Diese Forschung wurde zum Teil durch die Interne Research Program der National Cancer Institute an der National Institutes of Health, und NCI gewähren UA5CA152907.

1. Erhebung von konditionierten Medien für Angiogenic Mögliche Testen <ol><li> Wachsen primäre oder immortalisierte Zellen für angiogene oder anti-angiogene Potential in nativer oder niedrigen Serum-Medien getestet und sammeln die konditionierten Medien. <ol><li> Alternativ Verwendung konditionierten Medien unmittelbar oder aliquotiert und bei -80 ° C für mehrere Monate gelagert. Verwenden nonconditioned native oder niedrige Serum Medien als Negativkontrolle, und verwenden Sie nicht-konditionierten komplette Wachstumsmedien (10% FBS oder entsprechende Konzentration) als positive Kontrolle. Alternativ, um mögliche Stimulatoren der Angiogenese zu testen, zu ergänzen, Aktivkohle gereinigt Medium ohne Wachstumsfaktoren mit bekannten Konzentrationen bestimmter Proteine ​​von Interesse und zu vergleichen, um Wachstumsfaktor freien Medien allein. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Endothelzellen vor dem Test <ol><li> Zwei Tage vor dem Test, Durchgang 3B-11-Zellen in einen neuen T-75-Kolben. Passage Anzahl von Zellen ist wichtig,. Dieser Test funktioniert am besten, wenn die Zellen zwischen den zweiten und sechsten Passagen. Der Test wird nicht funktionieren gut, wenn Endothelzellen vor der zweiten oder nach dem zehnten Durchgang verwendet. </li><li> Wachsen Zellen für 24 h in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Ein Tag vor dem Test, Serum verhungern 3B-11-Zellen wie folgt: <ol><li> Absaugen Medien aus den 3B-11-Zellen. </li><li> Reduziert Serummedien DMEM, ergänzt mit 0,2% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Wachsen Zellen für weitere 24 Stunden. </li></ol></li></ol> 3. Vorbereitung der Reagenzien vor dem Test HINWEIS: BME-Konzentrationen sehr variabel abhängig von Menge sind. BME funktioniert nicht gut, wenn die Konzentration von weniger als 10 mg / ml, daher sollte der BME-Hersteller vor dem Kauf, um sicherzustellen, kontaktiert werdenErwerb einer ausreichend konzentriert Grundstück. <ol><li> Abtauen reduziert Wachstumsfaktor BME in den Kühlschrank stellen. BME erstarrt, wenn warm, so muss es vor der Verwendung kalt gehalten werden. BME kann unter Kühlung für einige Wochen gelagert werden oder aliquotiert und bei -80 ° C eingefroren. </li><li> Eine reduzierte Wachstumsfaktor BME über traditionelle BME bevorzugt. Das Fehlen von angiogenen Faktoren im BME wird es einfacher, den Effekt, der aus dem konditionierten Medium auf der Schlauchbildung haben Faktoren zu beobachten. </li><li> Tau-Medien getestet werden. </li></ol> 4. Herstellung von Endothelzellen Unmittelbar vor dem Assay <ol><li> Wasch 3B-11-Zellen in DPBS. <ol><li> Wenn Visualisierung mit Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie gewünscht, vor dem Waschen 3B-11-Zellen, fügen Calcein AM an die Endothelzellen in Medium mit einer Endkonzentration von 2 ug / ml. Platzieren Calcein markierter Zellen in der Dunkelheit bei 37 ° C und 5% CO 2 vor Beginn des Assays. Auflösen Lager CalceinUhr in DMSO und einmal Calcein in Medien Endkonzentration von DMSO sollte 0,1% nicht überschreiten. Nach 30-45 min Wasch Calcein AM aus den Zellen (Schritt 4.1 oben) und weiter mit dem Experiment folgt. </li></ol></li><li> Trypsinize Zellen durch Zugabe von 1 ml Trypsin-EDTA-T-75-Kolben. </li><li> Nach vollständiger Trypsinierung ist, neutralisieren Trypsin durch Resuspendieren