MH dankt für die Unterstützung von der &quot;Deutschen Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Autor Beiträge: MH entworfen Forschung; KT, JS und MT durchgeführt Forschung und analysiert die Daten, KT und MH schrieb die Zeitung.

1. Kultivierung von Chlamydomonas <ol><li> Das folgende C reinhardtii Stämme wurden in der vorliegenden Studie verwendet: WT cc124, WT CW15-Arg7 (zellwand und Arginin Auxotroph), ein ΔPSI mutierten Stamm 29 und ein pgrl1 Knock-out-Stamm 4. </li><li> Alle Stämme wurden in Tris-Acetat-Phosphat-(TAP)-Medium 30, bei 25 ° C mit einem kontinuierlichen Lichtstärke von 20-50 &amp;mgr; E / m 2 s und bei 120 Upm Schütteln gezüchtet. Die Kultur der ΔPSI sollten mit etwas Seidenpapier zur Belichtung von &lt;5 uE / m 2 sec gewickelt werden. </li><li> Die Kulturen der markierten Stämme (ΔPSI und WT cc124, respectively) enthielt 7,5 mM 15 N NH 4 Cl, während die Kulturen für die unmarkierten Stämme (WT CW15-Arg7 und pgrl1, respectively) enthielt 7,5 mM 14 N NH 4 Cl. Zellen für mindestens vier generiere wachsenIonen in voller Kennzeichnung und zu erreichen, müssen in der exponentiellen Wachstumsphase gehalten werden. </li><li> Am Tag vor Beginn des Experiments zu zählen und zu verdünnen Zellen auf eine Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in einem Volumen von mindestens 750 ml / Stamm. </li></ol> Bitte beachten Sie, dass zwei Arten von diskontinuierlichen Saccharose-Dichtegradienten in dem folgenden Protokoll beschrieben. Die Photo Saccharose-Dichtegradienten nach Takahashi et al. 9 werden verwendet, um die verschiedenen photosynthetischen Proteinkomplexe aus isolierten und solubilisierten Thylakoide während über Nacht Zentrifugation trennen und haben den Tag vorbereitet werden, bevor (siehe Protokoll Nr. 2) und der thylakoid Saccharose-Dichtegradienten 8 sind in der thylakoid Isolierungsverfahren angewendet (siehe Protokoll Nr. 3). 2. Herstellung von Photo Sucrose Dichte Gradienten <ol><li> Zum Ausgießen der Gradienten drei Stammlösungen benötigt: <ol><li> 2 M Saccharose </li><li> 10% β-DM in H 2 O </li><li> 0,5 M Tricin, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> Mit diesen Aktien, bereiten Sie die folgenden Lösungen: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Konzentration: </td><td style="width:75px;"> 1,3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0,85 M </td><td style="width:75px;"> 0,7 M </td><td style="width:75px;"> 0,65 M </td><td style="width:75px;"> 0,4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M Saccharose </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8,5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6,5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46;-DM </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M Tricin </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H 2 O </td><td style="width:75px;"> 6,7 ml </td><td style="width:75px;"> 9,7 ml </td><td style="width:75px;"> 11,2 ml </td><td style="width:75px;"> 12,7 ml </td><td style="width:75px;"> 13,2 ml </td><td style="width:75px;"> 15,7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Verwenden Sie 14 mm x 89 mm Zentrifugenröhrchen und gießen die Gradienten sehr langsam, beginnend mit der höchsten Dichte Saccharose-Lösung niedriger Dichte Lösung. </li><li> Pour nur jeweils 1 ml der 1,3 und 1,0 M Lösung und 2 ml für den Rest der Lösungen. </li><li> Lassen Gradienten über Nacht im Kühlraum. </li></ol> 3. Anaerobe Induktion und Isolierung von Thylakoidmembranen 8 <ol><li> Bevor mit der Isolierung von Thylakoidmembranen induzieren anaeroben Bedingungen unter Durchblasen von Argon 4 Stunden. Die Blasenbildung kann durch eine Glaspipette in die Kultivierung Kolben unter ständigem Mischen der Kultur mit einem Magnetrührer durchgeführt werden. </li><li> Beginnen mit der Isolierung von Thylakoidmembranen durch Pelletieren der Zellen 5 min bei 2500 × g, resuspendieren in H1-Puffer (0,3 M Saccharose, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl 2). (Bitte beachten Sie, dass beim Start mit der Isolierung von Thylakoidmembranen Proben should auf Eis gehalten werden, um den Proteinabbau zu vermeiden, werden alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C durchgeführt und die Arbeit mit Handschuhen wird dringend empfohlen, Keratin-Kontamination zu vermeiden.) </li><li> Pellet-Zellen für 5 min bei 2.500 × g, Resuspendieren in Puffer H1. </li><li> Brechen Sie die Zellen mit zwei Durchgängen durch einen Zerstäuber mit einem Stickstoffdruck von 1500 hPa (für die Stämme ohne Zellwand nicht nur ein Durchgang). </li><li> Spin down Zellen für 7 min bei 2.500 x g. (Nach diesem Schritt der Überstand sollte hellgrün sein, wenn nicht, war die Zellbruch nicht erfolgreich.) </li><li> Die Zellen in H2-Puffer (0,3 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) und Pellet-Zellen für 10 min bei 32.800 x g. </li><li> Die Zellen in H3-Puffer (1,8 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) und homogenisieren Pellets mit einem Töpfer (keine grünen Partikel sollten am Ende dieser Arbeitsschritt bleiben). </li><li> Bereiten thylakoid Saccharose-Dichtegradienten in WanneES (25 mm x 89 mm) von unten beginnend mit einer Schicht aus 12 ml H3-Puffer mit Zellen, gießen eine mittlere Schicht aus 12 ml H &amp;sub4;-Puffer (1,3 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA ( pH 8,0)) und auf 12 ml H5-Puffer (0,5 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Seien Sie vorsichtig beim Gießen der Steigungen und vermeiden das Mischen der drei Schichten. </li><li> Waage mit H5-Puffer und Zentrifuge thylakoid Saccharose-Dichtegradienten für 1 Stunde bei 70.700 x g. </li><li> Entfernen thylakoid Bands aus den thylakoid Saccharose-Dichtegradienten und verdünnt sie mit einem geeigneten Volumen H6-Puffer (5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). </li><li> Spin down Zellen bei 37.900 g für 20 min. Wenn das Pellet ist nicht fest, ist mehr H6 Puffer für diesen Zentrifugationsschritt erforderlich. </li><li> Resuspendieren Thylakoide in einem kleinen Volumen Puffer H6 und fahren mit der Bestimmung des Chlorophyllkonzentration. </li></ol> 4. Bestimmung des Chlorophyll-Konzentration 31 </sup&gt; <ol><li> Die Bestimmung der Chlorophyllmenge wird mit 80% Aceton durchgeführt. </li><li> Mischen Sie 995 ul 80% Aceton und 5 ul der Thylakoide in H6-Puffer (Verdünnung 1:200). </li><li> Vortex für mehrere Sekunden, bis keine grüne Partikel verbleiben und dann drehen sich mit 14,1 xg unten für 5 min. </li><li> Nehmen Sie den Überstand und Messung der Extinktion bei 663,6 und 646,6 nm und 750 nm auf. </li><li> Berechnen Sie die Chlorophyllmenge mit den folgenden Formeln: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * Verdünnungsfaktor </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * Verdünnungsfaktor </li><li> C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b </li></ol></li></ol> 5. Laden von Photo Sucrose Dichte Gradienten <ol><li> Berechnen Sie die Beträge der Thylakoide, β-DM und H6-Puffer, die benötigt werdenfür jeden Farbverlauf: <ol><li> Jede Steigung sollte mit einem Gesamtvolumen von 700 ul