The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.

Dieses Protokoll basiert auf einem experimentellen Design, bei dem 10 Mäuse werden mit 10 7 CAR T-Zellen, die jeweils behandelt wurden. Das bedeutet, dass 10 8 CAR T-Zellen benötigt werden; die Ausbeute sollte von 5 x 10 -1 7 x 10 8 bis Konto für den Verlust der Lebensfähigkeit überschätzt werden. Das folgende Protokoll wird so skaliert, etwa 200 x 10 6 Zellen zu erzeugen. Die Zellen werden dann intravenös an weibliche C57BL / 6 Mäuse mit 9 Tage etabliert syngenen EGFRvIII-positiven intrakraniellen Tumoren verabreicht wird, von der bestehenden KR158B Astrozytom oder B16 Melanomzelllinien entwickelt. Gleichzeitig mit CAR T-Zell-Generation, sind tumortragenden Mäusen verabreicht klinisch relevanten Dosen von lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) und WBI (16,5 Gy). Die Mäuse wurden gepflegt und unter pathogenfreien Bedingungen an der Duke University Medical Center (DUMC) gezüchtet. Alle Tierversuche wurden nach Protokollen von der Duke University Institution genehmigt durchgeführtal Animal Care und Verwenden Committee (IACUC). 1. Verabreichung von Temozolomid zur Tumor-tragenden Mäusen Den Tagen 0 bis 4: <ol><li> Berechnen der Gesamtanzahl von Mäusen injiziert werden und sich vermehren, indem 0,5, um das Volumen benötigt werden (zum Beispiel 30 x Mäusen 0,5 ml = 15 ml TMZ) TMZ Lösung zu bestimmen, und 1,5 ml dieses Bandes um Spillover (16,5 ml TMZ Konto ). </li><li> Multipliziert man diese Gesamtmenge von 3 mg / ml, um das Gewicht des lyophilisierten TMZ erforderlich zu bestimmen (beispielsweise 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Wiegen diese in ein konisches 50 ml. ACHTUNG: TMZ ist durch Einatmen, Verschlucken und Berührung mit den Augen, Haut und Schleimhäute giftig. Beraten Sie sich mit Arbeitssicherheit Institution und / oder Umwelt, Gesundheit und Wellness-Abteilung für Empfehlungen zur Verringerung des Risikos der Exposition. </li><li> Multiplizieren das Gesamtvolumen von 0,15, das Volumen an Dimethylsulfoxid zu bestimmen (DMSO) benötigt wird (beispielsweise 16,5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filter sterilisieren Volumen DMSO (plus eine zusätzliche 2 ml für Greifen ausmachen) durch ein 0,2 um-Filter in ein steriles Röhrchen. Fügen 2,475 ml sterilem DMSO zu der TMZ-Pulver. </li><li> Legen Sie die TMZ / DMSO-Lösung in einen Becher Wasser über einer Heizplatte bei 65 ° C für 10-15 Minuten. Sobald TMZ vollständig aufgelöst ist, sollte die Lösung leicht gelb gefärbt werden; Wenn sich die Lösung rosa, dann wird die TMZ abgebaut und eine neue Lösung sollte mit einer frischen Menge TMZ hergestellt werden. </li><li> Berechnen des geeigneten Volumens von steriler Kochsalzlösung durch Multiplizieren 0,85 durch das Gesamtvolumen (0,85 x 16.5 ml = 14,025 ml Salzlösung) benötigt. 15 ml sterile Kochsalzlösung in einem 50 ml konischen. Während TMZ Auflösen in DMSO, Wärmekochsalzlösung auf 65 ° C. </li><li> Vortex die TMZ / DMSO-Lösung, um sicherzustellen, dass die TMZ Pulver vollständig gelöst und langsam erwärmt Salz zum TMZ / DMSO-Lösung. </li><li> Unmittelbar nach der Herstellung, 15 x 1 ml Tuberkulin syring voll ladenes mit TMZ-Lösung für die Verabreichung an 4 Tage etabliert tumortragenden Mäusen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang an den Tagen 1 bis 4 für insgesamt fünf TMZ Verwaltungen. </li></ol> 2. Ganzhirnbestrahlung von tumortragenden Mäusen Den Tagen 2 bis 4: <ol><li> Schalten Sie das Röntgenbestrahlungsgerät und lassen Sie ihn warmlaufen, um die volle Spannung. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Filter in Kraft ist und Eingabe der richtigen Spannung und die aktuellen Einstellungen (Abbildung 2A). HINWEIS: Die Dosimetrie des Bestrahlungs sollte im voraus erwiesen, um den entsprechenden Spannungseinstellungen und Grid-Layout (2A, B) zu bestimmen. </li><li> Berechnen der Zeitdauer, die notwendig ist, um in 5,5 Gy Röntgenstrahlung führen. Wenn beispielsweise Röntgenstrahlen werden mit einer Rate von 2 Gy / min geliefert, dann 2,75 min notwendig, um insgesamt 5,5 Gy liefern. Geben Sie die entsprechenden Zeitdauer. HINWEIS: In Tabelle 2 sind Maus WBI dosiert einnd ihre klinische Mittel beim Menschen. Im Zusammenhang mit der hochgradigen Gliomen, 60 Gy fraktioniert WBI (2 Gy Fraktionen, 5 Tage / Woche für 6 Wochen) ist die klinische Pflegestandard und die murine Äquivalent verwendet hier 16,5 Gy (5,5 Gy × 3). </li><li> Eine frische Lösung von Ketamin / Xylazin zur systemischen Anästhesie durch Zugabe von 2 ml Ketamin und 1 ml Xylazin und 17 ml Kochsalzlösung, so daß die endgültige Lösung 10 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin. </li><li> Wiegen Mäusen und verwalten 10 ul Ketamin / Xylazin intraperitoneal pro Gramm Körpergewicht, daß die Tiere eine Dosis von Ketamin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg Xylazin empfangen. Mäuse sollten in vollem Umfang sediert werden und sichtbar innerhalb von 2 Minuten von Ketamin / Xylazin Verwaltung atmen. </li><li> Um Augen Feuchtigkeit in sedierten Tieren zu erhalten, reiben Sie eine kleine Menge von künstlichen Tränen Salbe auf jedes Auge. </li><li> Platzieren sediert Mäuse auf dem Gitter, so dass Köpfe werden in dem Gebiet, das die höchste Röntgen in empfängt positioniertIntensität (Abbildung 2B, C). Schild Körper vom Hals abwärts mit geeigneter Größe Bleirohr, um systemische Röntgen Lieferung (2D) zu blockieren. </li><li> Platzieren positioniert Mäusen unter dem Röntgenstrahl, so dass die Laser bezeichnet den Brennpunkt des Röntgenstrahls an der Koordinate (0,0) auf dem Gitter-Layout. Beginnen Röntgen Lieferung. </li><li> Wenn Röntgen Lieferung abgeschlossen ist, entfernen Tiere aus dem Bestrahlungsgerät und auf ein warmes Heizkissen. Sedierten Tieren mit wachen Tieren beherbergen Sie nicht, bis Tiere ausreichend wieder zu sich kam, um Brustbein recumbence halten. Wenn Tiere Brustbein recumbence halten, legen Sie wachen Tieren zurück in ihre entsprechenden Käfigen. </li><li> Wiederholen Sie diese Prozedur an den Tagen 3 und 4 für insgesamt drei fraktionierten Dosen von Strahlung. </li></ol> 3. Transfektion Tag -1: <ol><li> Bereiten D10 Medium durch Zugabe von 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 500 ml von Dulbeccos Modified Eagle-Medium (DMEM). </li><li> Bereiten T Zellmedien (TCM) durch Zugabe 5,5 ml L-Glutamin, 5,5 ml Natriumpyruvat, 5,5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, und 5,5 ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) zu 500 ml RPMI-1640-Medium. Als Nächstes fügen 550 ul 2-Mercaptoethanol und 550 &amp; mgr; l Gentamycin. Schließlich, fügen Sie 50 ml FBS. </li><li> Ernte in vitro kultivierten HEK293T Zellen und bringen auf eine Konzentration von 7,5 x 10 6 Zellen / ml in D10 Medien. </li><li> Platte 10 ml D10 Medien und 1 ml HEK293T-Zellsuspension in jede der 16 x 10 cm mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichteten Platten. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> Tag 0: <ol start="6"><li> Tauschen Sie Medien mit 10 ml frischem D10 mindestens 30 Minuten vor Transfektion von Zellen. </li><li> Bestimmung der Menge an Vektor-Plasmid pCL-Eco Vektor und liposomalen Transfektionsreagenz zur Transfektion erforderlich durch Multiplizieren der Gesamtzahl der Platten + 1 (16 + 1 = 17) von 14,1 &amp; mgr;Vektorplasmid (14,1 x 17 = 239,7 &amp; mgr; g) 9,9 &amp; mgr; g pCL-Eco-Vektor (9,9 x 17 = 168,3 &amp; mgr; g), und 60 ul liposomalen Transfektionsreagenz (60 x 17 = 1.020 &amp; mgr; l). Alle Reagenzien werden bei Raumtemperatur vor der Herstellung von Lösungen sein. </li><li> Beschriften Sie zwei Röhren A und B Rohr A, fügen 239,7 ug Vektorplasmid und 168,3 &amp; mgr; g pCL-Eco Vektor (1,5 x 17) ml reduziert Serum modifiziertem Eagle-Medium (RS-MEM). In Rohr B, fügen Sie 1020 ul liposomalen Transfektionsreagenz auf (1,5 x 17) ml RS-MEM. </li><li> Inkubieren A und B getrennt für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Mischen Sie A und B zusammen sanft (Vortex für 1-2 sec oder Invertzucker mehrmals) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur, um Lipid / DNA-Komplex zu bilden. </li><li> Fügen Lipid / DNA-Komplex tropfenweise zu HEK293T-Zellen in 10-cm-Schale. </li><li> Bei 37 ° C für 6-8 h oder über Nacht (24 h nicht überschreiten). </li><li> Nach 6-8 h Inkubation ersetzen Medium mit 12 ml frischem TCM für die Virusproduktion. Diese vernickelt Medienwird an Tag 2 als viraler Überstand für T-Zell-Transduktion verwendet werden. </li></ol> 4. Splenektomie und T-Zell-Vorbereitung Tag 0: <ol><li> Gießen Sie 10 ml der TCM in einen 50-ml-Erlen und auf Eis für Milz Sammlung. </li><li> Opfern Sie die entsprechende Anzahl der Tiere mit CO 2 Ersticken und Sekundär Enthauptung: Platz Tiere in einem Käfig Erhalt CO 2 mit einer Flussrate von 10-30% Käfigvolumen / Minute, je American Veterinary Medical Association Richtlinien (nicht mehr als 5 Tiere können sein geopfert gleichzeitig), bis die Atmung beendet und danach für zwei Minuten. Tiere entfernen aus dem CO 2 Kammer und enthaupten. HINWEIS: Eine Milz einer 6-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6-Maus wird etwa 4,5-5 x 10 7 Splenozyten ergeben. Dabei wird 4 Milzen etwa 200 x 10 6 Zellen geerntet werden. </li><li> Legen Sie die Maus, so dass die rechte Seite nach oben zeigt, undSpray mit 70% Ethanol. Mit der Zange, schnappen Sie sich einen dünnen Hautfalte unterhalb der linken Brustkorb und schnitt einen leichten Schnitt mit der Schere. Ziehen Sie die Haut vorsichtig packen eine dünne Falte des Bauchfells mit einer Pinzette und schneiden Sie einen kleinen Hohlraum. </li><li> Die Milz ist eine kleine, längliche, dunkelrote Organ, das einen abgeflachten Bohne ähnelt; zart greifen die Milz mit der Zange und Verbrauch durch Wegschneiden des umgebenden Bindegewebes. Platzieren Sie die Milzen herausgeschnitten, in den konischen, die 10 ml TCM auf Eis. </li><li> Gießen Milzen über einem 70 um Sieb Zellsieb und disaggregieren durch Maischen mit dem stumpfen Ende der in einen 5-ml-Spritze, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Es können maximal zwei Milzen sollte pro Mesh Sieb aufgeschlüsselt werden. </li><li> Mit einem kleinen Volumen von TCM sorgfältig waschen Sie das Sieb nach Disaggregation, um alle verbleibenden Splenozyten zu sammeln. Pool alle aufgeschlüsselte Milz in eine Einzelzellsuspension. Endvolumen auf 50 ml mit TCM für einen Wasch einerd bei 300 g für 10 Minuten zu drehen. </li><li> Es wird eine Lösung aus 1x Lysepuffer durch Zugabe von 5 ml 10x Lysepuffer 45 ml sterilem Wasser. Um den roten Blutkörperchen, Pellet in 5 ml 1x Lysepuffer pro Milz in einem 50 ml konischen gut mischen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren beseitigen. Wenn mehr als 5 Milz, mit einem 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Platzieren konischen oder Zentrifugenröhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die Lyse-Reaktion aus dem Wasserbad und fügen TCM bei einem 1: 1-Verhältnis mit Lysepuffer, um die Reaktion zu neutralisieren. Durch Spinnen bei 300 g für 10 Minuten waschen. </li><li> Überstand