This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

1. Bestimmung der einen Näherungswert für die Dissoziationskonstante (dh innerhalb einer Größenordnung) <ol><li> Bereiten Sie die Mischung in Tabelle 1 aufgeführt. </li><li> Bereiten Bestände der Liganden von Interesse bei der höchsten Konzentration vorhanden, und dann bei sechs von zehn fache Verdünnungen davon. Wobei eine ungefähre Kd ist aus dem Stand Daten bekannt, zielen darauf ab, die mindestens zwei Konzentrationen oberhalb und unterhalb der K d haben. </li><li> 18 ul Aliquots der Mischung in acht Vertiefungen einer Platte qPCR. Add 2 ul Lösungsmittel in die erste Vertiefung. Add 2 ul jedes Mitglied des Ligand-Verdünnungsreihe (Schritt 1.2) in eine Vertiefung jedes der verbleibenden sieben Vertiefungen. </li><li> Legen Sie eine qPCR-Dichtung über der Platte. Um eine gute Abdichtung der Platte zu erreichen, legen Sie eine Hand Applikator (siehe Tabellen von spezifischen Reagenzien) in der Mitte der Platte. Glätten die Dichtung an einer Seite und dann auf der anderen Hälfte wiederholendie Platte. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für zwei Minuten, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Die Platte wird in einem StepOne qPCR Instrument. Wählen Sie das &quot;Melt Kurve&quot;-Option, die ROX-Filter, und wählen Sie die schnelle Änderungsgeschwindigkeit (dies einen 2 min Pause bei 25 ° C, gefolgt von einer Rampe bis 99 ° C über 40 min, und dann eine 2 Minuten Pause). Führen Sie einen thermischen Denaturierung. HINWEIS: Script-Dateien für die Durchführung einer Lauf sind online unter http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Zum Abschluss des Instruments auszuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Analysieren&quot; auf dem Bildschirm. Speichern Sie das Ergebnis Datei. </li><li> Öffnen Sie die Shift-Protein Thermal-Software. <ol><li> Erstellen Sie eine neue Studie; im Eigenschaften-Registerkarte, geben diesem einen Namen, und in der Registerkarte Bedingungen, Detail die Liganden. </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Experiment Dateien, und importieren Sie die Datei gespeicherten Ergebnisse (XXX.eds) und stellen den Inhalt der einzelnen Brunnen (fil-Vorlagees sind von den Autoren). </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Analyse, und drücken Sie die &quot;Analyze&quot;-Taste. HINWEIS: Diese werden die Ergebnisse analysieren. Es ist möglich, die Ergebnisse für die weitere Untersuchung mit Excel auf der Registerkarte Export exportieren. Die Ergebnisse werden in einem Register abgegrenzt Format exportiert. Es ist am besten, um die exportierte Datei in Excel öffnen, und sofort im Excel-Format speichern. </li></ol></li><li> Zu überprüfen, dass das Protein in der Gegenwart von Lösungsmittel allein ergibt ein ähnliches Ergebnis wie in 1A gezeigt. Weiter, überprüfen Sie die in den Ergebnissen in der &quot;Replikat&quot; Scheibe beobachtete Schmelztemperaturen. Stellen Sie sicher, dass dies zeigt einen deutlichen Anstieg der Schmelztemperatur mit zunehmender Ligandenkonzentration. HINWEIS: Idealerweise wird dies ein deutliches Maximum Schmelztemperatur (unter der Annahme, dass das Protein vollständig Liganden gebunden ist) und eine ungefähre Kd bereitzustellen, wo die Schmelztemperatur ist auf halbem Weg zwischen dem Liganden-freie Protein unddas Maximum. </li></ol> 2. Versuchsaufbau zur Bestimmung der Dissoziationskonstante <ol><li> Vorbereitung der Mischung in Tabelle 2 als Master Mix beschrieben. </li><li> Bereiten Aktien des Liganden mit fünfzehn verschiedenen Konzentrationen, die das Zehnfache im letzten Experiment verdünnt wird. Idealerweise sind Konzentrationen mindestens zwei Größenordnungen oberhalb und unterhalb der geschätzten K d, und in der Mitte die Konzentrationen auf der geschätzten K d. Konzentrieren sich auf sieben der Punkte innerhalb einer Größenordnung des geschätzten K D, vier weitere Punkte auf jeder Seite von diesem; wenn es eine Wahl, umfassen mehr Punkte auf Werte, die Sättigung sind. HINWEIS: Wenn notwendig, machbar, um die Versuchsbedingungen zu ändern, so dass die Liganden-Aktien zum doppelten experimentelle Konzentration, wo Liganden Löslichkeit