mit 0,8 mg / ml Chlorophyll in 0,9% β-DM (auflösen β-DM in H 2 O) geladen werden, füllen Sie das Restvolumen mit H6-Puffer. </li></ol></li><li> Für Solubilisierung bereiten verschiedene Teilmengen mit Thylakoide, β-DM und H6 Puffer für jede Steigung. </li><li> Lassen Proben für 20 min auf Eis mit regelmäßig Misch (Invertierung) alle paar Minuten (Solubilisierungsschritt). </li><li> Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (14.000 × g) für 10 min bei 4 ° C. (Nach der Zentrifugation sollte das Pellet klein und weißlich sein, während der Überstand ist dunkelgrün.) </li><li> Legen Sie Überstand an den Steigungen. </li><li> Waage mit H6-Puffer und drehen mit Ultrazentrifuge bei 134.470 xg über Nacht (14 h) bei 4 ° C. (Bitte beachten Sie, dass die erfolgreiche Trennung der Photosynthesekomplexe mit Photo Saccharose-Dichtegradienten wie in diesem Protokoll präsentiert wird nur erreicht, wenn using frisch isolierte Thylakoide, da eine Vorhersage für die Solubilisierung und komplexe Trennung ist schwierig, wenn die Arbeit mit Thylakoidmembranen, die vor eingefroren worden sind, zu machen.) </li></ol> 6. Fraktionierung von Photo Sucrose Dichte Gradienten <ol><li> Machen Sie Fotos von den Steigungen. </li><li> Punktion ein Loch an der Unterseite des Rohres mit einer Nadel und fraktionieren Gradienten in 500 ul Röhrchen. Alternativ kann die Fraktionierung auch unter Verwendung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Mikrotiterplatte) durchgeführt werden. </li><li> Bei Verwendung einer Mikroplatte bestimmen Absorption der verschiedenen Fraktionen Gradienten bei 675 nm auf. (Bei diesem Schritt können die Proben bei -80 ° C für einige Wochen gelagert werden.) </li></ol> 7. SDS-PAGE und Immun (Bitte beachten Sie, dass nur für den Vergleich von WT vs ΔPSI ein Western-Blot-Analyse durchgeführt wurde, um die Fraktionen für die anschließende MS-Analyse auswählen. Für das Experiment WT vs pgrl1 frMaßnahmen wurden mittels der Absorption in den verschiedenen Fraktionen ausgewählt.) <ol><li> Separate 30 ul jeder Fraktion von WT und ΔPSI Steigung auf einem 13% SDS-Polyacrylamid-Gel-32. </li><li> Führen Western-Blot-Analyse 33 mit den folgenden Antikörpern: ANR1 (TEF7) 26, 34 PGRL1, CAS 6, die PSI-Untereinheit PSAD 32 und die D1 PSII Kernuntereinheit. Sämtliche Antikörper mit einer Verdünnung von 1:1000 (für verstärkte Chemilumineszenz-Nachweistechnik), außer für den D1-Antikörper, der mit einer Verdünnung von 1:10000 eingesetzt werden sollte. </li><li> Basierend auf den Ergebnissen der Immundetektion, nehmen Sie die Peak-Fraktionen von ANR1, PGRL1 und PSAD für WT und ΔPSI (hier den Fraktionen 6 und 13), mischen Sie 30 ul Fraktion 6 von WT und ΔPSI und tun das gleiche mit Fraktion 13 aus beide Präparate und trennen sie wieder auf einem 13% SDS-Polyacrylamid-Gel. </li><li> Für den quantitativen Vergleich von WT vs pgrl1 nehmen Sie die CEF-Superkomplex Fraktionen durch Messung der Absorption in den verschiedenen Gradienten-Fraktionen bestimmt und mischen 30 ul beider Proben gefolgt von der Trennung auf einem 13% SDS-Polyacrylamidgel. </li><li> Färben die Proteinbanden mit Coomassie-Lösung (85% phosphoriger Säure, 757 mM Ammoniumsulfat, 1,2% Coomassie Brilliant Blau, 20% Methanol) für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Um unspezifische Färbung zu entfernen, waschen, mehrmals mit ddH 2 O. </li><li> Schneiden Sie die Bahnen in 1 mm Gelstücke und fahren mit der In-Gel-Verdauung. (Alternativ können die Proben ein paar Minuten in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und