Wir danken Dr. Yves L. Janin für seine wertvollen Kommentare und Anregungen. Wir möchten HH Gad für CHIK / Ren und C. Combredet für ihre technische Unterstützung danken. Pasteur Mala infectieuses (Programm STING zu POV-und HM-- Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur, dem Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), dem Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), dem Institut Carnot unterstützt L), der Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programm STING 2.0 auf POV) und der &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Chemical Library Project, Zuschüsse Nr. 06-222 I / R und I 09-1739 / R HM-L.). Die Arbeit an CHIKV / Ren wurde von den Projekt ArbOAS unterstützt (ANR Zuschuss-INTB 2010-1601-02).

1. Herstellung von 96-Well-Platten mit Tochter Verbindungen <ol><li> Bewegen Mutter 96 Vertiefungen-Platten, die 10 mM Stammlösungen von chemischen Verbindungen in DMSO von -20 ° C bis Raumtemperatur. 5x verdünnen Verbindungen in DMSO Zwischen 96-Well-Platten bei Verdünnung 2 mM zu erhalten. Verdünnung wird durch Pipettieren von 5 &amp;mgr; l in 20 &amp;mgr; l DMSO und Mischen gelöst. </li><li> Je 1 ul von Verdünnungsplatten in trockene Brunnen aus weißem, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese erste Reihe von Tochterplatten (D1) wird verwendet, um die Toxizität der Verbindungen bei einer Endkonzentration von 20 uM zu bewerten. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung. </li><li> Verdünnen Verbindungen wieder 1.10 durch Pipettieren von 4 ul Verdünnungsplatten in 36 ul DMSO und Mischen. Je 1 ul in trockene Brunnen aus weißen, flachen Boden, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese zweite Gruppe von Tochterplatten (D2) wird verwendet, um die Hemmung der MV replicatio evaluierenn durch die Verbindungen in einer Endkonzentration von 2 uM. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Herstellung von Zellkulturen, um die Verbindung Toxizität ermitteln <ol><li> Wachsen HEK-293T-Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit stabilisierten L-Glutamin und 10% fötales Kälberserum (FCS), Streptomycin (100 ug / ml) und Penicillin (100 IU / ml). Die Zellen werden durch Trypsinierung alle 4-5 Tage passagiert und 1:10 verdünnt in einen frischen Kolben. Die Zellen sind in der log-Phase für Experimente sein. </li><li> Am Tag des Experiments zu erholen Zellen durch Trypsinierung und Zellzählung durchzuführen. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren und Resuspendieren sie bei 3 × 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich. </li><li> Über Zellen zu einem Trog, und werden 100 ul Zellsuspension in D1-Platten, die Stachel chemische Zusammensetzungunds. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig geschüttelt, um die Sedimentation zu verhindern. </li><li> Spike Kontroll-Wells A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 und G12 mit 1 ul DMSO. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die lebenden Zellen (keine Toxizität) eingesetzt werden. Spike Kontrollvertiefungen B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 und H12 mit 1 ul DMSO und 2,5 ul einer 0,5% IGEPAL Lösung, um Zellen zu töten. