Die richtige Pflege und Haltung von Caenorhabditis elegans ist wichtig für das Ausführen von erfolgreichen Experimenten.
Sie brauchen sehr wenig Platz, ihre Behausung ist kostengünstig und sie sind sehr fruchtbar und einfach zu handhaben. Aber nur weil es einfach ist sie zu halten, bedeutet dass nicht dass die Forschung mit den Würmern schlecht ist! Sydney Brenner hat C. elegans sogar als das Geschenk der Natur an die Wissenschaft bezeichnet. Seit seiner ersten Benutzung im Jahr 1974 wurde der Wurm für Experimente benutzt, welche mit dem Nobelpreis ausgezeichnet worden sind.
In diesem Video zeigen wir einige einfache Methoden um C. elegans im Labor zu halten, einschließlich der Behausung und der Fütterung, der Handhabung und dem Gefrieren und dem Auftauen von Würmern.
In der freien Wildbahn sind C. elegans meist in der Erde vorzufinden und ernähren sich von sich zersetzenden, pflanzlichen Material. Im Labor ist es wichtig die Würmer so zufrieden wie möglich zu halten. Dafür gibt es bestimmte Methoden zur Behausungen und zur Fütterung.
C. elegans können bei 16, 20, oder 25ºC, abhängig von den experimentellen Anforderungen, entweder auf festem oder in flüssigem Medium gehalten werden. In beiden Fällen werden sie mit OP50 gefüttert, also einem standardisierten E. coli Stamm, der speziell für Würmerkulturen in Labors weltweit verwendet wird.
Bei 25ºC durchlaufen C. elegans ihren Lebenszyklus 2.1 Mal schneller als bei 16ºC. Ein schnellerer Lebenszyklus bedeutet dass die Würmer schneller reifen, mehr Eier legen, und mehr Essen essen. Wenn die Würmer hungern gelassen werden oder wenn die Bevölkerung zu dicht ist, gehen sie in ein Larvenstadium über, was auch „Dauer-Stadium“ genannt wird. Larven im Dauer-Stadium sind stressresistent und altern nicht.
Wenn sie auf festem Medium gehalten werden, wachsen C. elegans auf Agarplatten, die mit dem Wurmwachstumsmedium, auch NGM genannt, vorbereitet worden sind. Am Tag bevor man die Platten herstellt, impft man LB Medium mit einer einzelnen OP50 E. coli Kultur. Nun inkubiert man das Medium über Nacht bei 37ºC unter Schütteln. Um festes Medium herzustellen, misst man die entpsrechenden Mengen dieser Inhaltsstoffe und vermischt sie mit destilliertem Wasser in einem Erlenmeyerkolben.
Nachdem man die Mischung für mindestens 15 Minuten autoklaviert hat, lässt man den Agar im Wasserbad bis auf 55ºC abkühlen. Wenn es auf 55ºC abgekühlt ist, sollte man das Behältnis problemlos mit bloßen Händen anfassen können. Mit angemessener, aseptischer Vorgehensweise können Zusatzstoffe wie Medikamente oder Antibiotika jetzt hinzugegeben werden. Nun vermischt man durch Schwenken. Danach pipettiert man geschmolzenes NGM in Petrischalen bis sie ca. 2/3 voll sind. Die neu hergestellten Platten werden dann zum Trocken über Nacht auf die Laborbank gestellt.
Am nächsten Morgen zentrifugiert man die OP50 Bakterien bei 3500 x g für 10 Minuten, und resuspendiert das Pellet in LB Medium um eine 10X Konzentration herzustellen. Nun pipettiert man die Bakterien in das Zentrum der Platte ohne dabei die Oberfläche des NGMs mit der Pipettenspitze zu berühren. Die Kultur sollte nicht die Wände der Platte berühren. Die Platten werden dann über Nacht auf der Laborbank getrocknet. Wenn sie trocken sind, werden sie unter UV Licht gestellt, um sie zu sterilisieren. Sie sind jetzt fertig, um Würmer zu kultivieren.
Einzelne C. elegans
können mit einem Spatel oder Draht gehandhabt werden. Der Spatel ist normalerweise aus einem 90% Platin- und 10% Iridiumdraht der Stärke 30 gefertigt. Einige Wissenschaftler bevorzugen eine andere Zusammensetzung von Materialen. Um einen Spatel herzustellen, bricht man zuerst die Spitze einer Pasteurpipette bei einer bestimmten Länge ab.
Nun schneidet man einen ca. 3-4cm langen Draht und führt ihn ca. 0.5 cm in die Spitze der Pipette ein. Man versiegelt den Draht und die Pasteurpipette mit einem Bunsenbrenner. Die Länge des Drahtes, der aus dem Glas hervorsteht, ist ca. 3-3.5 cm, kann aber je nach den persönlichen Bedürfnissen unterschiedlich sein.
Man flacht das Ende des Drahts an einer harten Ecke ab. Danach verbiegt man den abgeflachten Teil nach oben, um eine Kelle zu bilden. Danach schleift man die Ecken des Spatels, damit die Würmer nicht beschädigt werden.
Um Würmer auszuwählen, sterilisiert man den Draht des Spatels in einer Flamme. Danach benetzt man die Spitze mit dicken, klebrigen OP50 E. coli von der NGM Platte. Man sollte aufpassen dass die Agaroberfläche nicht durchstochen oder beschädigt wird.