ist die Begrenzung sind ist es. </li><li> Fügen Sie 120 ul des Master-mischen bis acht Vertiefungen einer U-förmigen Platte mit 96 Vertiefungen, um als Reservoir für bequeme Abgabe des Mastermixes handeln. Verwenden Sie einen 8-Kanal-Pipette bis 18 ul in eine Spalte einer PCR-Platte zu verzichten. Wiederholen Sie für weitere fünf Säulen, auf insgesamt 48 gefüllte Vertiefungen in einer 6 x 8 Muster auf der Platte geben. </li><li> Mit 20 ul der Liganden Aktien oder des Lösungsmittels in die Vertiefungen in einer U-förmigen Platte mit 96 Vertiefungen zu trennen. Mit einem 8-Kanal-Pipette absaugen 2 ul von acht verschiedenen Liganden Aktien (oder Lösungsmittel). Fügen Sie diese auf eine Spalte der PCR-Platte, die mit Master-Mix in Schritt 2.3 gefüllt war. Wiederholen Sie mit den gleichen acht Liganden / Lösungsmittelvorräte für zwei weitere Säulen. Saugen Sie 2 ul den verbleibenden acht Liganden oder Lösungsmittel Aktien, und fügen Sie diese zu einem vierten Spalte in der Platte. Wiederholen Sie dies für zwei weitere Säulen. Dies wird dreifachen Proben für alle 16 Liganden und Lösungsmittel Proben geben. </li><li> Legen Sie eine qPCR Dichtung über die Platte (siehe Schritt 1.4). </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g fürzwei min. </li><li> Die Platte wird in der qPCR Instrument. Führen Sie einen thermischen Denaturierung mit den in Schritt 1.6 angegebenen Parametern. </li><li> Zum Abschluss des Instruments auszuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Analysieren&quot; auf dem Bildschirm. Speichern Sie das Ergebnis Datei. </li><li> Öffnen Sie die Shift-Protein Thermal-Software. Erstellen Sie eine neue Studie; im Eigenschaften-Registerkarte, geben diesem einen Namen, und in der Registerkarte Bedingungen, Detail die Liganden. </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Experiment Dateien, und importieren Sie die Datei gespeicherten Ergebnisse (XXX.eds), und stellen Sie die Inhalte jeder gut. HINWEIS: Template-Dateien sind online unter http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Bewegen Sie die Registerkarte Analyse, und drücken Sie die &quot;Analyze&quot;-Taste. <ol><li> Wählen Sie die &quot;Replikate&quot; Registerkarte aus dem Menü auf der linken Seite des Bildschirms, um die Ergebnisse als dreifach zu zeigen. Bewerten Sie die Zuverlässigkeit der Daten auf der Grundlage, wie eng die dreifach sind. Should die dreifach zeigen schlechte Reproduzierbarkeit, untersuchen Sie die Rohdaten eng. </li><li> Analysieren der Daten unter Verwendung sowohl der Boltzmann-Derivative oder Verfahren, um die Schmelztemperatur zu bewerten. Wählen Sie die &quot;Ergebnisse reproduzieren&quot; Registerkarte, und in der &quot;Ergebnisse reproduzieren Handlung&quot;, drücken Sie die &quot;Plot von&quot; Taste zwischen &quot;Tm - Boltzmann&quot; und &quot;Tm - Derivative&quot;. Wählen Sie die Methode, die die höhere Reproduzierbarkeit für die Probe gibt. Exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren Untersuchung mit Excel über die Registerkarte Export. HINWEIS: Für die Proben, die mehrere Übergänge zeigen, ist es fast immer am besten, um die Derivate-Methode in mehreren Schmelze-Modus verwenden. Die Ergebnisse werden in einem Register abgegrenzt Format exportiert. Es ist am besten, um die exportierte Datei in Excel öffnen, und sofort im Excel-Format speichern. </li><li> Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal, darunter eine Wiederholung an einem anderen Tag, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Sollte die Datenanalyse (siehe Schritt 3 unten)zeigen, dass der Wert von K d unterscheidet sich deutlich von der ursprünglichen Schätzung, verändern die Ligandenkonzentrationen entsprechend (siehe Schritt 2.2), um eine gute Auswahl von Werten um K d zu gewährleisten. </li></ol> 3. Datenanalyse, um die Dissoziation bestimmen, unter thermischen Denaturierung Constant <ol><li> Erstellen Sie eine Tabelle in Excel der Liganden-Konzentrationen und die Schmelztemperatur. </li><li> Öffnen Sie die GraphPad Prism Software und ein XY-Tabelle zu erstellen. Geben Sie die Daten mit Hilfe der X-Spalte für den Liganden-Konzentrationen und der Y-Spalte für die Schmelztemperatur