entfernen und voll Pellet in TCM (2 ml / Milz, 8 ml insgesamt 4 Milz), die durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Zählen von Zellen durch Zugabe von 10 &amp; mgr; l der Zellsuspension in 190 ul Trypanblau (1:20 Verdünnung). Multiplizieren die in einer der vier Gitterquadrate von 20 x 10 4 x Gesamtvolumen (8 ml) erhaltenen Zahl, um die Gesamtzellzahl zu erhalten (beispielsweise 125 Zellen x 20 x 10 4 </sup&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 Milzzellen). </li><li> Verdünnte Zellen auf eine Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml in TCM mit 2 ug / ml Concanavalin A (ConA) und 50 IU / ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (rhIL-2) ergänzt wird. So ist 200 x 10 6 Milzzellen, fügen Sie 92 ml Medium bis 8 ml Zellen, 200 ug ConA und 5.000 IE rhIL-2. </li><li> 2 ml Zellen zu jeder Vertiefung der 24-Well-Gewebekultur-behandelten Platten, derart, daß 4 x 10 6 Zellen werden in jede Vertiefung (beispielsweise 100 ml der Zellen werden etwa 4 Platten erfordern). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 5. Transduction 1. Tag: <ol><li> Berechnen Sie die Anzahl der Nicht-Gewebekultur-behandelten 24-Well-Platten für die Weiterleitung benötigt, indem die Anzahl der Milz von 2 geerntet (8 Platten werden 4 Milz erforderlich) zur Verfügung. </li><li> Als nächstes berechnen die benötigte Menge von rekombinantem Human-Fibronektin-Fragment (RHFF) Lösungzu beschichten Platten durch Multiplikation notwendig (Gesamtzahl der Vertiefungen + 3) x 0,5 ml (8 Platten x 24 Wells = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml. </li><li> Bereiten 97,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend RHFF bei einer Konzentration von 25 ug / ml durch Multiplizieren der Gesamtmenge mit 25 &amp; mgr; g (97,5 x 25 = 2437,5 &amp; mgr; g). Fügen Sie diese Menge an RHFF auf 97,5 ml PBS. </li><li> Coat Nichtgewebekultur behandelten 24-Well-Platten durch Zugabe von 0,5 ml PBS / RHFF Lösung pro Well. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> Tag 2: <ol start="6"><li> Dump PBS / RHFF Lösung aus nicht-Gewebekultur-behandelte Platten mit 24 Vertiefungen. </li><li> 1 ml / Vertiefung 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Entfernen BSA durch festes umstülpend Platte. Durch Zugabe von 2 ml PBS waschen. </li><li> Sammeln viralen Überstand durch Übertragen von Medien voneinander HEK293T PDL Platte in ein 250 ml-Zentrifugenröhrchen und Spin 10 min bei 500 x g. </li><li> Sorgfältig übertragen Virus supernatant in eine frische 250 ml Zentrifugenröhrchen, wobei Sie nicht auf das Zellpellet sich gebildet haben können stören. </li><li> Frisches TCM dem viralen Überstand, so dass das Endvolumen von 3 ml über dem für RHFF beschichteten Vertiefungen benötigten Menge. Beispielsweise wird für 192 RHFF beschichteten Vertiefungen, bringe das Volumen der Virusüberstand zu 192 + 3 ml = 195 ml. </li><li> Entfernen kultivierten Splenozyten aus dem Inkubator und Resuspension durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren 2-3 mal in jede Vertiefung. In einen 250-ml-Erlen. Bei Verwendung einer Mehrkanalpipette, mit einem sterilen Behälter vor der Übertragung wird Ihnen helfen, diesen Schritt zu beschleunigen. Zählen Sie, wie oben beschrieben und Spin bei 300 g für 10 min. </li><li> Hinzufügen rhIL-2 auf virale Überstand in einer Konzentration von 50 IU / ml. Fügen Sie beispielsweise 50 x 195 = 9750 IU rhIL-2-195 ml Virusüberstand. </li><li> Resuspendieren Splenozyten in viralen Überstand bei 1 x 10 6 Zellen / ml </li><li> 1 ml / Vertiefung von Splenozyten Suspension RHFF beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen. </li><li>Spin für 90 min nach der folgenden Einstellungen: 770 xg, Beschleunigung = 4, Brems- / Verzögerung = 0, 32 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine TCM-Lösung mit 50 IU / ml rhIL-2. So bereiten Sie eine 200 TCM-Lösung durch Zugabe von 10.000 IE rhIL-2. 