Zellen auf ein Endvolumen von 10 ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Filterzellen durch 100 um Zellsieb um Klumpen zu entfernen. </li><li> Zählen von Zellen und Resuspension Zellen zu einer Endkonzentration von 7,5 x 10 6 Zellen / ml in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li></ol> 5. Schlauchbildung Assay <ol><li> Platz 24-Well-Platte und 1 ml-Tipps im Kühlschrank oder auf Eis für 20-30 min vor dem Laden der Platte, so dass die BME nicht prematurely verfestigen. </li><li> Pipette 250 ul reduziert Wachstumsfaktor BME in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Vermeiden Sie Blasen durch Drücken der Pipette nicht bis zur Endhaltestelle unter Verzicht. Darauf achten, dass genügend BME bleibt in der Mitte des Brunnens, wenn der Meniskus Formen; wenn die Matrix zu dünn ist, werden die Zellen, die nur eine Monoschicht bilden. </li><li> Inkubiere 24-Well-Platte bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min auf BME verfestigen. </li><li> Sobald BME eingestellt hat, mischen Sie ca. 300 ul konditionierten Medien mit 10 ul resuspendiert 3B-11-Zellen (ca. 75.000 Zellen). <ol><li> Stellen Sie die Lautstärke der konditionierten Medien und die Anzahl der Zellen überzogen, je nach endothelialen Zelltyp verwendet wird, und testen Sie die serielle Verdünnungen der konditionierten Medien, um die Aktivität zu demonstrieren. Vergleicht man Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, normalisieren konditionierten Medien Volumen auf die Zahl der Zellen, die verwendet wurden, um das Medium zu konditionieren. </li></ol></li><li> Rohre will beginnen, innerhalb von 2-4 Stunden zu bilden. Je nach Konzentration angiogenen Faktor in den konditionierten Medien können Spitzenröhrenbildung auftreten, zwischen 3 und 12 Stunden und der Zeitpunkt des Assays optimiert werden müssen. Bei der Arbeit mit primären Endothelzellen statt immortalisierten Zellen kann die anfängliche Schlauchbildung um mehrere Stunden verzögert werden. <ol><li> Röhren beginnen oft innerhalb von 18 Stunden und Endothelzellen verschlechtern wird Apoptose. </li></ol></li><li> Zum Zeitpunkt der Spitzenröhrenbildung zu vermeiden sorgfältig absaugen Medien aus dem Bohrloch Unterbrechung des Rohrnetzes auf der BME. <ol><li> Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DPBS, dann absaugen. <ol><li> Für die sofortige Visualisierung, 1 ml frischem DPBS in jede Vertiefung und Bild der Röhre Netzwerk mit einem inversen Mikroskop, um eine Digitalkamera, oder Fluoreszenz / konfokalen Mikroskop angebracht, wenn die Zellen mit Calcein AM wie in 4.1.1 gefärbt. </li><li> Zur Fixierung des Rohrnetzes für später Visualisierung, und fügen Sie 4% Para jedemgut abgesaugt und die Proben für 15 min bei Raumtemperatur. <ol><li> Para entfernen, waschen zweimal mit DPBS, dann frisch DPBS hinzufügen 1 ml in jede Vertiefung. </li><li> Mikroskopisch Bild vor der Fixierung so wenige Rohre können bei diesem Verfahren zu brechen. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. Quantifizierung von Rohrnetz <ol><li> Quantifizierung der Rohrnetz auf verschiedene Weise, je nach Präferenz des Untersuchers und mehrere Computerprogramme die Fähigkeit haben, die folgenden Parameter zu messen: Anzahl der Rohre; Anzahl der Schleifen / Maschen; Anzahl der Verzweigungsstellen / Knoten; Länge der Rohre. </li><li> Verwenden repräsentativen Computerprogramm wie Bild J mit der Angiogenese Analyzer Plugin 16 zur Quantifizierung von Rohrnetzen. </li></ol>

