Diese Arbeit wird durch Anschubfinanzierung von The Jackson Laboratory unterstützt.

Ein. Vorbereiten Maus Glia Kultur für neuronale Kultur Conditioning <ol><li> T75-Flaschen sind mit Kollagenlösung (1:3 Verdünnung Purecol in ddH 2 O) beschichtet. Die Kolben werden aufgerichtet und über Nacht trocknen gelassen in einer Gewebekultur Kapuze. </li><li> Dissektion Puffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 30 mM Dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, ohne Calcium) und Glia (DMEM mit 10% FBS, 10 Einheiten / ml Penicillin, 10 ergänzt ug / ml Streptomycin und Glutamax) hergestellt und bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Am Tag der Glia Kultur, ist die Glia Medien für mindestens 30 min in einem 37 ° C Wasserbad Dissektion Mäusehirnen erwärmt. Embryonalen oder neugeborenen Mäusen durch schnelle Enthauptung getötet. Cerebral Cortexbereiche werden unter einem Dissektionsmikroskop seziert. </li><li> Seziert Hirngewebe in Papain-Lösung (100 ml Papain und 20 ul 1% DNase I in 2 ml Puffer Dissektion) bei 37 ° C verdaut for 20 min. </li><li> Nach Papainverdau werden Hirngewebe mit 10 ml vorgewärmten Glia Medien gespült. Frisches Glia Medien (2 ml) wird dann zu den verdauten Hirngewebe zugegeben und die Gewebe mit einer feuer-poliertes Glas Pasteurpipette verrieben. </li><li> Frische Medien Glia (8 ml) wird zu der dissoziierten Geweben aufgenommen. Eine Zelle 70 um-Sieb verwendet wird, um die dissoziierte Gewebesuspension filtern. Die Zellen werden dann in T75-Flaschen (in der Regel 2-3 Embryonen kann Saatgut ein T75-Kolben) ausgesät und in eine 37 ° C Zellkulturbrutschrank. </li><li> Am nächsten Tag wird die Medien von den T75-Flaschen abgesaugt. Die Kolben werden mit 10 ml PBS gespült. Frische Medien Glia (10-15 ml) wird dann zu jedem Kolben zugegeben. </li><li> Innerhalb von 10-12 Tagen sollte Glia in den T75-Flaschen werden konfluent. Glia-Zellen werden mit PBS gespült, und mit 5 ml 0,05% Trypsin zu jedem T75 Kolben zugegeben. </li><li> Nach Trypsin Inkubation bei 37 ° C für 5 min, Gliazellen dissoziiert und Gliazellen voneinander T75 Kolbeninhalt zweigeteiltverschiedene Kollagen-beschichteten T75-Flaschen. </li><li> Kultur Einsätze (Millipore PICM03050) sind, indem sie in 6-Well-Platten, Beschichten mit Kollagen und lufttrocknenden über Nacht hergestellt. Glia Medien (je 2 ml) unterhalb jeder Kultur Einlage platziert. </li><li> Glia von konfluenten T75-Flaschen mit Trypsin behandelt und auf die Kultur beimpft Einsätze (ein T75-Flasche pro 6-Well-Platte, 2 ml jeder Einsatz). Diese Gliazellen Kultur Einsätze werden zur Konditionierung der neuronalen Kulturen werden. </li></ol> 2. Neuronale Kultur <ol><li> Die Deckgläschen für neuronale Kultur durch Einweichen in 70% HNO 3 mindestens über Nacht gereinigt. Deckgläser werden dann mit ddH 2 O mindestens 3-mal gewaschen und getrocknet, in einem Isotemp Ofen (&gt; 200 ° C) über Nacht. </li><li> Gereinigt Deckgläschen in einer 6-Well-Platte, ein Deckglas pro Well platziert. Deckgläser mit Poly-L-Lysin-Lösung (2 ml, 0,1% in 100 mM Borsäure, pH = 8,5) über Nacht in einem 37 ° C Inkubator beschichtet. </li><li> DiePoly-L-Lysin-Lösung wird von den Deckgläsern entfernt und Deckgläser werden 3 mal mit autoklaviertem ddH 2 O gewaschen Deckgläser werden dann in einem 37 ° C Inkubator über Nacht in Plattierungsmedien (Neurobasal mit 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 10 Einheiten / ml Penicillin, 10 pg / ml Streptomycin, Glutamax ergänzt; 2% B27 Supplement wird dem Plattierungsmedium zugegeben am Tag sie verwendet wird). </li><li> Am folgenden Tag wurden die Plattierungsmedien wird entfernt und 2 ml frisches Plattierungsmedien mit B-27 in