Die Autoren danken der Sharon Gruppenmitglieder für die kritische Durchsicht und für ihre Beiträge zu dem Manuskript. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Morasha und Bikura Programme, die Israel Science Foundation (Grant Nr. 1823-1807 und 378/08), das Josef Cohn Minerva Center for Biomembrane Research, die Chais Familie Fellows Program für New Scientists, die Abraham und Sonia Rochlin Stiftung, die Familie Wolfson Charitable Trust, die Helen und Milton A. Kimmelman Zentrums für Biomolekulare Struktur und Montage; dem Nachlass von Shlomo und Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, und Karen Siem, UK. Wir danken Dan Tawfik und Itamar Yadid, dass er uns das Lektin Variante Probe.

Teil 1: Herstellung von Gold-beschichteten Kapillaren für nanoflow Elektrosprayionisation Die Analyse der nicht-kovalenten Komplexen ist in der Regel durch nanoflow Elektrospray-Ionisation (NESI) 6 durchgeführt, unter Verwendung von Glas-oder Quarz-Kapillaren, die zu einer feinen Spitze (~ 1 um Innendurchmesser) und beschichtet mit leitfähigem Material gezogen wurden (meist Gold) . Solche Kapillaren sind aus kommerziellen Quellen erhältlich (New Objective oder Proxeon) ready-to-use, aber es kann kostengünstiger, sie im eigenen Haus vorbereitet: <ol><li> Stick zwei Streifen eines doppelseitigen Klebe-Pad auf der Unterseite einer Petrischale, 2 cm voneinander entfernt. Legen Sie einen Glasstab (8 cm x 5 mm) in der Mitte eines der Pads. Die Klebe-Pad wird die Kapillaren in Position zu halten, und der Glasstab wird die vorbereitete Kapillaren zu unterstützen, und halten die Spitzen zu brechen (Abb. 1). </li><li> Verwenden Sie Borosilikatglas Kapillaren, 1,0 mm OD x 0,78 mm ID (wir verwenden Packungen von 500 dünnwandigen Kapillaren aus Borosilikatglas Warner Instruments, cat. Nr. G100TF-4). Stecken Sie ein in die Nadel Abzieher (wir benutzen Modell P-97 aus der Sutter Instrument Co.) Kapillare. Klemmen Sie die Kapillare vorsichtig in Kraft, und stellen Sie ihre Position so, dass es in der Mitte der Nadel puller ist Heizdraht liegt. Ziehen Sie die Klemmen vorsichtig, bis die Kapillare gehalten Firma an beiden Enden. </li><li> Ziehen Sie die Kapillare mit einem vorgegebenen Programm. Jede Kapillare gezogen wird zu zwei letzten, geformt Kapillaren geben. Der Prozess der Programmierung der Abzieher ist eine Trial-and-error, bis eine akzeptable Form der Spitze erreicht ist. Wir verwenden das folgende Programm: <table border="1"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Wärme </td><td> Ziehen </td><td> Vell </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Entfernen Sie die gezogen Kapillaren aus dem Gerät und überprüfen Sie die Tipps, verwirft alle, die verformt oder gebrochen sind. Verwenden Sie stumpfen Pinzette (wir verwenden Bestückungspinzetten von CK Precision), um die Kapillaren in der Petrischale Platz. Die Basis der Kapillare sollte der Klebestreifen befestigt werden und der obere Teil sollte auf dem Glasstab schlank, mit der Spitze nach oben zeigt. </li><li> Sobald der Petrischale voll ist (etwa 80 Kapillaren passen in einen 10 cm-Durchmesser Teller), legen Sie die Platte in die Gold-Sputter-Coater (wir benutzen Modell-Nr. EMS550 von EMS). Stellen Sie sicher, dass die Gaszufuhr nach den Anweisungen des Herstellers gewählt wird, und aktivieren Sie eine vordefinierte Beschichtung Zyklus (wir verwenden Argon Druck 4 bar, bei einem Vakuum von 5 x 10 -2 mbar, einen Strom von 45mA und einer