für ein paar Wochen vor der weiteren in-Gel-Verdauung gespeichert.) </li></ol> 8. In-Gel-Verdauung (Geändert von Shevchenko et al. 35) Bitte beachten Sie, alle Puffer und Lösungen kurz vor der Verwendung vorzubereiten und Glasflaschen für Puffer Acetonitril (ACN) enthalten. &lt;br /&gt; ACHTUNG! Arbeiten mit ACN schädlich sein könnten, mehr Informationen können heruntergeladen werden unter: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Für 30 Sekunden waschen Gel-Stücke mit&gt; 10 Volumen ddH2O (~ 200 ul). </li><li> Die Gelstücke mit 300 &amp;mgr; l von 25 mM NH 4 HCO 3 für 15 min unter Schütteln inkubieren, Entfernen Flüssigkeit. </li><li> Die Gelstücke mit 300 &amp;mgr; l von 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% ACN inkubieren (Herstellung durch Mischen ACN und 50 mM NH 4 HCO 3 in einem Verhältnis von 1:1) für 15 min unter Schütteln entfernen Flüssigkeit. </li><li> Wenn die Gelstücke noch blau, wiederholen der NH 4 HCO 3 und NH 4 HCO 3 / ACN wäscht, bis die meisten der Coomassie entfernt. (Obwohl der Großteil der Coomassie-Färbung entfernt werden sollte, ist es nicht notwendig, die Gelstücke vollständig entfärben.) </li><li> 100 l ACN, um die Gel-Stücke für 5 min zu entwässern. Die Gel-Stücke sollten einen Schrumpfnd schauen ganz weiß. </li><li> Entfernen Sie so viel wie möglich ACN und fahren mit Trypsin Verdauung. Alternativ können die Proben bei -20 ° C für einige Wochen gelagert werden. </li><li> In 10-20 ul pro Band von 20 ng / ul Trypsin in 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (frisch verdünnt), halten Sie Proben auf Eis. </li><li> Nach 30 Minuten prüfen, ob alle Lösung absorbiert wurde und noch mehr Trypsin-Puffer, falls erforderlich. Gel Stücke sollten vollständig mit Trypsin Puffer bedeckt sein. Halten Proben auf Eis. </li><li> Lassen Sie Gel-Stücke für weitere 90 min auf Eis, um sie mit Trypsin zu sättigen. (Critical Schritt: die Ausbeute an tryptischen Peptiden nimmt mit zunehmender Inkubationszeit auf Eis, wahrscheinlich aufgrund der langsamen Diffusion des Enzyms in der Polyacrylamid-Matrix ist es erforderlich, einen geringen Überschuß an Lösung zu haben für die Gelstücke zu vermeiden, dass die Stücke. fallen trocken während der Inkubation über Nacht.) </li><li> Digest bei 37 ° C für 4-6 Stunden. Für Experimente erfordernmaximale Peptidrückgewinnung, über Nacht zu verdauen. </li><li> Nach der Verdauung Spin-Down verkürzte Puffer. </li><li> Ultraschallbad Rohre für 5 min auf Peptide und Zentrifuge wieder eluieren. </li><li> Überstand sammeln und übertragen sie in ein neues Röhrchen. </li><li> Führen Peptid Extraktion mit 80 ul von 30% ACN / 1% Ameisensäure (FA) in einem Ultraschallbad für 15 min. </li><li> Führen Extraktion mit 80 ul von 30% ACN / 1% FA in einem Ultraschallbad für 15 min. </li><li> Führen Extraktion mit 80 ul von 70% ACN / 1% FA in einem Ultraschallbad für 15 min. </li><li> Zentrifuge wieder und Pool-Überstand mit dem Eluat vor. (FA dient Trypsin zu inaktivieren und erhöhen Peptidlöslichkeit.) </li><li> Chemische Peptid-Lösung vollständig in einer Vakuumzentrifuge. (An dieser Stelle Proben können für ein paar Wochen in -20 ° C, bevor mit MS-Analyse zu speichern.) </li><li> Resuspendieren Peptide in 6 ul MS-Puffer (5% ACN, 0,1 v / v FA, Wasser) und beschallen für 2-5 min. </li><li> Centrifuge Proben bei maximum Geschwindigkeit für 5 Minuten, um Partikelmaterial zu entfernen. </li><li> Verwenden von 4 ul Überstand für die massenspektrometrische Analyse. </li></ol> 9. MS-Datenanalyse mit &quot;Proteomatic&quot; Die Datenanalyse