Drosophila melanogaster ist wegen seiner Einfachheit und Vielseitigkeit ein weit verbreiteter Modellorganismus. Die Immunhistochemie einer Drosophila Larvenpräparation ist eine wertvolle Methode, mit welcher man die Anwesenheit, die Position, und die Kolokalisation von Proteinen bestimmen kann. Dieses Video zeigt die grundlegenden Methoden der Präparation, Fixierung, Blockierung, und dem Befestigen von Larvengewebe von Drosophila. Es werden außerdem Beispiele von Anwendungen gezeigt.
Immunhistochemie ist ein Prozess, bei dem modifizierte Antikörper ein Zielprotein binden und dieses schließlich in Geweben visualizieren.
Bei der Immunhistochemie ist die richtige Präparation, welche akkurat und zügig gehen sollte wegen der Empfindlichkeit des Larvengewebes, wichtig.
Präparationen werden normalerweise in phosphatgepufferter Salzlösung, kurz PBS, ausgeführt. Nach der Extraktion werden die Organe temporär in PBS gelegt – also einer Salzlösung mit dem gleichen pH-Wert wie der interne pH-Wert der Larve. Nach der Präparation ist der nächste Schritt in der IHC der Drosophila Larve die Fixierung.
Die Fixierung ist ein Prozess, bei dem Gewebe in eine verdünnte, auf Formaldehyd-basierende Lösung gelegt wird, welche das Gewebe erhält. Die Fixierlösung verhindert dass Enzyme Proteine in dem Gewebe zersetzen. Nach der Fixierung und während der Immunfärbung finden mehrere Waschschritte mit PBS, das Triton-X enthält (auch PBSt genannt), statt. Triton-X100 stellt eine kleine Menge an Detergenz dar, welche die Oberflächenspannung vermindert und die Zelle permeabilisiert, so dass die Antikörper und andere Reagenzien in die Zelle eindringen können. Nach der Fixierung und dem Waschen kann das Gewebe blockiert werden.
Die Blockierlösung enthält Proteine, welche das Gewebe binden und nicht spezifische Bindungsseiten besetzen, wo sich sonst die Antikörper festsetzen würden. Das Blockieren ist wichtig, um kein falsch positives Signal zu erhalten. Nach dem Blockieren wird das Gewebe für die Färbung vorbereitet.
Die Färbung beinhaltet die hoch-spezifische Bindung des Primärantikörpers an das Zielprotein, was auch als Antigen bezeichnet wird. Ein Sekundärantikörper, der an ein Reportermolekül gekoppelt ist, bindet an den Primärantikörper. Das Reportermolekül emittiert ein lokalisiertes Signal, dass häufig fluoresziert und daher visualisiert werden kann. Nach jedem Antikörper-Inkubationsschritt wird der überschüssige Antikörper weggewaschen, damit die Antikörper, die nicht-spezifisch binden, entfernt werden. Nach der Färbung muss die Probe befestigt werden.
Um das Ergebnis der Färbung zu sehen, muss das Gewebe vorsichtig auf einen Objektträger aufgelegt werden. Eine zähflüssige Reagenz oder Eindeckmedium werden benutzt, um das Gewebe zu umschließen. Die Probe kann dann unter dem Mikroskop angeschaut werden. Nun dass wir uns mit den Grundlagen der Drosophila Immunhistochemie beschäftigt haben, zeigen wir euch wie man die Methode ausführt.
In diesem Video konzentrieren wir uns auf die Reagenzien, Werkzeuge und die Methoden, welche man braucht um Gehirngewebe der Drosophila Larve für die Immunhistochemie vorzubereiten. Wir fangen mit der Fixierung an. Die Methode, welche wir benutzen, verwendet das ganze Gehirn und wird als „Ganzgehirnfärbung“ bezeichnet. Diese Präparationsmethode ist abhängig von der Gewebeart, mit welcher man experimentiert, aber die Hauptschritte der IHC sind gleich. Wir fangen also mit dem Fixieren an.
Nachdem das Gehirn der Larve vollständig seziert wurde, wird das PBS mit einer Pipette abgesaugt. Man gibt die Fixierlösung hinzu und inkubiert das Gewebe je nach dem spezifischen Protokoll: für das Gehirn 23 Minuten. Nach dem Fixieren werden die Proben vier Mal in PBSt gewaschen. Danach inkubiert man die Proben für mindestens 30 Minuten in Blockierlösung bei Zimmertemperatur.