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die toten Zellen (hohe Toxizität) eingesetzt werden. </li><li> Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Herstellung von Zellkulturen durch rMV2/Luc Infizierte <ol><li> Wachsen und wieder Zellen, wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. Wieder resuspendieren Zellen bei 3 x 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich. </li><li> Optional: Ergänzung Kulturmedium mit Uridin bei 20 ug / ml. Hinweis: Bei der Kontrolle von chemischen Bibliotheken für virale replication-Inhibitoren scheint es, dass Verbindungen, die auf frühen Schritte der Pyrimidin-Biosynthese werden häufig getrennt 13,16,27,28. Die Zugabe von Uridin Kulturmedium dazu verwendet, um solche antiviralen Moleküle. In der Tat, dies effizient wieder her, wenn die virale Replikation aufwärts Enzyme der Pyrimidin-Biosynthese sind blockiert. </li><li> Sparen 01.10 Zellsuspension für Kontrollvertiefungen mit nicht-infizierten Zellen, und fahren Sie mit der Infektion mit Restvolumen. </li><li> Tauen Sie das entsprechende Volumen von rMV2/Luc Stammlösung. MV Stammlösungen sind in der Regel bei 10 6 -10 8 infektiöse Partikel pro ml. Kultur muss mit 0,1 infektiöse Teilchen rMV2/Luc pro Zielzellen, die mit 0,1 Multiplizität der Infektion (MOI) infiziert entspricht. Hinweis: rMV2/Luc von MV-Impfstoff (Schwarz-Stamm) abgeleitet ist und in einer Umgebung BSL2 manipuliert. </li><li> Fügen Sie den Virus auf Zellsuspension und vorsichtig mischen. Übertragen infizierten Zellen zu einem Trog, und werden 100&amp;mgr; l der infizierten Zellsuspension in den Spalten 2 bis 11 der D2-Platten, die Stachel chemischen Verbindungen. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig vorsichtig gemischt. </li><li> In den Spalten 1 und 12 werden 100 &amp;mgr; l nicht-infizierten Zellen ein gut auf zwei. Infizierte Zellen werden in den anderen Vertiefungen verteilt. </li><li> Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 4. Luciferase Aktivität Maßnahmen und Datenanalyse <ol><li> Entfernen D1 Platten aus dem Inkubator, und festzustellen, Zelllebensfähigkeit durch Zugabe von 50 ul Luciferase-basierte Lebensfähigkeit Reagenz direkt an Kultur Brunnen. Mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Lesen Platten mit einem Luminometer. Integrationszeit ist auf 100 ms pro auch gesetzt. </li><li> Entfernen D2 Platten aus dem Inkubator, und bestimmen Sie die Luciferase-Aktivität durch Zugabe von 50 ul der Luciferase-Substrat direkt an Kultur Brunnen. Inkubation für 6 min bei Raumtemperatur, und lesen Platten mit einem Luminometer, wie beschrieüber dem Bett. </li><li> Berechnen Sie einen Z&#39;-Faktor für jede Platte D1 der Toxizität Assay, um die Qualität des Bildschirms 29 zu rechtfertigen. Z &#39;= 1-3 * (σ + σ +-) / (μ + - μ-), wobei μ und σ + + entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für HEK-293T-Zellen, die mit DMSO allein (keine Toxizität), und μ-und σ-sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen mit IGEPAL behandelt, um Zellen zu töten Kultur Brunnen. Z &#39;voraussichtlich über 0,5, oder die entsprechende Platte wird verworfen. </li><li> Stellen Toxizität Schwelle bei μ + / 2. Entsorgen Sie Verbindungen mit Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (Abbildung 3A). </li><li> Berechnen Sie einen Z&#39;-Faktor für jede D2 Platte des antiviralen Test. Hier μ + σ + und entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für infizierte Zellen mit DMSO allein kultiviert und μ-σ-und sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für nicht-infizierte Zellen. Auch Platten mit Z &amp; #39; Werte unter 0,5 werden verworfen. </li><li> Berechnen Sie die Hemmung der Virusreplikation wie folgt: Prozentsatz der Hemmung = (μ + - Luciferase-Aktivität für die Verbindung X) / (μ + - μ-) * 100. Stellen Hemmschwelle bei 75%, und wählen Sie Verbindungen, die sowohl reduzieren Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (3B) und sind nicht giftig nach in 4.4 beschriebenen Kriterien. </li></ol> 5. Sekundärbildschirm Toxizität und Breitspektrum antiviralen Aktivität <ol><li> Stellen serielle 1:2 Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung in DMSO, ausgehend von 500 um bis 4 um (8 Verdünnungen). Füllen weiß, Barcode-Gewebekulturplatten mit 50 &amp;mgr; l Kulturmedium. 