wurde mit dem Open-Source-Software &quot;Proteomatic&quot; (die bei http://www.proteomatic.org/ heruntergeladen werden kann), eine Plattform, die die Erzeugung und Beendigung von MS / MS-Daten Auswertung Rohrleitungen, durch die Verwendung erlaubt geführt freie und kommerzielle Software-36. Kurz gesagt, werden die nachfolgend beschriebenen Einstellungen und mehr Informationen finden Sie in 6,26 gefunden werden. <ol><li> Identifizierung und Quantifizierung der MS-Daten Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen aus der Experimente WT vs ΔPSI wurden mit OMSSA (Version 2.1.4 37) und qTrace bzw. 26 erfolgt, wie beschrieben, 6,26. Für die MS-Datenanalyse aus dem Experiment WT vs pgrl1 die folgende aktualisierte Pipeline verwendet:<ol><li> Neben OMSSA 37, wurden die Proteine ​​auch mit X identifiziert! Tandem (Version 2013.02.01 38). Beide Algorithmen wurden durch die Suche gegen einen durch die Kombination der JGI Chlamydomonas Gen Modell-Datenbank der Version 4.3 mit der AUGUSTUS Datenbank Version 10.2 sowie gegen eine beigetreten Datenbank der NCBI Datenbank angewendet erzeugt Datenbanken BK000554.2 und NC_001638.1. </li><li> MS 2 Identifizierung von Peptiden wurde unter Verwendung einer ziel Köder Ansatz 39 durchgeführt. Ein Köder für jedes Protein wurde durch Mischen zufällig tryptischen Peptide unter Beibehaltung der Redundanz der nonproteotypic Peptiden geschaffen. </li><li> Statistische Validierung der Peptide wurde mit der Software qvality (Version 0.3.3 40) mit einem hinteren Fehlerwahrscheinlichkeit (PEP) Schwellenwert von weniger als 0,01 und die Ergebnisse wurden mit einer Vorläufermasse Toleranz von 5 ppm filtriert geführt. </li><li> Peptide aus OMSSA und X! Tandem-Läufe wurden zusammengefügt und mit qTrace quantifiziert <sup&gt; 26 Anwendung der folgenden Filterstufen: 2 Identifizierung erfordern MS, fügen Protein-Namen / Gruppeninformationen und erfordern sowohl Schwester Peptiden. </li></ol></li></ol> Um zu untersuchen, ob Protein-Verhältnisse in den gemischten CEF-Superkomplex-Fraktionen von WT und pgrl1 signifikant unterschiedlich zueinander, wurde die statistische Analyse durchgeführt, die Anwendung der Software SPSS (Version 21). Die Untereinheiten des Cytochrom b 6 / f-Komplex wurden gegeneinander als auch die Proteine ​​FNR FTSH2 HCF136 und gegen die PSI-Untereinheiten getestet. Die Peptid-Verhältnisse von jedem Scan Zahl pro Protein von allen vier Wiederholungen wurden auf Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilks-Test geprüft. Da die Peptidpopulationen nicht normal verteilt (p &lt;0,001) wurden nichtparametrische Statistik durchgeführt. Zunächst wurde der Kruskal-Wallis-Test angewendet Beurteilung einer erheblichen Unterschiede zwischen den Gruppen. Nur wenn dieser Test vorhergesagt signifikanten Unterschieds zwischen den Gruppen wurde eine weitere Analyse durchgeführt, um signifikante Unterschiede zwischen den beiden unabhängigen Gruppen mit dem Mann-Whitney-U-Test vorherzusagen.

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden Finanz Interesse.

Verschiedene quantitative Proteomik-Studien unter Verwendung von stabilen Isotopenmarkierung sind in den letzten Jahren veröffentlicht worden. In diesen Versuchen in der Regel zwei verschiedenen Proben verglichen werden, von denen eine Probe mit einem stabilen Isotop markiert. Danach Proteine ​​oder Peptide, die von den beiden Proben werden in einem gleichen Verhältnis vereinigt und gemeinsam weiter verarbeitet 48. Solche Studien wollen oft definiert isoliert zellulären Kompartimenten (zB Chlo...