Beschichtung Zeit 1 min, für 3-6 Zyklen, bis die Kapillaren sind gleichmäßig golden). </li></ol> Teil 2: Probenvorbereitung <ol><li> Low mikromolaren Konzentrationen der Probe erforderlich sind (1 bis 20 uM). Wenn nötig, konzentrieren die Probe mittels Zentrifugalkraft Ultrafiltration Geräte (z. B. Vivaspin von Sartorius oder Nanosep von Pall Corporation). Es wird empfohlen, dass Sie die Adsorption der Protein-Komplex zu überprüfen, um das Gerät Membran, vor dem Gebrauch. </li><li> Oft sind die Aufreinigung Puffer oder Storage-Lösungen der Protein-Komplex nicht kompatibel mit NESI, für die nur flüchtige Lösungen verwendet werden können. Daher ist Pufferaustausch notwendig. Dieser entscheidende Schritt, in dem alle Spuren von Salzen, Puffer-Moleküle oder andere nicht-flüchtigen Addukte wie Glycerin, DTT oder EDTA entfernt werden, bestimmt die Qualität der Spektren. Normalerweise ist wässriger Ammoniumacetat-Lösung verwendet, bei einer Konzentration von zwischen 5 mm und 1 m, und bei 6-8 pH-Wert. Buffer Austausch kann mit einer Mikrozentrifuge Gelfiltrationssäule (zB Micro Bio-Spin 6 Chromatographiesäulen von Bio-Rad) werden. Dieser Schritt kann 1-3 mal mit minimaler Verdünnung (weniger als einen Faktor von 1,3 pro Gerät 5) wiederholt werden, bis maximal Austausch erreicht. Wenn beide Konzentration und Puffer Austausch erforderlich sind, kann diese zusammen durchgeführt werden, wobei Zentrifugalkraft Ultrafiltration (e, g, Vivaspin von Sartorius oder Nanosep von Pall Corporation). </li></ol> Teil 3: Kalibrierung des Massenspektrometers für hohe Masse-Messungen Die meisten der Experimente auf Multi-Protein-Komplexen durchgeführt werden unter Verwendung eines Nano-Elektrospray-Quadrupol-Time-of-flight (Q-TOF)-Instrument. Es wird empfohlen, dass Sie ein Quadrupolmassenfilter angepasst werden, um tiefe Frequenzen zu verwenden, um die Übertragung und die Masse Analyse von Ionen mit hoher m / z-Werte 7,8 zu ermöglichen. Es istauch empfohlen, dass Gaseinlässe 7,8 oder Hülsen 9, das Instrument in der ersten Ionenleitsystems hinzugefügt werden, um den Druck steuern bei der ersten Vakuum-Phase zu ermöglichen. Letzteres ermöglicht eine Optimierung des Getriebes, und Desolvatation von sehr großen Ionen 7-9. Derzeit sind kommerzielle ESI-TOF-und Q-ToF Instrumenten verschiedener Hersteller (z. B. Wasser, SCIEX, Bruker, oder Agilent), die relativ leicht und kostengünstig angepasst werden können, für die native MS-Anwendungen 7,8 zur Verfügung. Es ist jedoch möglich, Standard-ToF oder QTof Konfigurationen auf Instrumente wie die LCT oder QToF1 (Waters) verwenden, um Massenspektren der Komplexe bis zu 1 MDa zu erwerben, ohne die Notwendigkeit für Änderungen an der Hardware 5. Das Protokoll unten beschrieben wurde auf einem SYNAPT Instrument (Waters) durchgeführt. <ol><li> Es werden 100 mg / ml Lösung von CsI in gereinigtem Wasser. CsI ​​ist für hohe Masse Kalibrierung als einfach geladene Salz-Clustern (CsI) n Cs verwendet + erstrecken sich über einen weiten Massenbereich von 393 m / z auf deutlich über 10.000 (Abb. 2). </li><li> Mit stumpfen Pinzette, einen beschichteten Kapillare aus der Petrischale und laden 2μL der CsI-Lösung in die Kapillare mit Hilfe eines Eppendorf GELoader Spitze. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die Kapillarenhalter, und passen Sie die Kapillare in der Weise, dass die Spitze etwa 10 mm vom Rand entfernt von der Halterung befindet. </li><li> Schieben Sie die Lösung auf die Spitze der Kapillare entweder manuell oder mittels eines Spin-Down-Adapter. </li><li> Legen Sie die Kapillare unter einem optischen Mikroskop und schneiden Sie die Spitze, mit der scharfen AA-Pinzette. </li><li> Schließen Sie das Kapillarenhalter die nanoflow ES-Schnittstelle. Drehen Sie die XYZ-Bühne zurück, um eine Beschädigung der Kapillare und drücken Sie die Bühne in ihrer aktivierten Position. Die Kapillare sollte 1 platziert werden - 10 mm aus dem Konus Öffnung. </li><li> Bewerben Kapillar-Spannung (1050-1400 V) und geringer nanoflow Druck (0,00 bis 0,03 bar) bis spray eingeleitet wird, dann versuchen, die nanoflow Druck auf minimale Werte reduzieren. </li><li> Optimieren Sie die Signalintensität durch Verstellen der Position der XYZ-Bühne, die kapillare Spannung, die nanoflow Druck, und der zugeführten Gases fließen. </li><li> Zur Erkennung eines breiten Massenbereich von CsI Peakserie, sollte die beschleunigende Spannungen optimiert (wir verwenden die folgenden Parameter: Kapillare 1,3-1,7 kV, Probe Kegel 80-150V, Extraktion Kegel 1-3 V) werden. </li><li> Zur Optimierung der Übertragung von hohen Masse-Ionen, die sanfte Desolvatation Bedingungen, die Unterstützung Druck in der ersten Vakuum-Phase, zwischen der Quelle und der Analysator erforderlich, angehoben werden sollten. Dies kann durch eine sorgfältige Reduktion der Leitfähigkeit von der Quelle Vakuumleitung die Scroll-Pumpe, durch teilweises Schließen Sie das Absperrventil (SpeediValve) erreicht werden. Um den optimalen Punkt zu definieren, sollte letzteres getan, während die Überwachung der Wirkung auf die Signalintensität (verwenden wir im allgemeinen 3,0-6,5 mBar) werden. </li><li> Sammeln Sie ca. 30 Scans bei 1 Scan / sec, bei einem m / z Bereich zwischen 1.000 bis 15.000 m / z </li><li> Nach dem Erwerb, kalibrieren Sie die TOF mit der entsprechenden Kalibrier-Tabelle. </li></ol> Teil 4: MS-Analyse von intaktem Protein-Komplexen <ol><li> Legen Sie Ihre Probe, wie beschrieben (Teil 3, § § 2-5), und initiieren sprühen. </li><li> Beginnen Sie mit der ersten Optimierung der Spray (Teil 3, § § 6-9), bis das Signal erkannt wird. Die genaue Position der Ladung Staaten Protein-abhängige, aber es kann vorhergesagt werden, mit der Beziehung zwischen Ionen-Masse und mittlere Ladezustand, also: (Z av) 10: Z av = 0,0778 √ (m), in denen m ist die Masse des Komplexes in Dalton. Um zu verhindern, komplexe Dissoziation, nicht Wärme der Ionenquelle: Entweder schalten die Heizung aus, oder halten Sie die Temperatur unter 40 ° C. </li><li> Variieren Sie die Kapillare Position Probe Kegel und Extraktor Spannungen Ionentransmission zu maximieren, und überprüfen Sie die daraus resultierende Veränderung in den Spektren. 1 V; Kapillar-Spannung 1,5 kV: Abzug Kegel; Ein möglicher Ansatzpunkt könnte Konusspannung 100 V sein. Optimieren Sie diesen Parameter in Kombination mit dem nanoflow Druck. </li><li> Zur Verbesserung Desolvatation und ausziehen Restwasser und Puffer-Komponenten, erhöhen Sie die Vorspannung und der Gasdruck in der Stoßzelle. Dieser Schritt sollte sorgfältig durchgeführt werden, Dissoziation des Komplexes zu verhindern. Typische Bias-Spannungen liegen im Bereich von 10-100 V, mit einer Falle Gasfluss von 1-10 ml / min (Abb. 3). Die manuelle Einstellung der HF-Umgebung und Quadrupol-Profil verbessern kann die Übertragung von hohen Masse-Ionen. </li><li> Passen Sie Trap-und Transfer Kollisionsenergien. Oft sind höhere Spannungen für die Übertragung von hohen