This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

HINWEIS: Alle Verfahren und Behandlung der Tiere mit NIH Ethikrichtlinien und genehmigte Protokoll Anforderungen der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of California, San Francisco eingehalten werden. 1. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie <ol><li> Führen Sie chirurgische Eingriffe an einem sauberen, gewidmet Raum. Autoklavieren alle chirurgischen Instrumenten, sterilisieren mit einer Glasperlen Sterilisator vor der Operation. HINWEIS: In diesem Protokoll verwenden postnatalen Tag 10 bis 12 (P10-12) FVB Mäusen. Unterschiedlichen Alters und Mäusestämme können verwendet werden, um die Bedürfnisse einer bestimmten Projekt zu erfüllen. Mäuse älter als P40 kann eine Herausforderung sein, weil die Bulla Knochen wird härter. </li><li> Anesthetize die Mäuse intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin-Hydrochlorid (100 mg / kg), Xylazinhydrochlorid (10 mg / kg) und Acepromazin (2 mg / kg). Beginnen chirurgische Vorbereitung erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise. Wo notwendigy, zu verwalten eine Auffrischimpfung (ein Fünftel der ursprünglichen Dosis) des Anästhetikums Cocktail, um das ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen. HINWEIS: Achten Sie darauf, bei diesem Schritt, weil die meisten der in diesem Alter beobachtet Sterblichkeit durch Narkoseüberdosierung verursacht. </li><li> Bedeckung Augen des Tieres mit einer Schutzaugensalbe, die Augen während der Anästhesie feucht zu halten, unterdrückt Lidschlusseflexes des Tieres. </li><li> Bewegen Sie die Maus mit Hals auf einem Heizkissen während des gesamten Verfahrens verlängert, bis die Maus ganz wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. </li><li> Rasieren Sie die links nach Ohrregion mit einer Schneidemaschine und Desinfektion mit 70% Ethanol und PVP-Jod vor der chirurgischen Manipulation. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren und Vector Injection <ol><li> Verwenden Sie einen Post-Ohrenansatz, um die Bulla tympanica aussetzen. Inzision das subkutane Gewebe mit einer kleinen Schere, um die Post-Ohrmuskel aussetzen. Nach dem Zurückziehen des Fettgewebes zu the posterioren Seite des Einschnitts, trennen die Muskeln, um die rechte und linke Seite senkrecht zum Einschnitt, um die zeitliche Knochen freizulegen. Stellen Sie sicher, dass dieser Schnitt ist lang genug, um bequem mit ausreichender Visualisierung zu arbeiten. </li><li> Perforieren die Bulla tympanica mit einer 25 G-Nadel und erweitern Sie das Loch bei Bedarf mit einer Zange durch Abziehen der Knochen zurück, um Zugang zum basalen Windung der Cochlea zu ermöglichen, und dann erweitern ausreichend, um das Steigbügel Arterie und die Rundfenstermembran zu visualisieren (RWM) . </li><li> Punktion der RWM sanft in der Mitte mit einem Borosilikat Kapillarpipette. Beachten Flüssigkeit Ausfluss durch die RWM an dieser Stelle; das ist normal. Warten Sie, bis die Auslauf stabilisiert hat (die effluxed Flüssigkeit aus der Cochlea ist mit einem sterilen Filterpapier getrocknet). HINWEIS: Achten Sie beim Halten und Vorschieben der Glasnadel, so dass der RWM Perforation ist so klein wie möglich. Abhängig von dem Mikroskop verwendet wird, halten die Pipetten mit Hilfe eines Mikromanipulators oder von Hand mit einer PipetteHalter. </li><li> Bereiten Sie die Pipetten für die Injektion mit einer Pipette Abzieher die gleiche Weise Patch-Clamp-Pipetten werden vorbereitet. Sicherzustellen, dass der Kopfkreisdurchmesser groß ist (etwa 15 &amp; mgr; m im Durchmesser), so dass Pipettieren des Virus in die und aus leicht gemacht. </li><li> Erstellen Sie 1-2 ul AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP oder AAV2-GFP in eine Injektionspipette. Nachdem der Ausfluß stabilisiert (5 bis 10 min), microinject diese feste Volumen in die Scala tympani durch das gleiche Loch zuvor in RWM hergestellt. </li><li> Verschließen Sie den RW Nische schnell nach dem Herausziehen der Pipette mit einem kleinen Stecker des Muskel- und sichern Sie sie mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber auf den Muskel platziert, um ein Auslaufen aus dem runden Fenster zu vermeiden. HINWEIS: Verschließen Sie das Loch sehr