Photosyntheseprozesse Thylakoidmembran von Pflanzen und Algen in einer linearen und cyclischen Modus. Während der linearen Elektronenfluss (LEF) Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII) und Cytochrom b 6 / f letztlich Elektronen übertragen von Wasser zu NADP + 1, was zu der Erzeugung von NADPH und ATP 2. Im Gegensatz dazu zyklischen Elektronenfluss (CEF), die bekannt ist, um unter verschiedenen Umgebungsbedingungen, wie der Zustand 2 3 und 4 anaeroben Bedingungen, Ergebnisse in der Rückreduktion des oxidierten PSI durch Injizieren von Elektronen in die Elektronentransportkette induziert werden. Dieser Prozess kann entweder an der Stroma-Seite des Cytochrom b 6 / f-Komplex 1 oder am Pool Plastochinons 5 finden kann und erzeugt ATP, aber kein NADPH 2. Das Ziel der vorliegenden Protokolls ist es, eine Massenspektrometrie (MS) basierend m demonstrierenethode für die vergleichende quantitative Analyse von Multiproteinkomplexen in der Thylakoidmembran von Chlamydomonas reinhardtii, um Einblick in die Zusammensetzung dieser Komplexe unter verschiedenen Bedingungen (durch Vergleich der genetisch verschiedene Stämme beispielhaft) zu gewinnen. Dieser Ansatz wurde in einer Veröffentlichung von Terashima et al angewendet. Im Jahr 2012, die eine Ca 2 +-abhängige Regulation der CEF in C. reinhardtii von einem Multiproteinkomplex einschließlich der Proteine ​​CAS, ANR1 und PGRL1 6 vermittelt. Das Verfahren wird durch vergleichsweise Analyse der Zusammensetzung der CEF-Superkomplex in zwei genetisch verschiedene Stämme, wodurch der Vorteil der Markierung eines der beiden Stämme mit schweren Stickstoff (N 15) erläutert. Kurz gesagt, enthält das Protokoll die Vorbereitung der Thylakoidmembran, gefolgt von Waschmittel Solubilisierung und Fraktionierung der Photosynthesekomplexe in einem Saccharose-Dichtegradienten. Nach Fraktionierung des Gradienten, ausgewählt fracgen der beiden Stämme gemischt, basierend auf dem gleichen Volumen von SDS-PAGE, gefolgt von In-Gel-Verdauung und anschließende quantitative MS-Analyse getrennt. Wie oben erwähnt, wird CEF unter verschiedenen Umweltbedingungen induziert und eine Veröffentlichung aus dem Jahr 2010 zeigt die Isolierung eines funktionellen CEF-Superkomplex vom Zustand 2 verriegelt Zellen von C. reinhardtii 7, die durch die Trennung solubilisierten Thylakoidmembranen auf einem Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation bei geführt wurde. Anders Iwai et al. 7, das vorgestellte Protokoll beschreibt die Isolierung des CEF-Superkomplex aus der anaeroben gewachsen C. reinhardtii Kulturen, indem Sie ein alternatives Verfahren. Dies umfasst Veränderungen in der Thylakoidmembran Isolierungsprotokoll als auch Unterschiede in der Lösungsschritt und der Trennung der Proteinkomplexe durch Ultrazentrifugation. In dem vorliegenden Protokoll Thylakoidmembranendurch Anwendung der von Chua und Bennoun 8 veröffentlichten Verfahren, die Puffer für thylakoid Herstellung von Iwai et al verwendet isoliert. enthielt 25 mM MES, 0,33 M Saccharose, 5 mM MgCl 2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5), wie beschrieben, 9. Die Solubilisierung wurde mit 0,7-0,8% Detergens (n-Tridecyl-β-D-maltosid) für 30 min auf Eis im Fall von Iwai und Mitarbeitern durchgeführt, während das hier beschriebene Solubilisierung Verfahren beruht auf der Verwendung von 0,9% Detergenz (n -Dodecyl-β-D-maltosid (DM-β)) und nur für 20 Minuten auf Eis durchgeführt. Beide Gruppen verwendeten 0,8 mg Chlorophyll pro ml für die Solubilisierung mit dem jeweiligen Reinigungsmittel. Für die Trennung von Photosynthesekomplexen aus solubilisierten Thylakoidmembranen Iwai et al. Angewendet Saccharose-Konzentrationen zwischen 0,1 bis 1,3 M, während die Autoren dieses Protokoll Konzentrationen im Bereich von 0,4 bis 1,3 M. Der letzte Unterschied ist die Zentrifugation Geschwindigkeit, die geringer ist im Vergleich auf der earlier Veröffentlichung. Solubilisierung von Thylakoidmembranen mit nichtionischen Detergenzien, gefolgt von Saccharose-Dichtegradienten-Fraktionierung wurde bereits in zahlreichen Studien, die von den 1980er Jahren bis heute 7, 9-14 und auch die Anwendung von metabolischer Markierung von Proteinen ist ein weit verbreitetes Verfahren