Masse-Ionen (in der Regel im Bereich von 10-30 V) erforderlich. An dieser Stelle ist es wichtig, Kollisions-induzierte Dissoziation des Komplexes zu vermeiden. </li><li> Nach ein stabiles Signal wird reached, empfiehlt es sich, dass die nanoflow Druck und Kapillar-Spannung auf minimale Werte reduziert werden, bei stabiler Spray. </li></ol> Teil 5: Tandem-Massenspektrometrie: distanziert Protein-Komplexe <ol><li> Sobald ein optimales und stabiles Signal erhalten worden ist, wählen Sie ein Vorläufer-Ion. Setzen Sie den Massenmittelpunkt und Isolation Breite (wir verwenden in der Regel eine LM Auflösung von 12 und eine HM Auflösung zwischen 13 und 15). Verwenden Sie einen weiten Massenbereich der hohen Masse / geringe Gebühr Dissoziation Produkte zu erkennen. Es wird empfohlen, dass Sie die m / z-Bereich eingerichtet, um die maximale Höhe, und dann reduzieren sie auf die gewünschten Werte. Wir empfehlen des weiteren die Überlagerung der MS und MS / MS-Spektren, um die Isolation des gewählten Precursor-Ionen zu validieren. </li><li> Um MS / MS, distanzieren Vorläufer-Ionen durch die Erhöhung der Aufprallenergie (CE) und der Druck auf die Kollision Zelle. Erhöhen Sie entweder Trap-oder Transfer-CE allmählich in Schritten von 10-20V, und hebt sie die Kollision Gasdruck auf 0-5 ml / min (gemeinsame Werte). Überwachen von Änderungen in den Spektren, bis eine optimale Aktivierung Bedingungen erreicht sind. Hohe Aktivierungsenergie kann induzieren die Dissoziation von einem oder mehreren Untereinheiten von der intakten komplex, und klären die Interaktion Affinitäten der verschiedenen Untereinheiten. Wir verwenden in der Regel Argon als Stoßgas in der Trap-/ Transfer-Zellen, obwohl Vorteile der Verwendung einer schwereren Gas (z. B. Xe oder SF 6) berichtet worden, jedoch sind diese Gase wesentlich teurer 11 (Abb. 3). </li><li> Es wird empfohlen, mehr als ein Ladezustand für MS / MS-Analyse ausgewählt werden. Im Fall von überlappenden Komponenten, wird den Erwerb einer Reihe von Tandem-MS-Spektren in Lösung die Ladung Reihe der verschiedenen Bevölkerungsgruppen zu unterstützen. Darüber hinaus werden höhere Ladezustände leichter distanzieren, im Vergleich zu niedrigeren Ladungszustand 12. </li><li> Neben der Charakterisierung der intakten Komplex, wird vorgeschlagen, dass kleinere Subkomplexe in Lösung generiert werden, unter milden denaturierenden Bedingungen. Die MS-und MS / MS-Analysen von Subkomplexe bilden die Grundlage für die Definition der Untereinheit Architektur des Komplexes 13. Für partielle Unterbrechung der Untereinheit-Untereinheit Interaktionen, allmählich fügen organischen Lösungsmitteln (zB Methanol, Isopropanol oder Acetonitril) bis zu einer Konzentration von 50%, oder ändern Sie den pH-Wert der Lösung durch Zugabe von Ammoniak oder Ameisensäure (bis zu einer Konzentration von 4 %). </li><li> Zur Bestimmung der Massen der einzelnen Untereinheiten, dass der Komplex bilden, ist es wichtig, ein Spektrum unter denaturierenden Bedingungen zu erwerben. Dies kann durchgeführt werden Zip-Tip C 4 (Millipore) mit einer 25:75 Wasser / Acetonitril-Verhältnis, mit 1% Ameisensäure als Elutionsmittel. </li></ol> Teil 6: Datenverarbeitung und-analyse <ol><li> Die Daten werden analysiert offline, mit einer spektralen Analyse-Programme für MS-Spektren. Wir benutzen normalerweise die MassLynx Programm (Waters). </li><li> Für Spektren, die eine breite m / z-Bereich umfassen, empfehlen wir, dass unterschiedliche Regelungen