1 ul jeder Verbindung Verdünnung in Kulturvertiefungen. Zweimal wiederholen bis 3 Kulturplatten mit doppelten serielle Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung haben. </li><li> Vorbereitung 37,5 ml einer HEK-293T-Zellsuspension bei 6 x 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium, wie oben beschrieben (2.1 und 20,2). Dispense 2x 12,5 ml in Falcon-Röhrchen und infizieren Zellen entweder mit rMV2/Luc bei MOI = 0,1 oder rekombinanten CHIKV Renilla-Luciferase (CHIKV / Ren) Expression bei MOI = 0,2. Mischen durch Umdrehen. Hinweis: CHIKV / Ren ist aus einem Wildtyp-Stamm von CHIKV abgeleitet und sollte daher in einem BSL3 Umgebung manipuliert werden. Die Platten können aus BSL3 zu BSL1 einmal bewegt Renilla Substrat zur Kultur Brunnen hinzugefügt werden (siehe unten). </li><li> Geben Sie 50 ul von nicht-infizierten, rMV2/Luc-infected oder CHIKV / Ren-infizierten Zellen in Kulturplatten mit seriellen Verdünnungen von Hit-Verbindungen. Inkubiere 24 Stunden bei 37 ° C. </li><li> In 50 ul von Firefly Luziferase-Substrat zu Firefly Luziferase Aktivität in rMV2/Luc-infected Brunnen zu bestimmen. In 50 ul Renilla Luciferase Substrat Renilla Luciferase-Aktivität in CHIKV / Ren-infizierten Brunnen zu bestimmen. Schließlich, fügen Sie 50 ul Luciferase-Assay-Reagenz basiert Lebensfähigkeit zu nicht-infizierten Zellen zu Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. </li><li> Grundstücksdaten (Figure 4) und bestimmen getroffen Verbindung Konzentrationen, die MV-Replikation hemmen und CHIKV um 50%. Ignorieren Verbindung zeigt einige Toxizität in diesem Test. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier beschriebene Screening-Pipeline zielt auf die Auswahl-Verbindungen mit einem geeigneten Profil als Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren. Wenn eine Bibliothek von 10.000 Verbindungen wurde mit diesem Protokoll und oben erwähnten Filterkriterien angewendet wurden untersucht, dh die Hemmung der MV-Replikation überlegen 75%, 40 Verbindungen (0,4%) als positiv. Dabei etwa die Hälfte von ihnen zeigten eine Toxizität in der Luciferase-Basis-Lebensfähigkeitstest, und wurden deshalb nicht berücksichtig...

RNA-Viren sind für eine Vielzahl von Infektionen beim Menschen verantwortlich und haben einen großen Einfluss auf die Bevölkerung weltweit, sowohl in Bezug auf die öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Kosten. Effizienten Impfstoffen gegen verschiedene menschliche RNA-Viren entwickelt worden und werden weithin als prophylaktische Behandlungen. Es besteht jedoch immer noch ein Mangel an kritischen therapeutische Arzneimittel gegen RNA-Virus-Infektionen. Tatsächlich sind effiziente Impfstoffe nicht verfügbar gegen wichtige menschliche Krankheitserreger wie Dengue-Virus, Hepatitis-C-Virus oder humanen Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV). Außerdem sind RNA-Viren, die für die Mehrheit der neu auftretenden Krankheiten, die in der Frequenz wegen der globalen Austausch und menschlichen Auswirkungen auf ökologische Systeme erhöht haben verantwortlich. Gegen diese Bedrohung, die RNA-Viren darstellen, ist unser therapeutisches Arsenal äußerst begrenzt und relativ ineffizient 1-3. Gegenwärtige Therapien beruhen im wesentlichen auf rekombinanten Typ I-Interferone (IFN-α / β), um angeborene Immunität stimulieren basiert,oder die Verabreichung von Ribavirin. Obwohl die Wirkungsweise dieser Ribonukleosid analogen umstritten ist und wahrscheinlich von mehreren Mechanismen, der Hemmung der zellulären IMPDH (Inosin-Monophosphat-Dehydrogenase), die die intrazelluläre GTP-Pools erschöpft ist eindeutig erforderlich 4. Ribavirin in Kombination mit pegyliertem IFN-α, ist die Haupt Behandlung gegen Hepatitis C-Virus. Allerdings sind die relativ geringe Wirksamkeit in vivo gegen die meisten RNA-Viren IFN-α / β und Ribavirin Behandlungen, wie sie effizient stumpfen IFN-α / β Signaltransduktion durch Expression von Virulenzfaktoren 5 und oft entkommen Ribavirin 3. Dieser Mehr der Tatsache, dass Ribavirin Behandlung wichtiger Fragen Toxizität erhöhen, obwohl es vor kurzem gegen schwere Krankheit mit HRSV umstrittene Vorteile 6 genehmigt wurde. In jüngerer Zeit sind einige virusspezifischen Behandlungen wurden vermarktet, insbesondere gegen Influenzavirus mit der Entwicklung of Neuraminidase-Hemmer 3. Die große Vielfalt und dauerhafte Auftreten von RNA-Viren verhindert jedoch die Entwicklung von spezifischen Behandlungen gegen jeden von ihnen in relativ naher Zukunft. Insgesamt unterstreicht dies die Notwendigkeit für eine effiziente Strategien, um in der nahen Zukunft zu identifizieren und zu entwickeln, starke antivirale Moleküle. Es ist trivial zu sagen, dass ein Breitspektrum-Inhibitor aktiv gegen eine große Gruppe von RNA-Viren würde dieses Problem lösen. Obwohl ein solches Molekül ist immer noch ein Virologe Traum, unser besseres Verständnis der zellulären Abwehrmechanismen und angeborene Immunsystem nahe, dass einige Möglichkeiten gibt es 7,8. Mehrere akademischen und industriellen Laboratorien versuchen nun, Moleküle, die bestimmte Aspekte der zellulären Abwehrmechanismen oder Stoffwechselwege, die virale Replikation stumpf zu stimulieren. Obwohl solche Verbindungen wahrscheinlich zeigen erhebliche Nebenwirkungen, werden Behandlungen gegen akute Virusinfektionen zu verabreichened für eine relativ kurze Zeit, so dass sie trotz einer möglichen Toxizität auf lange Sicht akzeptabel. Verschiedene Strategien wurden entwickelt, um solche Breitspektrum-antiviralen Moleküle zu identifizieren. Einige Forschungsprogramme zielen auf die Suche nach Molekülen, die spezifische Abwehr oder Stoffwechselwege abzielen. Dazu gehören zum Beispiel Krankheitserreger Erkennungsrezeptoren auf eine antivirale Genexpression 9 entlocken und aktivieren antiviralen Faktoren wie RNaseL 10, Autophagie Maschinen Virus Abbau 11 zu fördern, Nucleosidsynthese Pfade 12,13, oder apoptotischen Kaskaden zum Tod von Virus-infizierten Zellen ausfallen 14. Andere Gruppen haben phänotypische Bildschirme, die nicht ziel basieren 13,15-17 entwickelt. In diesem Fall werden die antivirale Moleküle einfach durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, um die virale Replikation in einem gegebenen zellularen Systems blockieren. Die allgemeine Annahme ist, dass eine Verbindung Hemmung 2-3 unabhängigen RNA-Viren wäre ein geeignetes Profil für eine breit spectrum antiviralen Moleküls. Die Wirkungsweise der Trefferverbindungen mit einer solchen empirischen Ansatz gewählt wird erst in einem zweiten Zeitpunkt bestimmt und schließlich kann die Identifizierung von neuartigen zellulären Ziele für antivirale Medikamente führen. Interessant ist, dass eine retrospektive Analyse der von der US Food and Drug Administration zwischen 1999 und 2008 zugelassenen neuen Medikamenten hat gezeigt, dass im Allgemeinen, wie phänotypischen Screenings