Ergebnisse. Hinweis: Ein Beispiel ist gezeigt 1B. Ein Skript mit den Gleichungen vorgeladen, und alternative Anweisungen zur Verwendung der SPSS Statistik-Paket, sind online unter http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> In der Registerkarte Analyse, wählen Sie die Option Analyse Parameter zu änderns (Strg + T). Um das richtige Modell zu gelangen, wählen Sie &quot;Neu&quot; und &quot;Neue Gleichung&quot;. Legen Sie die Gleichung in Tabelle 3 als &quot;Single-Site-Ligandenbindung&quot; beschrieben. HINWEIS: Ein Beispiel dieser Schritte wird in 1C gezeigt. Bei Verwendung der Skript mit Gleichungen vorgeladen, kann der entsprechende Gleichung gerichtet, die aus der Liste und nicht eingegeben werden. Ableitung dieser Gleichung ist in einem Anhang. </li><li> Wählen Sie die &quot;Regeln für die Anfangswerte&quot; ein, und geben Sie Regeln für Anfangswerte wie in Tabelle 3 aufgeführt. </li><li> Schränken den Parameter P, als &quot;Konstante gleich&quot; und geben die Endkonzentration des Proteins (in der gleichen Einheit wie der Ligand in angegeben). </li><li> Wählen Sie OK, um die Analyse durchzuführen. HINWEIS: Ein Beispiel dieser Schritte wird in 1D gezeigt. Die Grafik-Software erzeugt eine Figur, die die Daten und die Passform zum Modell. Beispiele für tiese Analysen werden in den repräsentativen Daten angezeigt. </li></ol> 4. Montage Daten an Kooperationsmodelle Um Daten in einem kooperativen Modell passen, wählen Sie entweder zwischen einer einfachen Genossenschaftsmodell oder ein Modell, bei dem zwei separate Dissoziationskonstanten definiert sind. Der erste Ansatz ist im Falle der negativen Kooperativität bevorzugt, oder als erste Untersuchung. Aber im Prinzip ist es besser, in Fällen positiver Kooperativität zu modellieren zwei verschiedenen Dissoziationskonstanten 18. In diesem Fall kann die Modellierung gehen davon aus entweder sequenzielle Bindung von Liganden, oder unabhängige Bindung von Liganden. <ol><li> Führen Sie die gleichen Schritte wie in Anfangs Protokoll 3. jedoch in Schritt 3.3, legen Sie eine der Gleichungen in Tabelle 3 als &quot;Simple Kooperationsmodell&quot; aufgeführt, &quot;Sequential Bindung von zwei Liganden&quot; oder &quot;Independent Bindung von zwei Liganden&quot; 18. </li><li> Wählen Sie die entsprechenden Regeln für die Anfangswertewobei jede dieser Gleichungen in Tabelle 3 verbunden. </li><li> Prüft die Übereinstimmung des Modells mit den Daten. Sollten die Daten passen schlecht, sollten Sie ein anderes Modell. Hinweis: Es ist auch wichtig, sorgfältig zu prüfen, das die Anpassung der Schmelztemperatur auf die Daten durch die Protein Thermal Shift-Software (Schritt 2.9): Manchmal ist es notwendig, die Parameter hier ändern, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Eine weitere Überlegung ist, ob der Bereich von Datenpunkten ist ideal, und ob es irgendwelche anomalen Punkte: entweder eine begrenzte Anzahl von Daten an beiden Seiten der K d oder eine einzige anormale Stelle (insbesondere bei den höchsten Konzentrationen Ligand), erheblich beeinträchtigen kann die Ergebnisse. </li><li> Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal (siehe Schritt 2.12), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. </li></ol> 5. Fitting Daten an Kurven, die Binary Verschiebungen in der Schmelztemperatur Gelegentlich anstelle einer abgestuften Reaktion auf Liganden, Proteine ​​wurdenbeobachtet, um eine binäre Antwort, wo gebunden Probe wird deutlich von ungebundenen Probe getrennt erlassen. Ein Beispiel ist in der repräsentativen Ergebnisse (Figur 4) vorgesehen. In diesem Fall werden Anpassung der Schmelztemperaturen keine gute Passform für K d. <ol><li> Exportieren Sie die Ausgabe der Rohdaten aus der Protein Thermal Shift-Software. Für jeden Temperaturpunkt, die Berechnung der mittleren Fluoreszenz für die Nullliganden und höchsten Ligandenkonzentrationen. Tabellarisch die Ergebnisse von jedem Datenpunkt neben diesen. HINWEIS: Die hier erstellten Fehler weniger als der Fehler in den Einbauschmelztemperaturen ist. </li><li> Öffnen Sie die SPSS Statistik-Paket. Kopieren der Temperaturen, die beiden mittleren Datenmengen, und die Daten für jedes