1 ml rhIL-2 / TCM jeder Vertiefung nach dem Zentrifugieren. </li><li> Kultur über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. CAR T-Zell-Kultur und Ernte Tag 3 und 4: <ol><li> Wenn T-Zellen zu erreichen&gt; 80% Zusammenfluss können Zellen aufgeteilt werden (in diesem Fall in der Regel am Tag 3 oder Tag 4). So teilen Zellen vorsichtig pipettieren oben und unten in jeder Vertiefung 2-3 mal, und bewegen Sie 1 ml aus jeder Vertiefung in neue Vertiefungen einer frischen 24-Well-Gewebekulturplatte behandelt. Dann fügen Sie 1 ml frischem TCM mit 50 IU / ml IL-2 in jede Vertiefung, so dass endgültige Volumen ist 2 ml in alle Vertiefungen. </li><li> Wenn Zellen nicht&gt; 80% Konfluenz erreichen, führen Sie eine halbe Medienwechsel durch langsames Abpipettieren 1 ml Medium von der Spitze der jede Vertiefung. D vermeidenisturbing Zellen ließ sich auf den Boden, während der Beseitigung von Papier. 1 ml frischem TCM, enthaltend 50 IU / ml rhIL-2. </li></ol> Tag 5: <ol start="3"><li> Resuspendieren CAR T-Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren 3 mal in jede Vertiefung und in ein 250-ml-Zentrifugenröhrchen. Spin-Zellen bei 300 g für 10 min. </li><li> Komplett absaugen Überstand ohne störende Pellet. Einmal mit PBS zu waschen, zu zählen Zellen, wie zuvor beschrieben, und waschen mit PBS ein zweites Mal. Ein typisches CAR T-Zell-Ausbeute beträgt ca. 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung (8 x 24 Wells Platten = 192 x 10 6 CAR T-Zellen). </li><li> Zellen in PBS bei einer Konzentration von 5 x 10 7 / ml für eine Injektion von 1 × 10 7 in einem Volumen von 200 &amp; mgr; g (zB für 192 x 10 6 CAR T Zellen gewaschen Pellet in 3,84 ml PBS). </li></ol> 7. CAR T-Zell-Administration, um tumortragenden Mäusen Tag 5: <ol><li> Transport Zellen auf Eis zu Tierhaltung zur intravenösen Injektion. Last 500-1000 ul in Insulinspritze mit 27 bis 31 G-Nadel, um sicherzustellen, dass alle Blasen ausgestoßen werden. </li><li> Schnappen Sie sich eine Maus an der Basis des Schwanzes und setzen in Rohrrainer. </li><li> Ziehen Sie den Schwanz mit der Vene nach oben gespannt, und gleiten Sie die Nadel etwa 1-2 mm unter die Haut in die Vene, indem Sie ihn in die Schwanzvene parallel. Langsam vertreiben 200 ul in die Vene. Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt, wird die Lautstärke leicht fließen in; sonst wird es Widerstand und die Nadel benötigt, um von dem Schwanz entnommen und vollständig wieder eingesetzt. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide:+a+new+oral+cytotoxic+chemotherapeutic+agent+with+promising+activity+against+primary+brain+tumours.">Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours.</a> Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).</li><li>Newcomb, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+of+Ionizing+Radiation+and+Peripheral+Vaccination+Produces+Long-term+Survival+of+Mice+Bearing+Established+Invasive+GL261Gliomas.">The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).</li><li>Park, B., Yee, C., Lee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+radiation+on+the+immune+response+to+cancers.">The effect of radiation on the immune response to cancers.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).</li><li>Fritzell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+temozolomide+synergizes+with+immunotherapy+in+a+T+cell-dependent+fashion.">Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).