Nun inkubiert man eine angemessen verdünnte Primärantikörperlösung über Nacht bei 4˚C. Nach der Inkubation werden die Gehirne vier Mal mit PBSt mit einer Pipettenspitze bei Zimmertemperatur gewaschen. Danach inkubiert man die Proben mit dem Sekundärantikörper bei 4˚C über Nacht im Dunkeln, damit die Fluorochrome nicht ausbleichen. Nun wäscht man die Gehirne wiederum vier Mal mit PBSt.
Zur Äquilibrierung lässt man die Gehirne nun für eine Stunde in der Eindecklösung. Nach der Äquilibrierung transferiert man die Gehirne mit einer P200 Pipette mit einer abgeschnittenen Spitze auf einen Objektträger.
Nun setzt man Platzhalter um die Probe herum, damit sie nicht zerdrückt wird. Danach setzt man ein Deckglas auf die Probe. Die Kanten werden mit Nagellack versiegelt. Die Larvengehirne kann man nun durch Immunhistochemie visualisieren.
Nun dass wir uns mit der Immunhistochemie der Drosophila Gehirne beschäftigt haben, schauen wir uns einige alternative IHC Verfahren an.
Alternative Präparations- und Fixierungsmethoden können verwendet werden, um Drosophila Larven für die Abbildung vorzubereiten. In diesem Experiment wollen Wissenschaftler verstehen, wie Zellen spezifische Formen bilden. Das wird durch das Nachvollziehen der Morphologie von trachealen, terminalen Zellen der Larve gemacht. Die Forscher benutzen eine mutante Fliegenlinie, welche GFP exprimiert. Die GFP Expression wird durch Hitzeaussetzung in einem Wasserbad eingeleitet.
Die Larven werden dann unter einem Fluoreszenzseziermikroskop präpariert. Fliegen mit Fluoreszenz haben erfolgreich GFP angeschaltet. Die Fliegen werden dann alternativ durch Hitze fixiert; die Präparation ist nicht notwendig. Unter der Benutzung von Software, um das Nachverfolgen zu vereinfachen, können die zellulären Morphologien der trachealen Abzweigungen und Lumen identifiziert werden.
Die Eierstöcke der Drosophila sind eine exzellentes Modellsystem um zu verstehen, wie Stammzellen mit der zellulären Umwelt interagieren.
IHC der Drosophila Eierstöcke fängt mit der Identifizierung von Drosophila Weibchen an, indem man schaut ob Eierstöcke oder Hoden, welche einfach an Männchen zu erkennen sind, vorhanden sind. Die gesammelten weiblichen Larven werden in einzelne Wells transferiert, wo sie vorsichtig präpariert werden, um die Struktur, die auch als Fettkörper bezeichnet wird und in welcher die Eierstöcke sind, zu erhalten.
Die Fettkörper werden dann fixiert und gefärbt. Nachdem die Gewebe auf einen Objektträger gelegt worden sind, werden die Eierstöcke von dem Fettkörper getrennt. Nach dem Befestigen und Visualisieren zeigt die fluoreszente Färbung den Ort, wo somatische Zellen und die ursprünglichen Keimzellen in dem Eierstock der Larve sind.
Die Immunhistochemie der Drosophila Larve ist ähnlich der IHC, welche man für erwachsene Fliegen oder Puppen anwendet. Zum Beispiel können Forscher IHC benutzen, um sich die Netzhaut der Drosophila in verschiedenen Entwicklungsstadien anzuschauen: der Puppe, Larve und den erwachsenen Fliegen. Dadurch werden die Unterschiede in der Immunhistochemie-Metode zwischen Puppen, Larven und erwachsenen Fliegen dargestellt. Die Ergebnisse zeigen die verschiedenen Stadien der Entwicklung der Drosophila Netzhaut.
Die Immunhistchemie der Drosophila Larve ist ein wichtiges Werkzeug mit vielen Anwendungen und Variationen. In diesem Video haben wir uns mit dem Verfahren der Immunfärbung der Larve beschäftigt, einschließlich der Präparation, Fixierung, Färbung, und der Befestigung. Danke für eure Aufmerksamkeit!