zur Glättung und Schwerpunkt-Parameter für den hohen und niedrigen m / z Regionen angewendet werden, um den Unterschied in Peak-Auflösung dieser Regionen Rechnung zu tragen. </li><li> So identifizieren Sie kostenlos Serie und berechnen Ladungszustände und Massen &quot;zu finden Handbuch&quot; die Funktion des MassLynx angewendet werden können. In Fällen von komplexen Massenspektren mit überlappenden Komponenten, kann die manuelle Berechnung der Massen einfacher sein. </li><li> Zur Erleichterung dieser Aufgabe werden, könnten sich zusätzliche Software verwendet werden, zum Beispiel: MaxEnt für Peakentfaltung 14. SOMMS für Peak Fitting und Simulation 15 und SUMMIT für die Zuordnung der Zusammensetzung und Stöchiometrie von Protein Subkomplexe und Erzeugung Protein-Interaktion Netze 13,16,17 . </li></ol> Teil 7: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vorbereitung gold-beschichteten Nano-Elektrospray Kapillaren. A. Befestigen Sie zwei doppelseitigen Klebestreifen auf einer Petrischale, 2 cm voneinander entfernt. Zur Unterstützung der vorbereiteten Kapillaren, statt einem Glasstab (8 cm x 5 mm) in der Mitte eines der Pads. B. Kleben Sie das stumpfe Ende des vorbereiteten Kapillaren der Klebepad, und lehnen die Spitze auf dem Glasstab. C. Nach der Petrischale wird mit dem vorbereiteten Kapillaren, überziehen sie mit Gold gefüllt, bis eine dünne Schicht aus Gold gleichmäßig auf der äußeren Oberfläche der Kapillaren abgelagert. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Hochamt Kalibrierung mit Cäsium-Jodid-Ionen. Die großen und monisotopic Cluster von CsI haben es die Verbindung der Wahl für die Kalibrierung von Massenspektrometern für hohe Masse Analyse. Die Reihe der gleichen Abständen Gipfel über einen weiten Bereich erstrecken, von m / z 393 bis weit über 10.000. Sie sind Assigned zu einfach Salz-Cluster der allgemeinen Zusammensetzung (CsI) n Cs + berechnet. Zusätzliche Signale zwischen den großen Gipfeln werden durch Doppel-und Dreifach-geladenen Spezies der Serie entstanden sind; [(CsI) n Cs2] 2 + und [(CsI) n Cs3] 3 +, jeweils. Erhöhung des Drucks in der ersten Vakuum-Phase ist die Voraussetzung zur Erkennung der hohen Masse Cluster. Die Wirkung des Drucks auf die hohe Masse Gipfel wird in Panels A nachgewiesen. und B. mit Druck readbacks von 1,2 und 5,3 bzw.. C. Expansion des Massenspektrums bei B dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Nanoflow Elektrospray-Massenspektren einer pentameren Lektin. A. Die Massenspektrometrie eines Lektin-Variante komplexe (abgeleitet von lib1-B7 durch gerichtete Evolution 18) führt zu einem Ladezustand Verteilungen zwischen 3.000 und 5.000 m / z, jedoch aufgrund unzureichender Desolvatation der Ionen, sind die Spitzen breit. Vergleich von Panel A. und B. zeigen die Wirkung der Erhöhung der Bias-Spannung von 4V (A). Bis 15V (B.) Auf die Peakbreite. Dieser Anstieg der beschleunigenden Bedingungen wird das Strippen von Restwasser und Puffer-Komponenten, was zu einem hochaufgelösten Spektrum. Die gemessene Masse (60.240 ± 38 Da) entspricht einer pentameren komplex. C. die +15 Ladezustand damals für Tandem-MS-Analyse (grau schattiert in Panel B). D ausgewählt. Die Erhöhung der Stoßenergie verursacht die Freisetzung eines hoch geladenen Monomer, bei 1.664 m / z zentriert, und eine abgespeckte tetrameren Komplex, in dem Bereich von 5.000 - 8.000 m / z Alle Spektren wurden von einer Probe mit 20 uM Lösung in 0,5 M Ammoniumacetat erhalten.