gut, nachdem die Nadel mit einem kleinen Stecker des Muskel entfernt, um jede Leckage aus Perilymphe der Cochlea-diesem Schritt verhindern, ist entscheidend für die Anhörung zu bewahren. Nicht versiegeln komplett die RWM in Hörverlust im Laufe der Zeit führen. </li><li> Nach der Injektion decken dieLoch im Gehör Bulla mit Fettgewebe, geben die Post-Ohrmuskulatur und Fettgewebe in ihre normale Position und Naht der Wunde in Schichten mit einer 6-0 oder kleiner Chrom resorbierbaren Nahtmaterial. </li><li> Desinfizieren Sie die Wunde mit PVP-Jod. </li></ol> 3. Postoperative Behandlung <ol><li> Zeigen Mäuse in einem warmen Käfig und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich vollständig erholt, dann verschieben Sie sie zurück mit der Mutter. Es wird empfohlen, die männliche aus dem Käfig, bevor die Welpen wieder mit der Mutter entfernen. </li><li> Verwalten subkutane Carprofen (2 mg / kg) zur Analgesie postoperativ und jeder 24 Stunden danach für 3 Tage, um Entzündung und Schmerz zu verwalten. Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Not, abnorme Gewichtsverlust, Schmerzen oder Infektionen. Allgemein mit der 3. Tag nach der Operation alle Mäuse normalerweise handeln. Falls irgendwelche Anzeichen von Leiden oder Krankheiten werden in einer Maus nach dem 3. Tag, sollten euthanizing ter Maus nach den Richtlinien des Instituts. </li></ol> 4. Bewertung der Cochlear Funktion Folgende Viral Lieferung Mit Hirnstammaudiometrie (ABR) Aufnahmen HINWEIS: Die akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) ist ein akustisch evozierte Potenzial aus der laufenden elektrischen Aktivität im Gehirn extrahiert und über Elektroden unter der Kopfhaut platziert aufgezeichnet. Das Tier wird mit Ton stimuliert. Die resultierende Aufzeichnung besteht aus fünf Wellen, die die elektrische Aktivität des aufeinanderfolgenden Punkten in der Hörbahn in den ersten 10 ms nach Beginn eines auditorischen Reizes zu reflektieren. <ol><li> Anesthetize Mäusen durch intraperitoneale Injektion eines Gemisches von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen in der gesamten Hörtest bis die Maus ist völlig wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. HINWEIS:die folgenden Klangreize in diesem Experiment: klicken (5 ms Dauer; 31 Hz Präsentation Rate). </li><li> Zeigen subdermale Nadelelektroden an der Spitze, unter der Ohrmuschel des linken Ohrs (Referenz), und unter dem Gegenohr (Masse) und starten Sie die Aufnahme ABRs wie zuvor in einer schalldichten Kammer 27,28 beschrieben. Nehmen ABR-Wellenformen in 5 Intervallen unten von maximalen Amplitude dB Schalldruckpegel. </li><li> Bestimmen ABR Schwellen postoperativ bereits 4 Tage nach der viralen Lieferung HINWEIS: Threshold wird als die niedrigste Reizniveau, bei dem die Antwortpeaks für Wellen definiert I-V waren eindeutig und wiederholt auf Sichtkontrolle vor. </li><li> Messen Welle I, um die Aktivität des Cochlea-Nervs analysieren. Die niedrigste Anregungspegel, der ein nachweisbares ABR-Wellenform liefert als Schwellwert definiert. </li></ol> 5. Cochlear Transgene Proteinexpression mittels Immunfluoreszenz <ol><li> Anesthetize Mäuse durch eine Überdosis intraperitoneal Injektion einer Mischung von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin. </li><li> Enthaupten den Kopf erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise. </li><li> Präparieren Sie die cochleae heraus und Verfahren für ganze-mount Immunfluoreszenz wie beschrieben 26. Ein detailliertes Protokoll Cochlea ganze Montage Immunfluoreszenz unter Verwendung von Anti-VGLUT3 und Anti-Myosin Antikörper 7a in Akil et al., 2013 29 beschrieben. </li><li> Für GFP-Markierungen, brüten die Cochlea Ganz Halterungen über Nacht bei 4 ° C mit einem Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper bei 1: 250-Verdünnung. </li><li> Zweimal Spülen der Cochlea für 10 min mit PBS gewaschen und dann für 2 Stunden inkubieren in Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert Cy2, verdünnt 1: 4.000 in PBS. </li><li> Zweimal spülen cochleae mit PBS für 10 Minuten inkubieren sie mit DAPI für 15 min. </li><li> Montieren Sie den cochleae auf Glasobjektträgern und beobachten under ein Mikroskop mit konfokaler Immunfluoreszenz. </li></ol>