in dem Gebiet der Proteomik angewendet. Die beschriebene Vorgehensweise gilt die 15 N metabolische Markierung für eine der beiden verglichenen Stämme durch Kultivieren in Gegenwart von Schwer Stickstoff als einzige Stickstoffquelle in Form von 15 N NH 4 Cl, die in den Aminosäuren, die zu einer Masse eingeschlossen ist Verschiebung in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz des Peptids. Bei der Analyse einer Mischung von 14 N und 15 N in einem MS ausführen kann diese Massenverschiebung verwendet werden, um die Probe für jede Ursprungs-Peptid und Peptid relativen Häufigkeiten berechnet werden kann, die relative Häufigkeit der entsprechenden bestimmening Protein 15. Zahlreiche quantitative Proteomik-Studien an C. reinhardtii zur Verfügung, die eine definierte Menge an Protein zu vergleichen, um Veränderungen im Proteom zwischen experimentellen Bedingungen (zB Veränderungen im Proteom durch Nährstoff 16-19 oder Lichtstress 20,21) zu analysieren. Im Vergleich zu den Studien, in der aktuell vorgestellte Ansatz gleicher Volumina der Proben werden vereinigt und analysiert. Dieser Aufbau erlaubt es, das Migrationsverhalten der Proteine ​​innerhalb der Gradient untersuchen und darüber hinaus zur Analyse der Zusammensetzung der verschiedenen Komplexe in Bezug auf die untersuchten Stämme. Diese Methode wird vor allem durch die Konzentration auf drei Proteine ​​erklärt werden: Der erste Kandidat ist der Chloroplasten lokalisierten Kalzium-Sensorprotein CAS, die gezeigt wurde, in Foto-Akklimatisierung in C beteiligt werden 22 reinhardtii. Calcium wird als ein wichtiges Signalten Ionen für Wege, die durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren aktiviert werden, schließlich zu Veränderungen in der Genexpression und Zellphysiologie 23 führt, und es wurde vorgeschlagen, dass Chloroplasten könnte die zelluläre Ca 2 + Signal beitragen über die CAS-Protein 22,24,25. Das zweite Protein ANR1 (anaerobe Reaktion 1 6), ein Protein, das gezeigt wurde, unter anoxischen Bedingungen wachsen in C induziert werden, 26 reinhardtii. Bemerkenswerterweise wurden CAS sowie ANR1 als Untereinheiten des CEF-Superkomplex und darüber hinaus durch Verwendung von Reverse genetische Ansätze, wurde gezeigt, dass beide Proteine ​​beitragen funktionell CEF in vivo 6. Unterstützung ihrer Rolle als Funktionseinheiten dieses Proteinkomplexes identifiziert. Das dritte Protein ist die Thylakoidproteintrennung PGR5-Like 1 (PGRL1), die gezeigt wurde, in CEF in Chlamydomonas 4,27 sowie 5,28 in Arabidopsis beteiligt und war auch idin der Arbeit von Iwai et al entified. 7 Wildtyp (WT) gegen (vs) eine ΔPSI 29-Stamm und weisen eine Deletion des Gens PSAB, für einen wesentlichen Photosystem I Untereinheit, die ebenfalls Teil der Kodierung dieser Ansatz durch die die Ergebnisse von zwei verschiedenen Experimenten vorgestellt CEF-Superkomplex und WT vs pgrl1 ein Knock-out-Stamm 4. Für jeden dieser Versuche die quantitative Zusammensetzung der CEF-Superkomplex zwischen einem 15 N-und 14 N-markierten Stamm wurde verglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Chemicals</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetone</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Acetonitrile Optigrade f&#252;r LC-MS</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">9340</td>
			<td style="width:199px;">harmful, work with gloves 
			see protocol text for further precautions</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Ammonium chloride 15N</td>
			<td style="width:427px;">Cambridge Isotope Laboratories 
			website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td>
			<td style="width:119px;">39466-62-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium chloride 14N</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium sulfate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:427px;">Fisher Scientific 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td>
			<td>10041653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formic acid&#160;&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td>A4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phosphorous acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Di-Potassium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium di-hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tricine</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Tris</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer</td>
			<td style="width:427px;">Promega 
			website: http://www.promega.de/</td>
			<td style="width:119px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Neboulizer (BioNeb cell disruptor)</td>
			<td style="width:427px;">Glas-Col 
			website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes (14 x 89 mm)&#160; 
			for preparation of takahashi style gradients</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes 25 x 89 mm 
			for preparation of thylakoid isolation gradients&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fuchs-Rosenthal cell couting chamber</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">449/72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Homogenizer (Potter) 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">10618242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Pistil for homogenizer</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">105252220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Other</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Antibodies&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Agrisera 
			website: http://www.agrisera.com/en/index.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15n metabolic labeling and quantitative mass spectrometry

Das eingeführte Protokoll bietet ein Tool für die Analyse von Multiproteinkomplexen in der Thylakoidmembran, durch aufschlussreiche Einblicke in die komplexe Zusammensetzung unter verschiedenen Bedingungen. In diesem Protokoll wird der Ansatz durch den Vergleich der Zusammensetzung des Proteins für den zyklischen Elektronenfluss (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isoliert aus genetisch unterschiedlichen Stämmen Komplex verantwortlich demonstriert. Das Verfahren umfasst die Isolierung von Thylakoidmembranen, gefolgt von der Trennung in die Multiproteinkomplexen durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation, SDS-PAGE, und Immunodetektion vergleichende quantitative Massenspektrometrie (MS) basierend auf Differenzial metabolische Markierung (14 N / 15 N) des Stämme analysiert. Waschmittel solubilisierten Thylakoidmembranen auf Saccharose-Dichtegradienten in gleichen Chlorophyllkonzentration geladen. Nach Ultrazentrifugation werden die Gradienten in Fraktionen, die durch Massen spectromet analysiert werden getrenntry zu gleichen Volumen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Zusammensetzung innerhalb der Gradientenfraktionen und darüber hinaus, um das Migrationsverhalten verschiedener Proteine ​​zu analysieren, vor allem die Konzentration auf ANR1, CAS und PGRL1. Außerdem ist dieses Verfahren durch die Bestätigung der Ergebnisse mit Immunoblotting und zusätzlich, indem sie die Ergebnisse aus früheren Studien (die Identifizierung und PSI-abhängigen Migration der Proteine, die zuvor beschrieben wurden, einen Teil der CEF-Superkomplex wie PGRL1 FNR sein und zeigte cyt f). Bemerkenswert ist, ist dieser Ansatz für eine breite Palette von Fragen, auf die dieses Protokoll verabschiedet werden kann und beispielsweise für vergleichende Analysen von Multi komplexe Zusammensetzung aus unterschiedlichen Umgebungsbedingungen eingesetzt isoliert anzugehen.

Das eingeführte quantitative Proteomik Ansatz zielt darauf ab, die Zusammensetzung des Multiproteinkomplexen in Thylakoidmembranen durch die vergleichende Analyse der CEF-Superkomplex-Komponenten in genetisch verschiedenen C nachgewiesen charakterisieren reinhardtii Stämme. Das beschriebene Verfahren wurde erfolgreich von Terashima et al. 6 angelegt und umfasst die Isolierung der Thylakoidmembran von anaeroben Kulturen gezüchtet, gefolgt von Solubilisierung Waschmittel. Anschlie?...

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A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

12.1K Aufrufe.  University of Münster.  Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert. 

Serie: A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch &amp; MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...