tendenziell besser als zielorientierte Ansätze durchführen, um first-in-class, niedermolekulare Medikamente 18 entdecken . Virusreplikation in Hochdurchsatz-Assays auf Zellbasis wird in der Regel von Virus zytopathische Effekte bestimmt. Zellen infiziert und in 96 - oder 384-Well-Platten in Gegenwart der getesteten Verbindungen. Nach einigen Tagen werden die Zellschichten fixiert und mit Farbstoffen, wie Kristallviolett gefärbt. Schließlich wird die Absorption mit einem Plattenlesegerät und Verbindungen Hemmung der viralen Replikation durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Zellschichten her erhalten bestimmtm-Virus-induzierten zytopathischen Effekt. Alternativ werden viral-vermittelte zytopathischen Effekte mit Standard Lebensfähigkeit Assays wie MTS Reduktion beurteilt. Solche Assays sind hoch handhabbar und kostengünstig, aber leiden unter drei Hauptbeschränkungen. Erstens erfordern sie eine Virus-Zell-Kombination, bei der die virale Replikation ist zytopathischen in nur wenigen Tagen, aber dies ist nicht immer möglich, so fordern alternative Ansätze 19. Zweitens sind sie schlecht quantitative da sie auf einer indirekten Messung der Virusreplikation basiert. Schließlich können toxische Verbindungen wie positive Treffer erzielt werden und müssen daher mit einer Gegen Bildschirm messen Zelllebensfähigkeit beseitigt werden. Um einige dieser Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Viren oder Replikons durch reverse Genetik entwickelt worden, Reporterproteine, wie EGFP oder Luciferase exprimieren, aus einer weiteren Transkriptionseinheit oder in Rahmen mit Virusprotein-Gene (einige Beispiele 20-23). Wenn diese Viren replizieren, Reporter proteins zusammen mit viralen Proteine ​​selbst hergestellt. Dies stellt eine sehr quantitative Assay die virale Replikation Messung und Bewertung der inhibitorischen Aktivität des Kandidaten-Moleküle. Dies gilt insbesondere für rekombinante Viren, die Luciferase (oder andere Enzyme, die Biolumineszenz), da dies Reportersystem weist einen weiten Dynamikbereich mit einer hohen Empfindlichkeit und praktisch ohne Hintergrund. Darüber hinaus gibt es keine Anregungslichtquelle, wodurch Interferenzen mit 24 Fluoreszenzverbindung. Hier haben wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Protokoll auf chemische Bibliotheken für Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren zu untersuchen. Die Verbindungen werden zuerst auf menschliche Zellen mit einem rekombinanten Masernvirus (MV) zum Ausdruck Firefly Luziferase 25 (rMV2/Luc, Bild 1, primären Bildschirm) infiziert getestet. MV gehört zu bestellen Mononegavirales und wird oft als eine prototypische Mitglied der Negativstrang RNA-Virus alsEs. Als solches ist MV-Genom als Matrize durch die virale Polymerase verwendet, um mRNA-Molekülen codiert für virale Proteine ​​zu synthetisieren. In dem rekombinanten MV-Stamm genannt rMV2/Luc wird die Luciferase-Expression von einer zusätzlichen Transkriptionseinheit zwischen P und M-Gene (Fig. 2A) einge ausgedrückt. Parallel Verbindungen für ihre Toxizität auf menschlichen Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Luciferase-Reagens, das, zur Quantifizierung von ATP getestet, die Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in Kultur (Fig. 1, primären Bildschirm). Gesamte chemischen Bibliotheken lassen sich mit diesen beiden Tests, um Verbindungen, die nicht giftig sind und MV-Replikation effizient zu blockieren wählen abgeschirmt werden. Dann werden Treffer für Dosis-Wirkungs-Hemmung der MV-Replikation, das Fehlen von Toxizität als auch für ihre