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M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Technik, die für Cochlea-Gentherapie eingesetzt werden können, mit dem Ziel der Wiederherstellung oder der Rettung normaler Gehörfunktion, die durch einen genetischen Defekt beeinträchtigt ist. Da es in der Regel atraumatisch ist, ist dieser Ansatz sicher für Cochlea-Gentransfer oder andere potenzielle molekulare Therapien 30. Andere Ansätze für Cochlea-Therapie beschrieben worden, einschließlich eines Bauchansatz 24, Cochleostomie 31,32<...

Die Gentherapie ist seit langem als mögliche Behandlung für genetische Schwerhörigkeit vorgeschlagen worden, aber der Erfolg in diesem Bereich schwer zu 1 blieb. Bisher wurden viral vermittelten Methoden aufgrund der theoretischen Möglichkeit, bestimmte Zelltypen innerhalb des relativ unzugänglich Cochlea gezielt überwogen. Beide Adenovirus (AV) und Adeno-assoziierten Virus (AAV) wurden für Cochlea-Genübertragung verwendet. AAVs sind vorteilhaft in der Cochlea für eine Reihe von Gründen. Sie sind replikationsdefizienten Viren und effizient transgenen Moleküle zu übertragen, um verschiedene Zelltypen, einschließlich Neuronen, ein wichtiges Ziel für eine Reihe von Ursachen für Hörverlust. AAV Eintritt in die Zelle durch spezifische Rezeptoren vermittelt 2; Somit muss die Wahl eines bestimmten Serotyps kompatibel sein mit den Zelltypen zu transduzieren. AAVs effektiv transfizieren Haarzellen 3 und enthalten in das Wirtsgenom, was zu einer stabilen, langfristige Expression des transgenic Protein und phänotypische Veränderungen in der Zelle 4. Obwohl nicht unbedingt für kurzfristige Anwendungen wie Haarzellenregeneration vorteilhaft, eine langfristige Expression für stabile Rettung von genetischen Defekten sehr wichtig. Da AAVs sind nicht mit einem menschlichen Krankheit oder Infektion assoziiert und zeigen keine Ototoxizität 5,6,7, sind sie ein idealer Kandidat für den Einsatz in der Gentherapie für vererbte Formen von Hörverlust 8. Transfer von exogenem genetischen Material in den Säugetierinnenohr mittels viraler Vektoren ist im letzten Jahrzehnt untersucht und ist als vielversprechende Methode zur Behandlung von sowohl genetische und erworbene Formen von Hörverlust 9 entstehen. Die Cochlea ist potentiell ein ideales Ziel für die Gentherapie aus mehreren Gründen: 1) seines kleinen Volumens eine begrenzte Menge des Virus notwendig erfordert; 2) ihre relative Isolierung von anderen Organsystemen Grenzen Nebenwirkungen; und 3) ihre fluidgefüllten Kammern erleichtern viralenLieferung in ganz Labyrinth 10, 11,12,13,14, 15. Mausmodelle für angeborene Taubheit ermöglichen den Einsatz von vielen Methoden der Untersuchung der Entwicklung des Innenohrs in einem systematischen, replizierbar Weise überwachen. Während die geringe Größe der Maus cochleae nicht präsentieren einige chirurgische Schwierigkeit dient die Maus als ein äußerst wichtiges Modell in der Studie der genetischen Hörverlust, mit mehreren experimentellen Vorteile gegenüber anderen Arten 16. Mausmodelle ermöglichen Einschätzung einer Reihe von Eigenschaften durch genetische Kopplungsanalyse, Sammlung von detaillierten morphologischen Beobachtungen und Simulation pathogenen Szenarien; als solche sind sie gute Kandidaten für die viral vermittelten Gentherapie. Umfangreiche genetische Studien an Mäusen in Kombination mit technologischen Fortschritte haben es möglich gemacht, gentechnisch veränderten Mäusen reproduzierbar über Labors 17,18, 19, 20,21 erzeugt. Furthermore, gibt es zahlreiche Modelle für sowohl erworbene und vererbte Schwerhörigkeit Phänotypen bei Mäusen, so dass strenge Tests in diesem Tiermodell 22, 23,24. So korrigieren Anhörung mit viral vermittelten Gentherapie in einem Mausmodell ist eine geeignete erste Schritt bei der Suche nach einem Heilmittel für Erkrankungen des Menschen. Wir haben bereits gezeigt, dass transgene Mäuse, denen vesikulären Glutamattransporter 3 (VGLUT3) werden taub geboren wegen des Mangels an Glutamatfreisetzung an der IHC Bandsynapse 25. Da diese Mutation nicht auf eine Primär Degeneration der Haarsinneszellen führen, sind diese mutierten Mäusen möglicherweise ein ausgezeichnetes Modell, in der Cochlea Gentherapie für angeborene Hörverlust testen. Bisher wurde eine Reihe von viralen Abgabetechniken für Cochlea Gentherapie beschrieben wurden, einschließlich runden Fenstermembran Diffusion runde Fenstermembran Injektion und Abgabe über einen Cochleostomie. Es gibt starkeial Vor- und Nachteile von jedem dieser Ansätze 9. Hier berichten wir über eine chirurgische Methode für viral vermittelte Genübertragung auf die VGLUT3 KO Maus Innenohr durch die Rundfenstermembran (RWM). Die Post-Ohr RWM-Einspritzverfahren ist minimal-invasiv mit ausgezeichneten Anhörung Erhaltung und ist relativ schnell. Wie wir bereits veröffentlicht, in dem Bemühen, wiederhergestellt in diesem Mausmodell Gehör ein AAV1 Vektor, der das Gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) in die Cochlea dieser taub Mäusen am postnatalen Tag 12 eingeführt (P! @), Was die Wiederherstellung des Gehör 26. Anhörung im VGLUT3 KO-Mäusen wurde von akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) überprüft, während transgene Protein-Expression wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) überprüft. Diese Methodik somit zeigt, dass viral-vermittelte Gentherapie kann einen genetischen Defekt, die ansonsten Ergebnisse würden in Taubheit zu korrigieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Name</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:161px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:111px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Ketamine</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
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			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
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			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Carprofen analgesia</td>
			<td style="width:177px;">Provided by UCSF LARC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
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			<td style="width:177px;">Betadine Puredue Pharma</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
			<td style="width:177px;">Alcon</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Heating pad</td>
			<td style="width:177px;">Braintree scientific, inc.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">25G needle</td>
			<td style="width:177px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:161px;">305127</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:355px;">Borosilicate capillary pipette</td>
			<td style="width:177px;">World precision instruments, inc.</td>
			<td style="width:161px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Suture PDS*plus Antibacterial</td>
			<td style="width:177px;">Ethicon</td>
			<td style="width:161px;">PDP149</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Tissue glue (Vetcode)</td>
			<td style="width:177px;">Butler Schein</td>
			<td align="right" style="width:161px;">31477</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:355px;">Rabbit Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">A11122</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>MZ95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Flaming/ Brown Micropipette&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instrument Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puller Model P-97&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TDT BioSig III System&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Tucker-Davis Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane

Die Gentherapie, verwendet werden, um die funktionelle Erholung von Innenohrschwerhörigkeit zu erreichen, verspricht besseres Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und genetischen Mechanismen, die zu Gehörverlust zur Folge gewähren. Einführung von Vektoren in das Innenohr sind in einer Weise, die weit verteilt das Agens durch die Cochlea und minimiert eine Schädigung der bestehenden Strukturen erfolgen. Diese Handschrift beschreibt eine postOhr chirurgischen Ansatz, der für Maus Cochlea-Therapie mit molekular, pharmakologischen und virale Lieferung an Mäusen postnatalen Tag 10 Jahren über die Rundfenstermembran (RWM) verwendet werden kann. Diese chirurgischen Ansatz ermöglicht die schnelle und direkte Lieferung in die Scala tympani und minimiert den Blutverlust und die Vermeidung von Tiersterblichkeit. Diese Technik beinhaltet vernachlässigbare oder keine Schäden an wesentlichen Strukturen des inneren und des Mittelohres und Nackenmuskulatur, während hundert Erhaltung Anhörung. Um die Wirksamkeit dieser chirurgischen Technik wird der vesikulären glutam demonstrierenaß transporter 3 Knockout (VGLUT3 KO) Mäusen wird als ein Beispiel von einem Mausmodell für angeborene Taubheit, die Erholungsfähigkeit nach Abgabe VGLUT3 zum inneren Ohres unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV-1) verwendet werden.

Um die technischen Merkmale und die Nützlichkeit der Post-Ohrenansatz für Cochlea molekularen Therapie zu verifizieren, wurden AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP und AAV2-GFP in P10-12 Mäuse Innenohr über die RWM geliefert. Dieser Ansatz zeigt erfolgreiche Expression des Transgens im inneren Haarzellen (IHC) (VGLUT3 Abbildung 1 und Abbildung 2 GFP und GFP 3A), äußeren Haarzellen (OHC) (GFP Abbildung 2) und Stützzellen (GFP Abbildung 2 und <st...

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Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Aufrufe.  University of California, San Francisco. The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane. 

Serie: Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Maus Mikroinfusionstechnik für Zielsubstanz Lieferung in das ZNS<i&gt; über</i&gt; Die Arteria carotis interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...