Experiment zu einem Datenfenster in SPSS. In der Registerkarte Variable, stellen Sie die mittlere Datenmenge ohne Liganden als &quot;gering&quot;, und die mittlere Datenmenge für die höchste Liganden-Konzentration als &quot;hoch&quot;. </li><li> Laden Sie die Syntax-Datei zur Verfügungonline unter: http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Wählen Sie &quot;Ausführen → Ausführen all&quot;. </li><li> Kopieren Sie den Anteil gebunden Ergebnisse in eine neue Excel-Arbeitsmappe mit den entsprechenden Liganden-Konzentrationen. </li><li> Öffnen Sie die Graphpad Software und ein XY-Tabelle zu erstellen. Geben Sie die Daten mit Hilfe der X-Spalte für den Liganden-Konzentrationen und der Y-Spalte für die Schmelztemperatur Ergebnisse. In der Registerkarte Analyse, wählen Sie &quot;Änderungsanalyse Parameter&quot;. Um das richtige Modell zu gelangen, wählen Sie &quot;Neu&quot; und &quot;Neue Gleichung&quot;. Geben Sie die Gleichung in Tabelle 3 angegeben, als &quot;Analyse von binären Verschiebungen der Schmelztemperatur&quot; aufgeführt. </li><li> Wählen Sie die &quot;Regeln für die Anfangswerte&quot; ein, und geben Sie Regeln für die in Tabelle 3 aufgeführt Anfangswerte. Beschränken Sie den Parameter P, als &quot;Konstante gleich&quot; und geben Sie die endgültige Konzentration des Proteins (in den gleichen Einheiten wie die ligand in) angegeben. Anmerkung: Beispiele für die Ausführung dieser Boxen für das Protokoll in Abschnitt 3 sind in Abbildung 1C, D gezeigt. </li><li> Wenn es eine gute Passform, die Ergebnisse können durch Extrapolation zu dem erwarteten Ergebnis bei unendlicher Liganden-Konzentration verbessert werden. Aus dem Modell des Anteils an jedem Liganden-Konzentration gebunden, untersuchen Sie den Wert für den höchsten Wert der Ligandenkonzentration. Wenn dies 0,99 oder größer ist, ist die weitere Analyse unwahrscheinlich, Ergebnisse zu verbessern. </li><li> Wenn der Anteil weniger als 0,99 ist, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um die Auswirkungen des ungebundenen Proteins in der höchsten Konzentration Ligand Probe zu korrigieren. In Schritt 5.2 zu schreiben, den Anteil des Liganden an der höchsten Stelle der Ligandenkonzentration (aus Stufe 5.7) in die Zelle gebunden R2 (eine andere Zelle verwendet werden kann, und R2 ersetzt entsprechend der Gleichung in Tabelle 3). Erstellen Sie eine zusätzliche Spalte nach dem Mittelwert der höchsten Ligandenkonzentration Ergebnisse. In den TannenT-Zelle, kopieren Sie die Gleichung in Tabelle 3 aufgeführt als &quot;Hochgerechnet auf Liganden-Konzentration unendlich&quot;. Kopieren Sie diese Formel, um die restlichen Zellen in dieser Spalte. Anmerkung: Diese Berechnung entfernt den Effekt des ungebundenen Proteins in der höchsten Ligandenkonzentration. Der Unterschied zwischen dem Liganden von freiem Protein und dem höchsten Ligandenkonzentration wird durch den Kehrwert des Anteils bei der höchsten Konzentration Ligand gebunden ist, um die erwartete Differenz zwischen vollständig gebundenen und ungebundenen Proteinzustände bei jeder Temperatur bereitzustellen Punkt multipliziert. Diese Differenz addiert oder von ungebundenen Zustand subtrahiert, um die erwartete Fluoreszenz vollständig Liganden gebundenes Protein zu geben. </li><li> Ersetzen Sie die Spalte für maximale Ligandenkonzentration in der SPSS Datenblatt mit dieser neuen Spalte, und wiederholen Sie den Datenanpassung. Hinweis: Die Schritte 5,7-5,9 müssen möglicherweise wiederholt werden, wenn das Modell schlägt vor, eine weitere deutliche Veränderung des Anteils bei den maximalen Liganden gebunden concentrati(falls dies der Fall ist, wäre es wahrscheinlich ideal, um das Experiment mit einem anderem höhere Liganden-Konzentration Punkt zu wiederholen). </li><li> In Fällen, in denen das Protein eine binäre Verschiebung und zeigt kooperatives Verhalten schlug die Gleichung in Schritt 5.5 ist mit den aus Schritt 4.1 substituiert sein. Die &quot;Top&quot; und &quot;Bottom&quot;-Parameter sollte von 1 und 0 bzw. ersetzt werden. </li><li> Wiederholen Sie das Experiment mindestens zweimal (siehe Schritt 2.12), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have nothing to disclose.