Fähigkeit, Chikungunya-Virus (CHIKV) Replikation (Abbildung 1, sekundären Bildschirm) beeinträchtigen erneut getestet. CHIKV ist ein Mitglied der Familie und Togaviridae sein Genom ist apositive Einzelstrang-RNA-Molekül. Als solches ist es völlig unabhängig von Masern und Verbindungen Hemmung sowohl MV und CHIKV stehen eine große Chance, eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. CHIKV Nicht-Strukturproteine ​​werden von dem viralen Genom übersetzt, während Strukturproteine ​​werden durch Transkription und Translation einer subgenomischen mRNA-Molekül kodiert. Unsere in vitro-Assay für die Replikation CHIKV auf einem rekombinanten Stamm genannt CHIKV / Ren, die Renilla-Luciferase-Enzym als gespaltenen Teil der Nicht-Struktur Polyprotein durch eine Einsetzöffnung des Reportergens zwischen nsP3 und nsP4 Sequenzen 26 (Fig. 2B) auf der Basis drückt. Das Maß der Renilla-Luciferase-Aktivität erlaubt die Überwachung der viralen Replikation in einem frühen Stadium des Lebenszyklus CHIKV. Das Hochdurchsatz-Protokoll wurde verwendet, um schnell Verbindungen zu identifizieren mit einem geeigneten Profil für Breitspektrum antiviralen Medikamenten in einer kommerziellen Bibliothek von 10.000 MoleModule für die chemische Vielfalt bereichert. Die Verbindungen wurden im Wesentlichen folgende Lipinski-Regel von fünf, mit Molekulargewichten im Bereich von 250 bis 600 Dalton und log D-Werten unter 5. Die meisten dieser Moleküle wurden neue chemische Wirkstoffe in anderen kommerziellen Bibliotheken nicht verfügbar sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNA-Viren sind für die wichtigsten Krankheiten wie Grippe, Bronchitis, Dengue-Fieber, Hepatitis C oder Masern verantwortlich. Sie stellen auch eine neue Bedrohung wegen der erhöhten weltweiten Austausch und die menschlichen Populationen durchdringen mehr und mehr natürliche Ökosysteme. Ein gutes Beispiel für eine solche Situation ist Schwellen Chikungunya-Virus-Epidemien von 2005-2006 in den Indischen Ozean. Jüngsten Fortschritte im Verständnis der zellulären Wege Steuern virale Replikation zeigen, dass Verbindungen, die auf Wirtszellfunktionen anstatt das Virus selbst, könnte eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. Einige antiviralen Breitband-Verbindungen mit Host-zielorientierte Tests identifiziert worden. Aber die Hemmung der Virusreplikation in Zellkulturen unter Verwendung von Reduktion der cytopathischen Effekte als Auslese immer noch eine überragende Screening-Strategie. Solche funktionellen Bildschirme wurden durch die Entwicklung von rekombinanten Viren Reporter exprimieren verbesserter Enzyme ca.Pable der Biolumineszenz wie Luciferase. In dem vorliegenden Bericht haben wir detailliert eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die rekombinanten Masern-und Chikungunya-Viren mit zellulären Lebensfähigkeitstests kombiniert, um Verbindungen mit einem antiviralen Breitband-Profil zu identifizieren.

Dieses Screening-Pipeline setzt zunächst auf die Auswahl von Verbindungen, die MV-Replikation hemmen und keine signifikante zelluläre Toxizität (Abbildung 1, primären Bildschirm) nicht zeigen. Es nutzt Luciferase-basierte Assays zur Zelltoxizität und die Hemmung der viralen Replikation zu bestimmen. Alle Pipettierschritte und Datenerfassung in einem Hochdurchsatzeinstellung mit einer Roboter-Plattform ausgeführt werden. Zytotoxizität von Verbindungen unter Verwendung ...

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Aufrufe.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet. 

Serie: High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...