Man schaut durch ein Seziermikroskop und nimmt den Wurm mit dem flachen, klebrigen Spatel auf, bis er daran kleben bleibt. Wenn der Wurm auf dem Spatel ist, transferiert man ihn sofort auf eine neue Platte durch sanftes Auftragen auf die neue Oberfläche mit neuen Bakterien. Der Wurm sollte von dem Spatel runterkrabbeln. Der Wurm sollte nicht allzu lange auf dem Spatel bleiben, da er sonst austrocknet.
Ein Grund weshalb C. elegans ein so beliebter Moldellorganismus für die Forschung ist, ist dass er für lange Zeit ohne Nachteile kultiviert und gelagert werden kann.
Zuerst wäscht man die frisch ausgehungerten Larven mit 0.5 ml M9 Puffer und schwenkt die Platte leicht um alle Larven und erwachsene Tiere zu lösen. Dann transferiert man sie in ein Eppendorf Gefäß oder ein Gefrierbehältnis. Danach gib man die gleiche Menge von 30% Glyzerin und M9 Puffer hinzu. Dann verstaut man die Behältnisse in einem gedämmten Karton und bei -80ºC .
Um die Würmer zurückzugewinnen, holt man sie aus dem -80ºC Gefrierschrank und taut sie bei Zimmertemperatur auf bis der Inhalt komplett geschmolzen ist. Nun wird die Flüssigkeit auf eine frische NGM Platte mit einem OP50 Rasen pipettiert und die Platte dann bei 20ºC inkubiert. Nach 2-3 Tagen transferiert man 10-15 Tiere auf eine neue Platte, wo sie sich für eine Generation fortpflanzen können. Man sammelt die Nachkommen und schaut nach den korrekten Phänotypen.
Nun dass wir gesehen haben wie C. elegans im Labor gehalten werden, schauen wir uns an wie man das Füttern, die Bauhausung und die Handhabung für Experimente verändern kann.
Der Entdeckung der RNA Interferenz, für welche ein Nobelpreis verliehen wurde, ermöglicht es Forschen jedes C. elegans Gen abzuschalten, damit man die Funktion des Gens verstehen kann.
RNAis können in C. elegans eingefügt werden, indem man zuerst Platten mit E. coli vorbereitetet, welche die Ziel-Gen dsRNA exprimieren, und welche von C. elegans gegessen werden. Dann werden Larven im 4. Stadium auf die RNAi Platte transferiert, damit sie Eier legen können. Die Nachkommen werden dann bei dem gewünschten Entwicklungsstadium aufgesammelt und der Phänotyp wird untersucht. Da wir etwa die Hälfte unseres Genoms mit dem Wurm teilen, können wir viele neue Einblicke in humane Krankheiten gewinnen.
Wegen ihres schnellen Lebenszyklus ist C. elegans sehr gut für Untersuchungen des Alterns geeignet.
Zuerst müssen wir eine synchronisierte Population von C. elegans vorbereiten, indem wir erwachsene Hermaphroditen auf NGM zum Eierlegen überführen. Die Würmer legen für 6-8 Stunden Eier und werden danach entfernt.
Wenn die Würmer das geeignete Stadium erreicht haben, werden sie auf neue NGM Platten mit Ampizillin (zur Vermeidung des Bakterienwuchses) und FUDR, um die Fortpflanzung zu verhindern, überführt.
Von hier aus an werden die erwachsenen Würmer alle 2-3 Tage beobachtet, bis alle Würmer gestorben sind. Die toten Würmer werden von der Platte entfernt, und die Anzahl der toten und lebenden Würmer wird notiert.
Die Analyse der Lebensspanne bei speziellen genetischen oder umweltlichen Bedingungen können wichtige Einblicke in die Alterungsprozesse geben.
Mit Lasern können Axotomien, also das Schneiden von einzelnen Axonen in lebenden C. elegans ausgeführt werden, um die Regeneration von Nerven zu untersuchen.
Da aber die Würmer nie still halten, werden sie auf ein 10% Agarpolster in eine Lösung von Mikrokugeln gelegt. Ein Deckglas wird dann daraufgelegt. Die Mikrokugeln erhöhen den Reibungskoeffizienten der Unterlage/Deckglas Interaktion, wodurch die Würmer am gleichen Platz bleiben.
Der Objektträger wird nun für die Axotomien vorbereitet. Die Neuronen werden unter dem Mikroskop zentriert. Der Laser wird dann durch ein Fußpedal betätigt. Die richtige Stärke des Lasers durchtrennt die Neuronen ohne die benachbarten Strukturen zu beeinträchtigen. Es werden so viele Axonen wie möglich pro Tier durch trennt.
Das Agarosekissen wird sorgfältig von dem Objektträger entfernt und die Würmer können sich auf einer NGM Platte mit Bakterien erholen. Zwischen 8-48 Stunden nach der Axotomie werden die Neuronen auf ihre Regeneration überprüft. Distal von dem Schnitt bilden die Neuronen einen Stumpf. Der proximale Teil der Neuronen regeneriert sich und bildet längliche Neuriten.
Das war die Einführung von JoVE in die Haltung von Caenorhabditis elegans. In diesem Video haben wir uns die Behausung und Fütterung, Handhabung, und das Gefrieren und Auftauen von C. elegans angeschaut.
Wir haben uns außerdem einige Anwendungen, weshalb C. elegans ein so leistungsstarkes Forschungswerzeug ist, angeschaut. Auch wenn C. elegans in vielerlei Hinsicht anders als Säugetiere sind, haben sie eine ähnliche genetische Bauweise, und sind einfach zu halten. Da man sie einfach verändern kann sind sie ein wichtiges Modellsystem um Säugetierbiologie und Krankheiten zu verstehen. Danke für eure Aufmerksamkeit.