Differential Scanning fluorimetrisch hat seine Macht als robuste und vielseitige Methode zur Charakterisierung von Proteinen und Identifizierung potenzieller Proteinliganden gezeigt. Die gut dokumentierten Erfolge bei der Beschleunigung Proteinstabilisierung, Arzneimittelforschung (vor allem in weniger gut finanzierten Laboratorien) und Kristallisation 10,23-25 ​​haben sie eine attraktive Methode für die anfängliche Screening von Verbindungen hergestellt. Verbindungen, Proteine ​​hinzugefügt zeigen eine klare Dosis-abhängigen Anstieg der scheinbaren Schmelztemperatur 7,9. Jedoch gab es einige Versuche, um die Ergebnisse aus diesen Experimenten verwendet, um scheinbare Bindungskonstanten in der Rangfolge von Verbindungen auf ihre Affinität zu helfen zu bestimmen. Hier stellen wir ein Verfahren zum systematischen Bestimmen einer scheinbaren Dissoziationskonstante von Proteinen in Gegenwart eines Liganden. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass DSF schnell und robust stellen Schätzungen der Dissoziationskonstante fürein Protein-Ligand-Kombination. Die beobachteten Daten können mit handelsüblichen Werkzeugen manipuliert werden, um eine schnelle Bestimmung der K d zu schaffen, ohne dass Annahmen über den wahrscheinlichen Wert der Parameter vorzunehmen. Das Verfahren hat einen wesentlichen Vorteil gegenüber einer vergleichbaren Verfahren, sparsam sowohl Protein und Zeit erforderlich. Das hier beschriebene Experiment wird 0,13 mg Protein verbrauchen pro Versuch (etwa 0,4 mg für Experimente in dreifacher Ausfertigung wiederholt). Dieser Vergleich mit isothermer Titrationskalorimetrie (ITC), in einem einzigen Experiment mit durchschnittlich 40 kDa-Protein eine ähnliche Menge zu verbrauchen. Der vollständige Satz von Experimenten für dieses Protokoll erforderlich wäre, etwa 4 Stunden, einschließlich der Herstellung verbraucht, für eine Reihe von Experimenten. Auch dies ist wahrscheinlich sehr viel schneller als Verfahren, wie ITC oder Oberflächen-Plasmon-Resonanz, die während leistungsfähige erfordern oft erhebliche Optimierung besten Daten zu erzielen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nach wie vor ein Bedarf an sorgfältig die Rohdaten, die Anpassung der Daten an die Schmelztemperatur zu bestimmen, und die Passform des Schmelztemperaturdaten an die Dissoziationskonstante zu bestimmen. Ein erstes Problem ist die Form der in dem Protein Schmelzen hergestellt Rohdaten. In einigen Fällen kann die Form nicht auf die in 1A beobachtet nähern. Häufige Probleme sind geringe Temperaturschwankungen auf die Ligandenbindung, hohe Hintergrundfluoreszenz, und ungewöhnliche mehrere Übergänge in der Temperatur. Niedertemperatur-Verschiebungen auf der Bindung von Liganden eine Reihe gesehen. Für dieses Verfahren ist der kritischste Parameter der Fehler in der T m-Messung, verglichen mit der Temperaturverschiebung. Die Daten können in der Regel relativ gut ausgestattet, wenn die Standardabweichung von Dreifachmessungen nicht 10% der Schmelztemperatur Verschiebung zwischen ungebundenem und gebundenem Protein vollständig nicht übersteigt. Unsere Erfahrung ist, dass, wenn diese Temperaturratur Verschiebungen sind nur 2 ° C, kann dies ausreichend für die Montage der Daten, wenn die einzelnen Datenpunkte sind sehr genau. Ein zweites Thema ist ungewöhnlich geformte Kurven. Diese unterscheiden sich oft von freiem Protein und Ligand gebundenen Formen, wie die Ligandenbindungsarten beeinflusst Entfaltung des Proteins. In diesen Fällen muss der Benutzer prüfen, ob die Daten mit angemessenen Berücksichtigung der Modelle verwendet werden, um für die Bestimmung der Schmelztemperatur und der Dissoziationskonstante eingesetzt werden. Ein weiteres häufiges Problem ist, dass die Zugabe von Cofaktor an das Protein (zB MgCl 2 in unserem Beispiel mit Hexokinase) erforderlich, um verlässliche Daten zu erhalten. Unsere Erfahrung hat in der Phase der Ausgangswerte unter wesentlich ist für den Erhalt der besten Ergebnisse waren, daß eine sorgfältige Abwägung aller Faktoren wahrscheinlich in dem Experiment. Darüber hinaus können alternative Behandlungen theoretischen Eigenschaften dieser Daten 15,17 offenbaren. Schließlich ist es nicht ungewöhnlich, dass einige Proteine, contain nativ exponierten hydrophoben Regionen zu hohen Hintergrundfluoreszenz zeigen. Es gibt eine Anzahl von Lösungen für diese Probleme, die an anderer Stelle 6,9 bewertet wurden. Insbesondere kann der Benutzer prüfen, ob ein an die Boltzmann-oder abgeleitete Modelle (beispielsweise 4), und im Fall der Verwendung von Derivaten, ob mehrere Schmelzen modelliert werden verwendet. Die beiden Methoden der Modellierung des thermischen Entfaltungs unterscheiden, dass die Boltzmann-Methode passt die experimentellen Daten an die Boltzmann-Gleichung, unter der Annahme einer regelmäßigen S-Form auf die Entfaltungskurve. Im