. Alle beschriebenen Verfahren wurden von der Kantonstieragentur Zürich genehmigt und durchgeführt nach Schweizer Bundesrichtlinien und Richtlinien über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Ketamine (Ketasol-100)</td>
			<td style="width:135px;">Graeub AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Anesthetics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Xylazine (Rompun)</td>
			<td style="width:135px;">Bayer, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Anesthetics</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Viscotears Eye-Gel</td>
			<td style="width:135px;">Novartis, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To keep eyes from drying out during anesthesia.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">BD Micro-Fine 0.5 ml</td>
			<td style="width:135px;">BD Medical, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>29 G Insulin syringes with permanently attached needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">6-0 Dermalon Monofilament nylon</td>
			<td style="width:135px;">Covidien, MA, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For sutures (0.7 metric, 18G, 45 cm, Blue)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Curved forceps, 4.5 inch</td>
			<td style="width:135px;">Polymed, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For incision and holding of lymph node</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Straight surgical scissors, 4.5 inch</td>
			<td style="width:135px;">Polymed, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Needle holder, 5.5 inch</td>
			<td style="width:135px;">Polymed, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To close incision with suture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
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intralymphatic immunotherapy and vaccination in mice

Impfstoffe werden typischerweise zur Stimulation von Immunantworten subkutan oder intramuskulär injiziert. Der Erfolg dieses erfordert effiziente Entwässerung des Impfstoffs Lymphknoten wo Antigen-präsentierenden Zellen mit Lymphozyten zur Erzeugung des gewünschten Immunantworten interagieren. Die Stärke und die Art der Immunantwort induziert auch von der Dichte oder Häufigkeit der Wechselwirkungen sowie der Mikroumgebung, insbesondere der Gehalt an Cytokinen. Da nur ein geringer Bruchteil der peripher injiziert Impfstoffe die Lymphknoten erreicht wurden Impfungen von Mäusen und Menschen durch direkte Injektion des Impfstoffes in die inguinalen Lymphknoten, dh intralymphatischer Injektion durchgeführt. Beim Menschen wird das Verfahren durch Ultraschall geführt. Bei Mäusen wird eine kleine (5-10 mm) Einschnitt in der Leistengegend des anästhesierten Tieren, die Lymphknoten lokalisiert und mit einer Pinzette immobilisiert und ein Volumen von 10-20 ul der Impfstoff unter Sichtkontrolle injiziert.Der Einschnitt wird mit einer einzelnen Masche mit chirurgischen Nähten verschlossen. Mäuse wurden mit Plasmid-DNA, RNA, Peptid-, Protein-, Partikel und Bakterien sowie Adjuvantien geimpft und starke Verbesserung der Immunantwort gegen alle Arten von Impfstoffen beobachtet. Die intralymphatischen Impfverfahren ist besonders geeignet in Situationen, in denen herkömmliche Impfung erzeugt unzureichende Immunität oder wenn die Menge der verfügbaren Impfstoff ist begrenzt.

Das Verfahren von intralymphatische Injektionen bei Mäusen trotz der chirurgischen Natur, ist einfach und relativ schnell. Eine ausgebildete Person kann das Verfahren in 3-4 min durchzuführen. Der Einschnitt, der mit einer Masche geschlossen heilt typischerweise innerhalb von zwei Tagen (Abbildung 1) Intralymphatischer Impfung oder Immunisierung mit mRNA durchgeführt wurde, Plasmid-DNA, Peptiden, Proteinen, Viren und Bakterien. Fig. 2 veranschaulicht die ...

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Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Prophylaktischen und therapeutischen Impfung oft nicht starke Immunantworten aufgrund Woche Entwässerung des Impfstoffs zu stimulieren, um Knoten und folglich schlechte Beteiligung von Immunzellen Lymphe. Durch direkte Injektion des Impfstoffes in Lymphknoten, sogenannte intralymphatischer Injektion, die Wirksamkeit des Impfstoffes kann stark verbessert werden, und Impfstoffdosen verringert werden.

Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.9K Aufrufe.  University Hospital Zurich.  Prophylaktischen und therapeutischen Impfung oft nicht starke Immunantworten aufgrund Woche Entwässerung des Impfstoffs zu stimulieren, um Knoten und folglich schlechte Beteiligung von Immunzellen Lymphe. Durch direkte Injektion des Impfstoffes in Lymphknoten, sogenannte intralymphatischer Injektion, die Wirksamkeit des Impfstoffes kann stark verbessert werden, und Impfstoffdosen verringert werden. 

Serie: Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be established. The method described below, prepared in accordance with Good Manufacturing Process (GMP) guidelines, is an optimization of the most common ex vivo preparation method for generating large numbers of DCs for clinical studies 2.
Our method utilizes the synthetic TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic Acid-poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) to stimulate the DCs. Our previous study established that Poly-ICLC is the most potent individual maturation stimulus for human DCs as assessed by an upregulation of CD83 and CD86, induction of interleukin-12 (IL-12), tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), and type I interferons (IFN), and minimal interleukin 10 (IL-10) production.
DCs are differentiated from frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained by leukapheresis. PBMCs are isolated by Ficoll gradient centrifugation and frozen in aliquots. On Day 1, PBMCs are thawed and plated onto tissue culture flasks to select for monocytes which adhere to the plastic surface after 1-2 hr incubation at 37 &deg;C in the tissue culture incubator. After incubation, the lymphocytes are washed off and the adherent monocytes are cultured for 5 days in the presence of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) to differentiate to immature DCs. On Day 6, immature DCs are pulsed with the keyhole limpet hemocyanin (KLH) protein which serves as a control for the quality of the vaccine and may boost the immunogenicity of the vaccine 3. The DCs are stimulated to mature, loaded with peptide antigens, and incubated overnight. On Day 7, the cells are washed, and frozen in 1 ml aliquots containing 4 - 20 x 106 cells using a controlled-rate freezer. Lot release testing for the batches of DCs is performed and must meet minimum specifications before they are injected into patients.

The most commonly used method for generating large numbers of autologous dendritic cells (DCs) for use in tumor immunotherapy is described. The method uses IL-4 and GM-CSF to differentiate DCs from monocytes. The immature DCs are stimulated to mature and then loaded with antigens before they are injected back into the patient.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases reported annually. The control of RABV circulation in wildlife reservoirs is typically accomplished by a strategy of oral rabies vaccination (ORV). Currently no wildlife ORV program exists in Puerto Rico. Research into oral rabies vaccines and various bait types for mongooses has been conducted with promising results. Monitoring the success of ORV relies on estimating bait uptake by target species, which typically involves evaluating a change in RABV neutralizing antibodies (RVNA) post vaccination. This strategy may be difficult to interpret in areas with an active wildlife ORV program or in areas where RABV is enzootic and background levels of RVNA are present in reservoir species. In such situations, a biomarker incorporated with the vaccine or the bait matrix may be useful. We offered 16 captive mongooses placebo ORV baits containing ethyl-iophenoxic acid (et-IPA) in concentrations of 0.4% and 1% inside the bait and 0.14% in the external bait matrix. We also offered 12 captive mongooses ORV baits containing methyl-iophenoxic acid (me-IPA) in concentrations of 0.035%, 0.07% and 0.14% in the external bait matrix. We collected a serum sample prior to bait offering and then weekly for up to eight weeks post offering. We extracted Iophenoxic acids from sera into acetonitrile and quantified using liquid chromatography/mass spectrometry. We analyzed sera for et-IPA or me-IPA by liquid chromatography-mass spectrometry. We found adequate marking ability for at least eight and four weeks for et- and me-IPA, respectively. Both IPA derivatives could be suitable for field evaluation of ORV bait uptake in mongooses. Due to the longevity of the marker in mongoose sera, care must be taken to not confound results by using the same IPA derivative during consecutive evaluations.

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

We offered captive mongooses placebo oral rabies vaccine baits with ethyl or methyl iophenoxic acid as a biomarker and verified bait uptake using a novel liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

Analyse von Iophenoxic Acid Analoga in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera zur Verwendung als orale Tollwut-Impfung Biologischer Marker

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...