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M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

Zum Erwerb hochwertiger Spektren Augenmerk sollte auf die Probenvorbereitung, die Konzentration der Probe und Puffer Austausch beinhalten gegeben werden. In verdünnten Proben ergeben ein Low-Signal, während hochkonzentrierte Proben kann ziemlich zähflüssig, und blockieren die Elektrospray Nadel. Darüber hinaus Lösung Additive wie Salze, Glycerin, Wasch-, Metall-Ionen und Reduktionsmittel (DTT oder β-Mercaptoethanol), neigen dazu, an der äußeren Oberfläche der Proteine ​​haften und verursachen Verbreiterung der Peaks. Deshalb, um gut aufgelöste Peaks zu erreichen, sollten diese Komponenten auf dem niedrigsten Konzentrationen möglich aufgenommen werden. Ein weiterer wichtiger Parameter ist die Position des nanoflow Kapillare, bezogen auf das Massenspektrometer Öffnung. Das Finden der &quot;sweet spot&quot; könnte eine Herausforderung sein für unerfahrene Benutzer, trotzdem sie beeinflusst maßgeblich die Qualität der Spektren. Es ist auch wichtig zu untersuchen, die nanoflow vor Beginn der Spraykapillare. Die Tröpfchengröße ist eine Funktion der Spitze Durchmesser, die ~ 1 &amp;mgr; werden soll. Kleine Tröpfchen für effizientere Ionisation führen und wäre daher von Vorteil sein. Es ist auch wichtig, um zu überprüfen, dass es keine Luftblasen in der Kapillare, die den Fluss versperren könnte, und dass die Gold-Beschichtung ist nicht aus der Kapillare während der Akquisition entkleidet und wenn ja, weiter schneiden Sie die Spitze. Beachten Sie, dass eine übermäßige Menge an Probe wird die Möglichkeit der Optimierung MS-Bedingungen wie die Kapillare Spannung, beschleunigenden Spannungen, Druck und Aufprallenergie zu erhöhen. Insgesamt haben sich die Verfahren in das Protokoll erklärt worden, um die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Architektur der zahlreichen Protein-Komplexe (siehe Bewertungen 2,3,4) zu bestimmen. Analyse großer MDa Komplexe wie das Ribosom 19 und hochgeordnete Viruskapside 20-22, in der Definition Substratbindung zu molekularen Maschinen 23-25, oder die Charakterisierung der Untereinheit Interaktion Netzwerke 26,17,16,17,27,28 dienen als aber ein paar Beispiele für den Mehrwert dieses Ansatzes.