Gegensatz dazu nimmt die Ableitung Verfahren der ersten Ableitung der experimentellen Daten an jedem Punkt (unten in Figur 1A), und hält die Schmelztemperatur der Punkt der höchsten ersten Ableitung sein. Das Derivat im allgemeinen Verfahren liefert eine höhere Schmelztemperatur um ca. 2 - 3 ° C beträgt. Die meisten Proteine ​​wird eine konsequentere RückErgebnis (dh niedriger ist der Standardfehler der Schmelztemperatur für Dreifachversuche) für eine der beiden Methoden. Dies ist normalerweise eng mit der präzisen Form des Proteins Entfaltungskurve bezogen, und es ist erforderlich, empirisch zu bestimmen, die beste Methode in jedem Fall. Wobei die Ableitung Modell verwendet wird, ist es auch wichtig, mehrere Schmelz Ereignisse zu berücksichtigen. Einige Daten zeigen deutlich Beweise für mehrere Übergänge, und in diesen Fällen sind die Ergebnisse wahrscheinlich einfacher zu interpretieren, wenn diese mehrere Schmelz Ereignissen modelliert. Im Rahmen dieses Protokolls ist es oft der Fall, dass die Zugabe des Liganden kann zu einem Protein von mit mehreren Schmelzübergänge zu einem einzigen Übergang ändern (zB durch Stabilisierung der meisten thermisch instabil Domäne) oder umgekehrt. Wir würden uns daher dafür ein, dass die Rohdaten zusammen vor der Prüfung, welcher Ansatz am besten zu nutzen sein wird, untersucht. Nach der modelling der einzelnen Schmelztemperaturen können weitere Probleme bei der Anpassung dieser an die in dem Protokollabschnitt dargestellt Modelle ergeben. Es ist zwingend notwendig, sorgfältig zu prüfen, um die Passform der Dissoziationskonstante Gleichung einer logarithmischen Skala, wie diese Analyse oft betont Diskrepanzen zwischen den beobachteten Daten und dem Modell (e .B., Abbildung 3). Während die erhaltenen Ergebnisse sind in der Regel robust, Pflege in der Interpretation bietet die Möglichkeit, bessere Ergebnisse zu extrahieren, und die meisten Sinn, aus den Daten. Ein besonderes Problem durch diese Daten erhoben ist die Interpretation, die auf Proteine, die Kooperativität zeigen oder mehrere Bindungsereignisse platziert werden soll, in DSF. Wir haben bis heute nur beobachtet, dieses Phänomen in Proteinen, die erwartet, mehrere spezifische Bindungsereignissen (zB WcbM, ein Protein, dessen beste Homolog ist ein Multimer 26 und die als Multimer von Grßenausschlußchromatographie wirkt [Daten nicht sindgezeigt]). Es ist überhaupt nicht klar, dass die in DSF Denaturierung beobachteten negativen Kooperativität zeigt an, dass das Enzym wird letztlich zeigen negativer Kooperativität: eher, kann dies ein Hinweis auf komplexe Bindung, die mehr gründlich mit einem breiteren Spektrum von Methoden erforscht werden müssen. Dies läßt darauf schließen, uns jedoch, dass umfangreichere Studien solcher Proteine ​​wahrscheinlich, um interessante Effekte zu identifizieren. Die für die Dissoziationskonstante dieser Methode bestimmten Werte sind in der Regel von der gleichen Größenordnung wie diejenigen, die durch andere Verfahren, wie beispielsweise isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonresonanz ist. Jedoch sind die Absolutwerte beobachtet häufig höher als unter Verwendung dieser Verfahren beobachtet. Dies ist zumindest teilweise eine Folge der Tatsache, dass die Dissoziationskonstante wird bei der Schmelztemperatur des Proteins mit Liganden beobachtet. Diese K d ist im allgemeinen höher als die bei physiologischen Temperaturen. Die dissociation konstant bezogen auf die Temperatur der Reaktion, die durch die Gleichungen: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (Wobei θ c ist die Standard-Referenzkonzentration, Δ r G der Gibbs-Energie Veränderung der Reaktion ist, R die molare Gaskonstante ist, Δ H der Enthalpieänderung in dem Reaktions und Δ S die Entropie Änderung der Reaktions .) Reaktionen mit Dissoziationskonstanten im messbaren Bereich dieses Verfahren im allgemeinen einen negativen Δ r G, so dass die Wirkung einer Erhöhung der Temperatur auf die Gleichung [1] wird die Dissoziationskonstante zu erhöhen. Sowohl die Δ H und Δ S Begriffe, die Gibbs-Energie darstellen (Gleichung [2]) sind Temperature abhängigen 27, und die Wirkung auf die Dissoziationskonstante wird von der Größe und dem Vorzeichen dieser Temperaturabhängigkeiten ab und wird notwendigerweise Interaktion abhängig ist. Folglich ist es nicht unerwartet, daß die nach diesem Verfahren ermittelte Dissoziationskonstanten sind manchmal größer als die Methoden, die bei Raumtemperatur betrieben werden bestimmt. Temperaturabhängigkeit ist natürlich auch eine Einschränkung der vielen anderen Verfahren, die dazu neigen, die Dissoziationskonstante bei Temperaturen unterhalb der physiologischen Temperatur bereitzustellen. Weitere Einschränkung des DSF-Methode ist, daß es ein markiertes Verfahren, anders als ITC. Die Fluoreszenzmarkierung verwendet (SYPRO orange) ist hydrophob, und so in einigen Fällen mit der Bindung von Liganden an Proteine ​​hydrophobe konkurrieren können. Folglich ist es wahrscheinlich, dass in einigen Fällen die Dissoziationskonstante erhalten werden künstlich durch die Konkurrenz mit der Bezeichnung angehoben werden. Jedoch für den Vergleich von verschiedenen Liganden (die primäre Verwendung vonDSF), sind die Unterschiede kaum signifikant genug, um die Rangfolge von Verbindungen, die durch Affinität beeinträchtigt zu sein. Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist die Nachweisgrenze, die erreicht werden kann. Im Prinzip sollte es nicht möglich sein, einen Wert für K d, die kleiner als 50% der Proteinkonzentration und sogar Werte in diesem Bereich wahrscheinlich von zweifelhafter Genauigkeit ist es genau zu messen. Während die Nachweisgrenze in diesem Ende des Bereichs kann ein wenig durch die Reduzierung der Konzentrationen von Protein und Farbstoff verlängert werden, wird die Empfindlichkeit des Instruments weitere Verringerung der Proteinkonzentration zu verhindern. In ähnlicher Weise wird das obere Ende der Empfindlichkeit durch die Löslichkeit des Liganden bestimmt werden. Eine mathematisch robuste Schätzung für K d zu erhalten, ist es sehr wichtig, um Daten mit 90% der in den Liganden-gebundenen Form vorliegt Protein, das Ligandenkonzentrationen erfordert als ca.-Angaben zu erhaltenly zehnmal K d (Annahme, dass keine Kooperativität). Die Nachweisgrenze wird daher notwendigerweise ein Zehntel der Löslichkeit des Liganden in der betreffenden Puffer sein. Dies bedeutet, daß die Nachweisgrenze der Methode liegt typischerweise im Bereich zwischen 1 um und zwischen 1 und 100 mm, abhängig von dem Protein und dem Liganden. Zusammenfassend ist ein Differential-Scanning-Fluorimetrie vielseitige Technik für eine breite Palette von Proteinen. Verwendung der hier vorgestellten Verfahren ist es möglich, schnell und kostengünstig bestimmt die Affinität des Proteins für die verschiedenen Liganden. Dies hat ein großes Potenzial für die Anwendung in der Proteinreinigung und Stabilisierung, die Aufklärung der Funktion oder Spezifität von Enzymen aus Metagenomen, und in der Wirkstoffforschung, vor allem in kleinen Labors.

Alle Proteine ​​binden, mit unterschiedlichen Affinitäten, um eine breite Palette von anderen Molekülen aus einfachen Ionen zu anderen großen Makromolekülen. In vielen Fällen, Proteine ​​zu binden, um kleine Molekül Partner als Teil ihrer normalen Funktion (beispielsweise eine Kinase-Bindung an ATP). Andere Wechselwirkungen kann unabhängig funktionieren können, sind jedoch experimentell nützlich als Werkzeuge (beispielsweise kleine Moleküle, Proteine ​​zu stabilisieren, um die Kristallisation Erfolg zu verbessern oder zu unterstützen bei der Aufrechterhaltung der Proteine ​​in Lösung); während kleine Moleküle, die an aktiven Stellen und allosterischen Zentren von Proteinen binden kann, als Inhibitoren wirken, und so modulieren die Aktivität von Enzymen. Es gibt eine Vielzahl von Techniken, die verwendet werden kann, um die Affinität der Proteine ​​für die Partner-Moleküle zu bestimmen. Isothermen Titrationskalorimetrie 1 wird allgemein als &quot;Goldstandard&quot; angesehen, da es reich Informationen über Reaktionen ist Etikett kostenlos, und hat für einen begrenzten Möglichkeitenrtifacts des Experiments. Trotz der jüngsten Verbesserungen in der Empfindlichkeit der Instrumentierung und Automatisierung der Versuchsaufbau ist es jedoch immer noch in Bezug auf die Proteinbedarf relativ teuer, hat im besten Fall einen niedrigen bis mittleren Durchsatz und ist am besten geeignet, um Interaktionen mit mittelschwerer bis hohe Affinitäten (10 nM bis 100 uM K d) 2. Andere Label freie Verfahren wie Oberflächenplasmonenresonanz-oder Doppelschicht-Interferometrie 3 bieten höhere Durch und haben die Empfindlichkeit erreicht werden, um kleinere Moleküle so niedrig wie 100 Da zu erkennen. Allerdings sind hohe Durchsatz Instrumente für diese Methoden vergleichsweise teuer sind, werden nur gerechtfertigt, wenn es eine ständige Durch relevanter Projekte, und so dürften unzugänglich vielen akademischen Laboratorien zu sein. Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF oder thermofluor) wurde erstmals 2001 4 als ein Verfahren zur Wirkstoffsuche beschrieben. In diesem method werden die Proteine ​​mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert (zunächst Naphthalin-Sulfonsäure-Farbstoffe verwendet wurden), die ihre Fluoreszenz bei der Bindung an den hydrophoben Bereichen der Proteine ​​verändert. Das Protein-Farbstoff-Probe wird dann erwärmt, und die Fluoreszenz überwacht die Wärme ansteigt. Die Entfaltung des Proteins, und die Belichtung des hydrophoben Teile des Proteins, verursacht eine charakteristische Muster in der Fluoreszenz als eine Funktion der Temperatur (Abbildung 1a). Das Experiment kann in kleinen Mengen in kommerziellen quantitativen PCR-Gerät durchgeführt werden, so dass in einem einzigen Experiment kann eine große Anzahl von Proben gleichzeitig getestet werden (gewöhnlich 48, 96 oder 384 Proben, je nach Gerätetyp). Experimente können in der Regel in der Nähe von einer Stunde durchgeführt werden, wodurch die Möglichkeit einer Hochdurchsatzanalyse der Proben 5. Weitere Verbesserungen der Methodik haben die Annahme von Farbstoffen mit besseren spektralen Eigenschaften 6,7 gesehen </sup&gt;, generische Instrumente zur Datenanalyse, und schlug vor, Protokolle für die ersten Screening 8,9. Die Bandbreite der Anwendungen des Verfahrens auf die Einrichtung optimale Bedingungen für die Herstellung und Lagerung von Proteinen 10 und auf die Identifizierung von potentiellen Bindungspartnern, um die Kristallisation 11 Beihilfen erweitert worden, mit einem besonderen Fokus. Die relativ hohe Durchsatz der Methode, mit relativ geringen Kosten in Protein (~ 2 g pro Reaktion), und die Anwendbarkeit zur Untersuchung schwach bindende Moleküle hat DSF einen wertvollen Werkzeug für Fragment basiertes Wirkstoffdesign, vor allem im akademischen Kontext 12-14. Trotz der breiten Anwendung des DSF zum Studium von Protein-Ligand-Wechselwirkungen haben nur wenige Studien Bestimmung von Dissoziationskonstanten aus diesen Studien beschrieben. Allerdings sind diese tendenziell detaillierten Gleichungen zur Beschreibung der Entfaltung des Proteins, mit vielen Parametern, die zu wenige Daten oder in einigen Fällen E montiert werden muß produzierenstimated 7,15-17. Diese Methoden sind von besonderer Bedeutung in schwierigen Fällen, wie dicht verbindlich Verbindungen oder Proteine, die ungewöhnliche Übergängen. Jedoch für viele Labors sind diese detaillierte Analysen zu umständlich für den Routineeinsatz. Wir haben daher alternative Behandlungen schlagen für verschiedene Szenarien und zeigen, wie diese verwendet werden, um Daten aus verschiedenen Protein-Ligand-Wechselwirkungen, die zu passen. Unsere Methode verwendet das StepOne qPCR Instrument, für die maßgeschneiderte Datenanalyse-Software ist vorhanden; Während dies beschleunigt die Datenanalyse, können die Ergebnisse von anderen Instrumenten mit zuvor veröffentlichten Verfahren 9 bearbeitet werden, und dasselbe stromabwärts Analyse durchgeführt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Eine breite Palette von Methoden sind derzeit für die Bestimmung der Dissoziation zwischen einem Protein konstant und die Interaktion kleine Moleküle zur Verfügung. Allerdings sind die meisten von ihnen ist der Zugriff auf spezielle Ausrüstung, und erfordern oft eine gewisse Kompetenz, um effektiv zu etablieren zuverlässige Experimente und Daten zu analysieren. Differential Scanning fluorimetrisch (DSF) wird zunehmend als eine robuste Methode zur ersten Screening von Proteinen zu interagieren kleine Moleküle, entweder zur Identifizierung physiologischen Partnern oder für Hit Entdeckung eingesetzt. Diese Technik hat den Vorteil, dass es nur eine PCR-Maschine für die quantitative PCR und so geeignete Instrumentierung ist in den meisten Einrichtungen benötigt; Eine exzellente Auswahl von Protokollen sind bereits verfügbar; und es gibt starke Präzedenzfälle in der Literatur für mehrere Anwendungen des Verfahrens. Frühere Arbeiten mehrere Mittel zur Berechnung Dissoziationskonstanten von DSF Daten vorgeschlagen, aber diese sind mathematisch anspruchsvoll. Hier haben wir DMonstrate Verfahren zum Schätzen Dissoziationskonstanten von einer moderaten Menge an DSF experimentellen Daten. Diese Daten können in der Regel gesammelt und an einem einzigen Tag analysiert werden. Wir zeigen, wie verschiedene Modelle verwendet werden, um Daten von der einfachen Bindungsereignisse gesammelt zu passen, und wo kooperative Bindung oder unabhängige Bindungsstellen vorhanden sind. Schließlich präsentieren wir ein Beispiel für die Datenanalyse in einem Fall, wo Standard-Modelle nicht gelten. Diese Methoden werden mit den Daten auf handelsüblichen Kontrollproteine ​​gesammelt und zwei Proteine, die von unserem Forschungsprogramm veranschaulicht. Insgesamt bietet unsere Methode eine einfache Möglichkeit für die Forscher, um schnell zu gewinnen weitere Einblicke in Protein-Ligand-Interaktionen mit DSF.

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Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Bestimmung der Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Differential Scanning Fluorimetrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.1K Aufrufe.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Serie: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Forschung

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Spermiengewinnung differenzielle Qualität mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...