</li><li>Park, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+by+temozolomide+enhances+antitumor+immunity+of+dendritic+cell+vaccination+in+murine+brain+tumor+model.">Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model.</a> Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).</li><li>Emens, L. A., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+activity+of+tumor+vaccines+with+cytotoxic+chemotherapy.">Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy.</a> Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).</li><li>Murphy, K. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dense+temozolomide+regimens:+antitumor+activity,+toxicity,+and+immunomodulatory+effects.">Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects.</a> Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).</li><li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intensity+lymphodepletion+and+adoptive+immunotherapy-how+far+can+we+go.">Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go.</a> Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).</li><li>Wrzesinski, C., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+is+more:+lymphodepletion+followed+by+hematopoietic+stem+cell+transplant+augments+adoptive+T-cell-based+anti-tumor+immunotherapy.">Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).</li><li>Dudley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+therapy+for+patients+with+metastatic+melanoma:+evaluation+of+intensive+myeloablative+chemoradiation+preparative+regimens.">Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.</a> J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).</li><li>Sanchez-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloablative+Temozolomide+Enhances+CD8(+)+T-Cell+Responses+to+Vaccine+and+Is+Required+for+Efficacy+against+Brain+Tumors+in+Mice.">Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice.</a> Plos One. 8 (3), (2013).</li><li>Su, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+CD4++lymphopenia+in+melanoma+patients+treated+with+temozolomide:+a+toxicity+with+therapeutic+implications.">Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications.</a> J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).</li><li>Dummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+homeostatic+proliferation+elicits+effective+antitumor+autoimmunity.">T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity.</a> J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+homeostatic+cytokine+sinks+by+lymphodepletion+enhances+the+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+CD8++T+cells.">Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).</li><li>Wrzesinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intensity+lymphodepletion+enhances+tumor+treatment+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+T+cells.">Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells.</a> J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).</li><li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions.">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li><li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma.">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interests to declare.

Die hier beschriebene Behandlung Timeline wurde konzipiert, um die klinische Behandlungsstandard modellieren und zu nutzen, ihre Auswirkungen für CAR Adoptiv Therapie. CAR T Zelldosen, TMZ Schemata und Strahlentherapie Verabreichung kann verändert werden, um in vivo T-Zell-Aktivität, lymphodepletion und Tumortötung zu erhöhen. TMZ Regimen erhöht werden, um Host Myeloablation und verstärkten Ausbau adoptiv transferierten Zellen 30 zu ergeben. Außerdem können die Auswirkungen der lymphodepleti...