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	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. 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A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , 144-521 (1950).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+contribution:+Angiogenesis+Analyzer.">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Angiogenese ist sowohl in physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Studium der Mechanismen der Angiogenese beteiligt die Verwendung von Assays, die die Hauptschritte bei der Angiogenese rekapitulieren. Die Endothelzellen Rohr-Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tests. Es ist einfach zu Set-up, ist relativ kostengünstig, produziert Tubuli innerhalb von Stunden, und quantifizierbar ist. Ferner kann sie in 24 oder 96-Well-Platten durchgeführt werden, und können somit zur Hochdurchsatz-Sc...

Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Schiffen, ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Organwachstum, Embryonalentwicklung, Wundheilung und 1-3. Neu entwickelten Blutgefäße, durch Endothelzellen, Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu den Geweben ausgekleidet, die Förderung der Immunüberwachung von hämatopoetischen Zellen und entfernen Abfallprodukte 2,4. Angiogenese ist von zentraler Bedeutung während der embryonalen und fetalen Entwicklung. Allerdings ist dieses Verfahren ruhend im erwachsenen außer während Zeiten der Wundheilung, Knochenwachstums, Schwangerschaft oder während des Menstruationszyklus 1-3. In den letzten zwei Jahrzehnten, Schlüssel molekularen Mechanismen, die Angiogenese zu regulieren haben begonnen, zu entstehen. Die Angiogenese ist ein streng regulierter Veranstaltung, die von pro und anti-angiogenen Signale einschließlich Integrine, Chemokine, Angiopoietine, Sauerstofferfassungsmittel, Junction-Moleküle und endogenen Inhibitoren 5 ausgeglichen. Sobald proangiogenic Signale, wie basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptoren aktivieren die Endothelzellen Endothelzellen frei Proteasen an der Basalmembran abzubauen. Die Endothelzellen proliferieren und wandern dann bilden Sprossen mit einer Geschwindigkeit von einigen Millimetern pro Tag 6,7. Angiogenese ist mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich Krebs, Psoriasis, diabetische Retinopathie, Arthritis, Asthma, Autoimmunerkrankungen, Infektionskrankheiten und Atherosklerose 8-10 zugeordnet. Wegen der Bedeutung der Angiogenese bei verschiedenen Krankheiten, Analyse von Genen und Signalwege, die zu regulieren Dieses Verfahren ist für die Entwicklung besserer Therapeutika. Das Rohr-Assay ist eine schnelle und quantitative Verfahren zur Bestimmung von Genen oder Wege in der Angiogenese beteiligt. 1988 erstmals beschrieben,die Grundsätze dieses Tests zugrunde liegen, dass Endothelzellen die Fähigkeit sich zu teilen und zu migrieren rasch in Reaktion auf angiogenen Signale 11-13 behalten. Ferner sind Endothelzellen induziert, um zu differenzieren, und bilden röhrenförmige Strukturen, wenn sie auf einer Matrix von Basalmembran-Extrakt (BME) kultiviert. Diese Röhrchen enthalten ein Lumen von Endothelzellen zusammen durch junktionale Komplexe verknüpft umgeben. Schlauchbildung erfolgt schnell mit den meisten Röhren bilden in diesem Test innerhalb von 2-6 Stunden, je nach Menge und Art der angiogenen Stimuli. Mehrere Arten von Endothelzellen kann für diesen Assay sowohl primäre Zellen und immortalisierten Zelllinien 14,15 verwendet werden. Die Zelllinie für diesen Artikel war Maus 3B-11, aber die gleiche Methodik kann mit anderen Endothel-Zelllinien, wie SVEC4-10 (Maus) oder primären Endothelzellen wie HUVEC (menschliche) Zellen angewandt werden. Je nachdem, welcher Zelllinie verwendet wird, und ob der endothelialen cells umgewandelt oder nicht transformierten, wird Optimierung müssen durchgeführt, um den idealen Zeitpunkt für die richtige Schlauchbildung erforderlich zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:339px;">Item</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Manufacturer</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">Catalog #</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="114" rowspan="2" style="height:114px;width:339px;">Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">3524</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="190" rowspan="2" style="height:190px;width:339px;">BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">BD Biosciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">354230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="76" rowspan="2" style="height:76px;width:339px;">Gibco 0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="95" rowspan="2" style="height:95px;width:339px;">Gibco L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25030-081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco Pen Strep</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DMEM (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DPBS (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Atlas Biologicals</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">F-0500-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">C3100MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMSO</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">4-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis

Angiogenese ist ein wichtiger Prozess für normale Gewebeentwicklung und der Wundheilung, aber auch mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen verbunden sind. Über dieses Protokoll kann die Angiogenese in vitro in einem schnellen, messbaren Weise gemessen werden. Primäre oder immortalisierte Endothelzellen mit konditioniertem Medium vermischt und auf Basalmembranmatrix plattiert. Die Endothelzellen bilden Kapillare artigen Strukturen in Abhängigkeit von angiogenen Signale in konditioniertem Medium gefunden. Das Rohr Bildung erfolgt schnell mit Endothelzellen beginnen, sich innerhalb von 1 Stunde und Lumen-haltigen Tubuli beginnen, innerhalb von 2 h erscheinen auszurichten. Rohre können mit einem Phasenkontrastmikroskop sichtbar invertiert werden, oder die Zellen können mit Calcein AM vor dem Assay und Rohre, durch Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie sichtbar behandelt werden. Die Anzahl der Verzweigungsstellen / Knoten, Schlaufen / Maschen, oder die Anzahl oder Länge der Rohre gebildet wird, leicht als ein Maß der in vitr quantifiziert werdeno Angiogenese. Zusammenfassend kann dieser Assay verwendet werden, um Gene und Signalwege, die für die Förderung oder Hemmung von Angiogenese in einem schnelle, reproduzierbare und quantitative Weise beteiligt sind, zu identifizieren.

Maus 3B-11-Endothelzellen wurden auf verfestigtem reduzierte Wachstumsfaktor BME ausgesät - in diesem Assay das Produkt Matrigel wurde - und über die Zeit verfolgt. Wie in 1 gezeigt, sind in der Lage der Schlauchbildung zu induzieren über die Zeit angiogenen Faktoren entweder durch Maus-Keratinozyten oder Fibroblasten sezerniert. Endothelzellen migrieren und beginnen, kleine Äste in 1-2 h Beschichtung bilden. Maximaler Rohrbildung wurde durch 4-6 h mit zuvor aus Keratinozyten erhalten konditionierte...

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Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Das Rohr-Assay ist eine schnelle, quantifizierbare Verfahren zum Messen in vitro Angiogenese. Endothelzellen werden mit konditioniertem Medium kombiniert und Basalmembran-Extrakt ausgestrichen. Schlauchbildung erfolgt innerhalb von Stunden und neu gebildeten Tubuli leicht quantifizieren.

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

endothelial-cell-tube-formation-assay-for-vitro-study

Research

JoVE Journal

Biology

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

59.0K Aufrufe.  American University.  Das Rohr-Assay ist eine schnelle, quantifizierbare Verfahren zum Messen in vitro Angiogenese. Endothelzellen werden mit konditioniertem Medium kombiniert und Basalmembran-Extrakt ausgestrichen. Schlauchbildung erfolgt innerhalb von Stunden und neu gebildeten Tubuli leicht quantifizieren. 

Serie: Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Eine In-vitro-Modell für das Studium der Angiogenese (Interview)

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Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Ein Matrigel-Based Rohr Formation Assay zur vaskulären Aktivität von Tumorzellen Beurteilen

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.