Anforderungen an die Probe: <table border="1"><tr><td> Probe </td><td> Anforderung </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> 1-2 ul </td><td> Per Kapillare </td></tr><tr><td> Konzentration </td><td> 1-20 um </td><td> Per komplexen </td></tr><tr><td> Puffer </td><td> Aquanos flüchtigen Puffer wie Ammoniumacetat bei pH = 6 bis 8 </td><td> In der Regel 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Reinigungsmittel </td><td> Minimal </td><td> Cluster von Wasch-Moleküle produzieren breite und Hauptpeaks </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Minimal (bis zu 5%) </td><td> Haftet unspezifisch an Proteine ​​und damit sind breite Peaks beobachtet </td></tr><tr><td> Organische Lösungsmittel </td><td> Bis zu 50% </td><td> Might Proteine ​​denaturieren Komplexe </td></tr><tr><td> Acids </td><td> Bis zu 4% </td><td> Denaturieren Protein-Komplexe </td></tr><tr><td> Salze </td><td> Minimal </td><td> Salzaddukte um eine breite und offene Gipfel führen </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimal </td><td> 1-2 um vorhanden sein können </td></tr><tr><td> Chelatbildner </td><td> Minimal </td><td> Über 250 um umfangreiche Adduktbildung führen </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Lebende Zellen steuern und regeln ihre biologische Prozesse durch die koordinierte Aktion von einer großen Anzahl von Proteinen, die sich versammeln in ein Array von dynamischen, multi-Protein-Komplexe 1. Um ein mechanistische Verständnis der verschiedenen zellulären Prozessen, ist es wichtig, die Struktur eines solchen Protein-Komplexe zu bestimmen, und zeigen, wie ihre strukturelle Organisation ihre Funktion bestimmt. Viele Aspekte der Multi-Protein-Komplexe sind jedoch schwer zu charakterisieren, die aufgrund ihrer heterogenen Natur, asymmetrische Struktur und Dynamik. Daher sind neue Ansätze für die Erforschung der tertiären Protein Organisation erforderlich. Einer der aufstrebenden Strukturbiologie Werkzeuge zur Analyse von makromolekularen Komplexen ist die Massenspektrometrie (MS) 2-5. Diese Methode liefert Informationen über die komplexen Protein-Zusammensetzung, Untereinheit Stöchiometrie und strukturelle Topologie. Die Macht der MS ergibt sich aus seiner hohen Empfindlichkeit und, als Folge, geringe Probenvolumina nötig, die Untersuchung von Protein-Komplexen an endogenen Ebenen zum Ausdruck ermöglicht. Ein weiterer Vorteil ist die Geschwindigkeit der Analyse, die Überwachung von Reaktionen ermöglicht in Echtzeit. Darüber hinaus kann die Technik die gleichzeitige Messung der Eigenschaften der getrennten Populationen koexistierenden in einer Mischung. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Anwendung von Struktur-MS zur Analyse von großen Protein-Baugruppen. Das Verfahren beginnt mit der Herstellung von Gold-beschichteten Kapillaren für nanoflow Elektrospray-Ionisation (NESI). Es fährt dann mit Probenvorbereitung, betont die Puffer-Bedingungen, die kompatibel sein NESI auf der einen Seite sollte und damit zu Komplexen intakt auf der anderen Seite zu halten. Wir haben dann zu erklären, Schritt-für-Schritt, wie man die experimentellen Bedingungen für die hohe Masse Messungen zu optimieren und zu erwerben MS und Tandem-MS-Spektren. Schließlich, ein Diagramm wir die Datenverarbeitung und-analysen, die folgen. Statt zu versuchen, jeden Aspekt des Protein-Baugruppen zu charakterisieren, stellt dieses Protokoll grundlegende MS-Verfahren, wodurch die Leistung der MS und MS / MS-Experimente auf nichtkovalente Komplexe. Insgesamt ist es unser Ziel, den Forschern auf dem Gebiet der strukturellen MS unbekannt, mit der Kenntnis der wichtigsten experimentellen Werkzeuge bieten.

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Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.0K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science. Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

Serie: Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Atmosphärische Molecular Imaging von biologischen Geweben und Biofilme durch LAESI Massenspektrometrie

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie