Dieser In-vitro-Test zeigt angiogenes Keimen in einer hochdurchsatz- und skalierbaren Plattform. Dies könnte verwendet werden, um neue Ziele in der Angiogenese zu finden. Dieser Angiogenese-Assay kombiniert komplexe zelluläre Mikroumgebungen, die Gradienten und Perfusionen mit einer Plattform umfassen, die mit einem Hochdurchsatz-Screening kompatibel ist.
Angiogenese spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der Gesundheit als auch bei Krankheiten. Das Verständnis der Mechanismen, die während der Angiogenese auftreten, könnte uns helfen zu verstehen, wie Krebs wächst und wie Gewebe repariert werden. Diese Methode könnte Einblick in die Mechanismen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Geweberegeneration geben.
In beiden spielt die Angiogenese eine wichtige Rolle. Für die erstmalige Nutzung dieser mikrofluidischen Plattform müssen Sie sich des Gesetzes der Volumina und der Pipettenbeachten bewusst sein. Sie können die Schritte bestätigen, indem Sie unter ein Mikroskop schauen oder die Platte auf den Kopf kippen.
Einige Schritte sind schwierig, ein Gefühl für beim Lesen der Methode zu bekommen, zum Beispiel, wie klein die mikrofluidischen Kanäle sind oder wie man die Platte hält. Diese Verfahren demonstrieren Wendy Stam, eine Technikerin aus unserem Labor. Um zu beginnen, übertragen Sie die mikroflude 384-Well-Platte auf eine sterile laminare Durchflusshaube.
Entfernen Sie den Deckel und fügen Sie 50 Mikroliter Wasser oder Phosphat gepufferte Salzsäure in jede der 40 Beobachtungsbrunnen mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Dann fügen Sie 1,5 Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter Kollagen eine Lösung auf den Geleinlass jeder mikrofluidischen Einheit. Stellen Sie sicher, dass das Tröpfchen Gel in der Mitte jedes Brunnens platziert wird, damit das Gel in den Kanal gelangen kann.
Nachdem Sie fünf mikrofluidische Einheiten gefüllt haben, drehen Sie die Platte auf den Kopf, um die korrekte Füllung der Gelkanäle visuell zu überprüfen. Legen Sie die mikrofludetische Platte in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 10 Minuten, um Kollagen zu polymerisieren. Dann nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und übertragen Sie auf eine sterile laminare Strömungshaube.
Fügen Sie 50 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin-Codierungslösung in den Auslassbrunnen des oberen Perfusionskanals jeder mikrofluidischen Einheit. Drücken Sie die Pipettenspitze gegen die Seite des Brunnens, um den Brunnen richtig zu füllen, ohne Luftblasen einzufangen. Der Kanal füllt und die Flüssigkeitswannen am Auslass, ohne den Auslass gut zu füllen.
Legen Sie die Platte dann mindestens zwei Tage lang in den Inkubator. Jetzt tauen Sie die gefrorenen IPSC-ECs in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für weniger als eine Minute schnell auf. Dann übertragen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter Tube und fügen Sie langsam 10 Milliliter Basalmedium zu verdünnen.
Zeichnen Sie 10 Mikroliter der Lösung und zählen Sie die Zellen auf einem Zellzähler. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 mal g für fünf Minuten. Den Überstand ansaugen, ohne das Zellpellet zu stören, und im Basalmedium wieder aufsetzen, um eine Konzentration von zwei mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter zu ergeben.
Als nächstes übertragen Sie die mikrofluidische 384-Well-Platte aus dem Inkubator auf eine sterile laminare Durchflusshaube. Die Fibronectin-Codierungslösung aus dem Perfusionsauslass ansaugen und 25 Mikroliter Basalmedium in die Auslassbrunnen geben. Fügen Sie jedem oberen Perfusionseinlass ein Einlchen von einem Mikroliter-Tröpfchen zellfügen.
Das Tröpfchen flacht in wenigen Sekunden ab. Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Aussaat innerhalb eines kanalischen Kanals und zwischen den Kanälen homogen ist. Inkubieren Sie die mikrofluidische Brunnenplatte für ein bis 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Danach überprüfen Sie die Zellen, um zu bestätigen, dass sie eingehalten haben. Entfernen Sie das Basalmedium aus den oberen Perfusionsauslassbrunnen. Fügen Sie warmes Gefäßkulturmedium in den oberen Perfusionseinlass und Auslass ein.
Platzieren Sie die Platte auf einer Rockerplattform, die auf einem Sieben-Grad-Winkel und acht Minuten Schaukelintervall im Inkubator eingestellt ist. Stellen Sie sich am ersten Tag und zwei nach der Aussaat die Platte mit einem Brightfield-Mikroskop mit automatischer Stufe ab, um die Zelllebensfähigkeit zu bestätigen. Nach zwei Tagen hat sich gegen das Kollagengerüst ein konfluentes Monolayer gebildet.
Zunächst 4,5 Milliliter angiogenes Keimmedium zuzubereiten, indem 4,5 Milliliter Basalmedium mit 4,5 Mikroliter N. VEGF-Bestand, 4,5 Mikroliter PMA-Bestand und 2,25 Mikroliter S1P-Bestand ergänzt werden. Bereiten Sie 8,5 Milliliter Gefäßwachstumsmedium vor, indem Sie das Basalmedium mit 5,1 Mikroliter N. VEGF und 3,4 Mikroliter BFGF ergänzen. Beschlangmedium aus den Brunnen und 50 Mikroliter frischegefäßkulturmedium in die oberen Perfusionsein- und Auslassbrunnen sowie Gelein- und Auslassbrunnen geben.
Dann fügen Sie 50 Mikroliter angiogenic Sprossenmischung zu jedem der unteren Perfusionskanal Einlass und Auslassbrunnen. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator auf der Rockerplattform, um einen Gradienten angiogener Wachstumsfaktoren zu bilden. Einen Tag und zwei Tage nach Zugabe der angiogenen Wachstumsfaktoren verwenden Sie ein Brightfield-Mikroskop, um die Brunnen auf einer automatisierten Bühne abzubilden.
Um Anastomose und Sprossenstabilisierung zu untersuchen, fügen Sie einen Mikroliter 0,5 Milligramm pro Milliliter fluoreszierend als Albumin bezeichnet, um den oberen Perfusionseinlass zu untersuchen. Mischen Sie die Lösung dann mit einer 50-Mikroliter-Pipette. Übertragen Sie die Platte auf ein Fluoreszenzmikroskop mit automatisierter Bühne und Inkubator auf 37 Grad Celsius eingestellt.
Stellen Sie das Mikroskop auf das 10-fache Objektiv ein und korrigieren Sie die Belichtungseinstellungen. Erfassen Sie Zeitrafferbilder jede Minute für 10 Minuten. Entfernen Sie die Platte aus dem Mikroskop und übertragen Sie die Platte auf eine sterile laminare Durchflusshaube.
Entfernen Sie alle Medien aus den Brunnen und ersetzen Sie sowohl das Gefäßkulturmedium als auch das angiogene Keimmedium in den entsprechenden Brunnen. Legen Sie die mikrofluidische Platte wieder in den Inkubator, um das angiogene Keimen fortzusetzen. Wiederholen Sie am sechsten Tag die Bildgebung, um die Durchlässigkeit zu untersuchen.
Um die Zellkultur zu beheben, saugen Sie alle Kulturmedien aus den Brunnen. Fügen Sie 25 Mikroliter 4%PFA in PBS zu allen Perfusionsein- und Auslassbrunnen hinzu. Legen Sie dann eine Seite der mikrofluidischen Platte in einem leichten Winkel von fünf Grad auf den Deckel, um den Fluss zu induzieren.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach, aspirieren Sie die PFA aus den Brunnen. Waschen Sie alle Perfusionseinlässe und Auslässe zweimal mit 50 Mikroliter HBSS.
Dann die HBSS aus den Brunnen aspirieren. Paraformaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie, die mit Handschuhen behandelt und nur in einer Dunstabzugshaube geöffnet werden sollte. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter 0,2% nicht-ionisches Tensid zu allen Perfusionseinlässen und Auslässe hinzu, um sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten zu durchdringen und die mikrofluidische Platte in einem leichten Winkel von fünf Grad auf den Deckel zu legen.
Saugen Sie das nichtionische Tensid aus den Brunnen und waschen Sie die Perfusionskanäle zweimal, indem Sie 50 Mikroliter HBSS zu allen Perfusionsein- und Auslassbrunnen hinzufügen. Aspirieren Sie die HBSS aus den Brunnen. Bereiten Sie Hoechst 1,000 bis 2 000 für die Färbung der Kerne vor und bereiten Sie Phalloidin 100 bis 200 in HBSS für die Färbung von F-Actin vor.
Kombinieren Sie sechs Milliliter HBSS, 30 Mikroliter F-Actin und drei Mikroliter Hoechst in einem Falcon-Rohr. Dann fügen Sie 25 Mikroliter zu jedem Perfusionseinlass und Auslass gut. Legen Sie die Platte unter einen leichten Winkel und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten.
Zweimal mit 50 MikroliterHBSS in allen Perfusionseinlässen und Auslässe waschen. Dann direkt Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop mit automatisierter Bühne oder speichern Sie die Platte vor Licht bei vier Grad Celsius für den späteren Gebrauch geschützt. In diesem Protokoll wurden die Mikrogefäße kontinuierlich durchblutet und einem Gradienten angiogener Wachstumsfaktoren ausgesetzt.
Die Aussaat der IPSC-ECs nach dem passiven Pumpverfahren führte zu homogenen Sädichten. Der Zeitraffer eines Tröpfchens, das auf dem Einlass des mikrofluidischen Kanals platziert wird, zeigt das Tröpfchen direkt nach der Zugabe, das Tröpfchen auf dem Einlassstamm nach addition, bis der Tröpfchenmeniskus durch den Einlass angeheftet wurde, was zu einem Fluss in Richtung Auslass führte. Die Exposition gegenüber einem Gradienten angiogener Faktoren führte zu einer richtungsweisenden angiogenen Keimung der Mikrogefäße innerhalb des gemusterten Kollagen-Eingels.
Klare Spitzenzellbildung und Invasion in das Kollagen ein Gel war 24 Stunden nach Zugabe des angiogenen Gradienten sichtbar, während Stammzellen einschließlich Lumenbildung nach 48 Stunden sichtbar waren. Nach der Fixierung und Färbung wurden Form und Länge dieser Sprossen identifiziert. Jedoch, ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren, keine Invasion in das Kollagen ein Gel beobachtet wurde.
Bei der konfokalen Bildgebung wurde der Sprossendurchmesser bestimmt und die Lumenbildung bestätigt. Diese Methode könnte verwendet werden, um neue angiogene Inhibitoren zu überprüfen. Dies könnte helfen, neue Behandlungen gegen diabetische Retinopathie, rheumatoide Arthritis und Krebs zu finden.
Wir erforschen derzeit, wie wir Kokulturen schaffen können, einschließlich eines Modells der Blut-Hirn-Schranke und vaskularisierter Organoide.