Das Glioblastom (GBM) ist die häufigste primären bösartigen Gehirntumor und ist immer tödlich. Die chirurgische Resektion in Verbindung mit nicht-spezifischen Standardtherapie Chemotherapie und Strahlentherapie nicht vollständig zu beseitigen Krebszellen, was zu einer düstere Prognose von weniger als 15 Monaten bei Patienten mit dieser Krankheit ein. Im Gegensatz dazu bietet die Immuntherapie eine genaue Vorgehensweise für die gezielt Tumorzellen angreift und somit das Potenzial hat, als eine sehr effektive Behandlungsplattform mit reduzierten Risiko von Sicherheiten Toxizität 2-4 dienen. T-Zellen entwickelt, ex vivo, um auszudrücken, chimären Antigenrezeptoren (CAR) bieten eine vielseitige Strategie zur Tumor-Immuntherapie. Die Autos werden durch Fusionieren der extrazellulären variable Region eines Antikörpers mit einem oder mehreren intrazellulären T-Zelle-Signalmolekül (en), die anstelle einer Volllängen-Haupthistokompatibilitätskomplex erzeugt (MHC) restringierten T-Zell-Rezeptor 5. Diese Art der antikörperähnlichen Antigens Sie AnAuf ermöglicht reaktiven Antigen-spezifische T-Zellen zu erkennen und zu reagieren, um Tumorantigene in Abwesenheit von MHC und kann für eine praktisch unendliche Antigenrepertoire angepasst werden. CAR-T-Zellen gegenüber einer Vielzahl von Tumorantigenen konstruiert wurden vorklinische Wirksamkeit und hervorragende Versprechen in der Klinik 6-9 gezeigt. Insbesondere im Zusammenhang mit der GBM eine CAR-T-Zell-Targeting-Plattform den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptorvariante III (EGFRvIII), ausgedrückt ein Tumor-spezifische Mutation an der Zelloberfläche 10, wurde gezeigt, dass das Überleben in Gliom-tragenden Mäusen 11 verlängern. Trotz ihrer Vielseitigkeit jedoch der klinische Nutzen von CAR adoptive Therapie nicht vollständig realisiert worden ist, was zum Teil an Tumor-assoziierte Immunsuppression und Immunumgehung 12-16 sowie Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo. Aufbauend Standardtherapie (SOC) mit Immuntherapie kann potenziell zu überwinden mehrere dieser lImitationen, was zu einer erhöhten Wirksamkeit sowohl in der präklinischen und klinischen Einstellung. SOC für post-Resektion GBM besteht aus hochdosiertem Temozolomid (TMZ), einem DNA-Alkylierungsmittel 17 und gesamte Gehirn Bestrahlung (WBI) 1. Diese Behandlungen gelten als mit Tumorvakzinen über Hochregulierung von Tumor-MHC-Expression von 18 bis 20 und das Vergießen von Antigenen durch toten Tumorzellen 17,19,21,22 Synergie. Tatsächlich ist die Zugabe von TMZ 20,23 oder 18,24 WBI führt zu verbesserten Antitumorwirksamkeit von immunbasierten Behandlungen in der präklinischen Einstellung. Ferner, wie viele nicht-spezifischen zytotoxischen Chemotherapeutika, TMZ ist bekannt, dass eine systemische Lymphopenie 25,26, die als Mittel zur Hostanlage für adoptive Therapie Plattformen 27-29 genutzt werden können verursachen. TMZ vermittelte lymphodepletion wurde gezeigt, dass die Häufigkeit und die Funktion von Antigen-spezifischen T-Zellen zu verstärken, was zu einer erhöhten Wirksamkeit eines ADOPtive Therapie Plattform gegen intrakranielle Tumore 30. Im Rahmen der CAR-Therapie dient lymphodepletion als Mittel zur Wirtsanlage sowohl durch die Reduzierung der Anzahl der endogenen Suppressor-T-Zellen 31 und 32 homöostatischen Proliferation induzierende über Einschränkungen des Wettbewerbs für Zytokine 33 und somit eine Verbesserung Antitumoraktivität 11,34. Angesichts der synergistische Beziehung zwischen GBM SOC und Immuntherapie-Plattformen, die Bewertung neuer Therapien und Adoptivimpfstoffplattformen im Rahmen der SOC ist von entscheidender Bedeutung für die Erstellung aussagekräftige Rückschlüsse auf die Wirksamkeit. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren für die Erzeugung und die intravenöse Verabreichung von murinen EGFRvIII spezifische CAR T-Zellen zusammen mit TMZ und WBI in Mäusen EGFRvIII-positive intrakraniellen Tumoren (siehe Abbildung 1 für die Behandlung Timeline). Kurz gesagt, werden CAR T-Zellen ex vivo durch retrovirale Transduktion gemacht. Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293T-Zellen werden mit einem DNA / Lipid-Komplex (enthaltend die CAR-Vektor und pCL-Eco-Plasmiden), um Viren, die dann verwendet wird, um aktivierten murinen Splenocyten, die geerntet werden und parallel kultivierten transduzieren erzeugen transfiziert. Im Verlauf der CAR Generierung werden murine Hosts Lager EGFRvIII-positiven intrakraniellen Tumoren in Dosierungen entsprechend der klinischen SOC verabreicht fraktionierte ganzen Gehirn Röntgenbestrahlung und systemischen TMZ Behandlung. CAR T-Zellen werden dann intravenös lymphodepleted Gastgeber geliefert. Folgende Vorgehensweise wird in sieben getrennten Phasen beschrieben: (1) Die Verabreichung von Temozolomid an tumortragenden Mäusen, (2) Ganzhirnbestrahlung von tumortragenden Mäusen, (3) Die Transfektion, (4) Splenektomie und T-Zell-Vorbereitung, (5 ) Transduction, (6) CAR T-Zell-Kultur und Ernte, und (7) CAR T-Zell-Verwaltung auf tumortragenden Mäusen. Diese Phasen bestehen aus mehreren Schritten, die 6-7 Tage dauern und gleichzeitig durchgeführt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1130">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Name of Material</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:125px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:449px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>10045P</td>
			<td>Helper vector for generating CAR retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retronectin</td>
			<td>ClonTech/Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td>Facilitates retroviral transduction of T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>HEK293 culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>T cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM 2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Reducing agent to remove free radicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin (50 mg/mL)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Standard&#160;Grade&#160;</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pharm Lyse (10X concentrate)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>Lyses red blood cells during splenocyte processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Filters away large tissue particles during splenocyte processing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356469</td>
			<td>Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Temozolomide</td>
			<td>Best Pharmatech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lyophilized powder prepared on the day of administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Necessary for complete dissolution of temozolomide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>IM 0132 (5/04)</td>
			<td>Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketathesia HCl</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>11695-0701-1</td>
			<td>Ketamine solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Xylazine sterile solution 100 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of car t cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

CAR T-Zellen durch Transduktion mit dem EGFRvIII CAR retroviralen Vektor 11 erzeugt. Dieser Vektor, MSGV1 wurde vom SFGtcLuc_ITE4 Vektor 35, der die murine Stammzellen Virus (MSCV) langen terminalen Wiederholungen, die verlängerte gag-Region und Umschlag-Spleißstelle enthält entwickelt (Spleißdonorstelle, sd, und Spleißakzeptor, sa), und virale Verpackungssignal (ψ). Die EGFRvIII CAR enthaltend die humane anti-EGFRvIII scFv-Fragment (scFv) 139, zusammen mit murinem CD8TM, CD28, 4-1BB und CD3 ...

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Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

generation-car-t-cells-for-adoptive-therapy-context-glioblastoma

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K Aufrufe.  Duke University. The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care. 

Serie: Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.