jede Vertiefung, die ein Deckglas aufweist zugegeben. </li><li> Trächtigen Mäusen (E15-18) werden mit CO 2 euthanasiert und embryonalen Mäuse werden durch Dekapitation getötet. Der Hippocampus oder Striatum wird aus dem Hirngewebe seziert und in ein 15 ml konischen Röhrchen mit eiskaltem Dissektion Puffer, Kultur Neuronen im Hippocampus oder Striatum medium spiny Neuronen sind. </li><li> Seziert Hirngewebe dissoziiert werden mit Papain, wie in den Schritten 1.4) und 1.5) beschrieben. </li><li> Fach Dissoziation, wird die Anzahl der Zellen in jedem neuronalen Suspension mit einem Hämozytometer gezählt. Neuronen werden dann auf jeder Deckplättchens in einer Dichte von 0,4 x 10 6 Zellen pro Well einer 6-Well Platte ausgesät und kultiviert in einem 37 ° C Inkubator über Nacht (Neuronen sind DIV 0). </li><li> Um Glia Kultur fügt zur Konditionierung der neuronalen Kulturen herzustellen, wird die Glia Medien aus den Glia Kultur Einsätze entfernt und frisches Plattierungsmedium zugegeben (2 ml in dem Einsatz und 2 ml unterhalb der Einlage). </li><li> Am nächsten Tag (DIV 1) werden die Deckgläser mit Neuronen unter den Gliazellen Kultur Einsätze, ein Deckglas in jedem gut platziert. </li><li> Neuronen werden mit dem halben Volumen von frischem vorgewärmten Fütterung Medien (mit B-27) alle 3-4 Tage lang gefüttert, bis sie bereit für die Transfektion und Imaging Experimente sind. </li></ol> 3. Transfektion <ol><li> Neuronal Transfektion erfolgt mit Lipofectamin 2000. Für jede neuronale Kultur (ein Kultur pro Deckglas), 2 ulLipofectamin 2000 und 1 ug DNA verwendet werden. Frische Neurobasalmedium ohne Aufpreis wird verwendet, um Lipofectamin und DNA verdünnen. </li><li> DNA und Lipofectamin werden für 20 min bei Raumtemperatur nach Durchmischung inkubiert. </li><li> Sparen Sie 1 ml der Medien von unterhalb jeder Glia Kultur Einsatz und 1 ml aus dem Inneren jedes Einsatzes, und übertragen Sie die Medien zu einer konischen Rohr. Fügen Sie das gleiche Volumen der Fütterung media + B27 auf die gespeicherte Medium und Inkubation bei 37 ° C. Dieses Medium wird für die neuronale Kultur nach Transfektion verwendet. </li><li> Nach der 20-min Lipofectamin / DNA Inkubation werden Glia Kultur fügt momentan von den 6-well Platten entfernt. Die 200 ul Lipofectamin / DNA-Gemisch wird jedem Deckglas mit Neuronen aufgenommen. Die Kultur Glia Einsätze werden dann zu jeder Vertiefung zurückgegeben, oberhalb der Neuronen. Erzeugung von Blasen unter der Membran der Kultur fügt sollte vermieden werden. Neuronen sind mit der Lipofectamin / DNA-Gemisch bei 37 ° C für 2-4 Stunden inkubiert. </li><li> Nach the 2-4 h Inkubationszeit werden Glia Inserts wieder entfernt. Die Kulturmedien mit dem Lipofectamin / DNA-Gemisch wird aus jedem Well entfernt. Die Medien in Schritt 3.3) gespeichert wird, um Neuronen (2 ml pro Vertiefung) zugegeben. Glia Kultur Einsätze werden in jede Vertiefung zurückgeführt und die Medien von Glia jedes Einsatzes entfernt wird, und 2 ml des Mediums aus Stufe 3.3) wird in jeden Einsatz zugegeben. </li><li> Neuronen sind für eine zusätzliche 24-72 Stunden damit Ausdruck der transfizierten cDNA vor TIRF Bildgebung auf diese Neuronen durchgeführt wird kultiviert. </li></ol> 4. TIRF Imaging <ol><li> Künstliche Liquor (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM Glucose, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) wird für Live-Imaging-Experimente verwendet werden. Unsere TIRF Imaging-System ist speziell Set-up mit einem 100-mW Cyan Laser zur Anregung und eine Electron Multipliziert Charge Coupled Device (EMCCD) Kamera für einen Detektor. </li><li> Vor der Bebilderung Experimenten wird die aCSF in einem 37 gewarnt &amp; dzB, C Wasserbad für mindestens 30 min. Heizeinsatz für Echtzeit-Bildgebung auf dem Mikroskoptisch platziert und der Heizeinsatz, Laser und Kamera werden für mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebungsexperimenten erwärmt. </li><li> Ein Deckglas mit transfizierten Neuronen in der Live-imaging Kammer montiert. Die vorgewärmte aCSF ist in der Kammer angeordnet, nachdem die Kammer montiert ist; dieser Schritt sollte so schnell wie möglich durchzuführen. </li><li> Sobald die Kammer auf der Heizeinsatz auf dem Mikroskoptisch platziert wird, werden visuell unter transfizierten Neuronen epi-fluoreszierenden Bildgebungsmodus identifiziert. </li><li> Nach gesunde transfizierten Neuronen identifiziert werden (siehe Abbildungen 1 und 2), wir führen typischerweise 1 min von Foto-bleach zu dem bereits bestehenden pHluorin Fluoreszenz auf der Plasmamembran zu beseitigen, wie pHluorin-Rezeptoren auf der Plasmamembran sehr hohe Fluoreszenz Ebenen wann haben TIRF Bildgebung ersten Mal gestartet wird, stört das mit Visualisierung einzelner insertion Veranstaltungen. </li><li> Nach Photobleichmittel wird die Verstärkungseinstellung des Elektronen-Vervielfacher auf dem EMCCD Kamera auf Maximum gesetzt, und die Aufzeichnung wird für 1 min bei 10 Hz durchgeführt. </li><li> Jede Aufnahme enthält 600 Bilder. Individuelle Einsetzen Ereignisse werden durch die Wiedergabe der Aufnahme wieder mit ImageJ identifiziert. Individuelle Insertionen analysiert manuell mit ImageJ. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Konsequente neuronalen Kultur ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Live-Imaging-Experimente. Abbildung 1 zeigt mit der Maus Hippocampusneuronen kultiviert mit unserem Protokoll von DIV 11 bis 18 Div. Es ist klar, aus den Bildern, dass die Neuronen haben umfangreiche Prozesse entwickelt und dass die dendritischen Prozesse dicht mit dendritischen Dornen, Anzeichen dafür, dass diese Neuronen gesund Kultur sind abgedeckt. Unsere Kultur Protokoll könnte auch für andere Arten von Neuronen im Gehirn verwendet werden. Zum Beispiel haben wir vor kurzem verwendet dieses Protokoll zu Kulturstriatalen medium spiny Neuronen in einer Studie zu Dopamin D2-Rezeptor (DRD2) Insertion in kultivierten Maus mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums 9 zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt mit der Maus mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums kultiviert mit unserem Protokoll bei DIV 8. Wir haben auch erfolgreich TIRF Bildgebung superecliptic pHluorin-tagged DRD2s in dieser Art von Neuron ausgeführt. Abbildung 3 zeigt die Expression von pHluorin-tagged DRD2 (pH-DRD2) in einem Medium spiny Neurons und Visualisierung der pH-DRD2 Insertion in diesem Neuron. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Abbildung 1. Maus Hippocampus Kultur über die Schnittstelle Kultur-Methode. DIV: Tag in vitro, dem Tag der Kultur wird als DIV 0 betrachtet. Aus den Bildern, ist es offensichtlich, dass Hippocampusneuronen reife bei dieser Art der Kultur zwischen 11 und DIV DIV 15. Bei DIV 11 und 13, werden neuronalen Dendriten mit filipodia und unreif Stacheln bedeckt. Bei DIV 15 und18 werden neuronalen Dendriten mit großen Stacheln bedeckt, einen Hinweis auf reifer Neuronen. Linke Panels: niedrigste Vergrößerungsbildern der Maus Hippocampusneuronen in verschiedenen Altersstufen. Rechts-Panels: hoher Vergrößerung Bilder (Zoom auf neuronalen Dendriten der linken Seite) der neuronalen dendritischen Prozesse mit dendritischen Dornen in verschiedenen Altersstufen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Abbildung 2. Maus striatalen medium spiny neuron Kultur über die Schnittstelle Kultur-Methode. Neuronen in den Bildern sind DIV 8. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Abbildung 3. Eine Maus striatalen medium spiny neuron mit super Ekliptik pHluorin-markierten Dopamin-D2-Rezeptor (pH-DRD2) transfiziert. Bild auf der linken Seite ist Maximum Intensity Projection einer Zeitraffer-Aufnahme (600 Bilder, 100 ms pro Bild). Weiß Pfeilspitzen zeigen einzelne vesikulären Einfügen von pH-DRD2. Dieses Bild bleibt Einsetzen Informationen in der xy Dimension verliert aber die Zeitinformation. Bild auf der rechten Seite zeigt yt Maximum Intensity Projection, bei dem die xyt Stapels um 90 Grad um die y-Achse ist, und die maximale Pixel auf jeder x-Achsen-Linie ist auf ein einzelnes y-Achsen-Pixels projiziert. Dieses Bild bleibt Einsetzen Informationen entlang der yt Achse, sondern verliert die x-Achse Informationen.

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	<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylation+by+DHHC5/8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking.">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li><li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li><li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Aus unbekannten Gründen sind Mäuseneuronen immer schwieriger, Kultur als Rattenneuronen. Nach unserer Erfahrung funktioniert eine Mischkultur aus Neuronen und Gliazellen auch für die primäre kultivierten Maus Neuronen. Allerdings ist eine solche Mischkultur nicht geeignet für TIRF Imaging-Experimente, wie sie in dieser Art von Kultur Neuronen und ihre Prozesse auf der Oberseite des Glia-Zellen wachsen, Situierung der neuronalen Zellkörper und dendritischen Prozesse außerhalb der Reichweite der TIRF-Mikroskopie ne...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gereinigte Rinder-Kollagen-Lösung (Purecol)</td&gt;<td&gt; Advanced Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumpyruvat</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM high glucose</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fötalem Rinderserum (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papain</td&gt;<td&gt; Worthington Biochemical Corp</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease I aus Rinderpankreas (DNase I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0,05% Trypsin</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-L-Lysin Hydrobromid</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borsäure</td&gt;<td&gt; Fisher-Scientific</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal Medium</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 Serum-Free Supplement</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Wärme inaktive Pferdeserum</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher-Scientific</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kultur einfügen</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

imaging phluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons

Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die Rezeptor-zwischen der Plasmamembran (PM) und intrazellulären Kompartimenten erfordert einen experimentellen Ansatz mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Darüber hinaus muss ein solcher Ansatz haben auch die Fähigkeit an Rezeptoren auf der PM von denen in intrazellulären Kompartimenten lokalisiert unterscheiden. Am wichtigsten ist, Erfassen Rezeptoren in einem Vesikel erfordert herausragende Nachweisempfindlichkeit, da jedes Vesikel trägt nur eine kleine Anzahl von Rezeptoren. Standard-Ansätze zur Untersuchung Rezeptortransport gehören Oberfläche Biotinylierung durch biochemische Detektion, die sowohl die erforderlichen räumlichen und zeitlichen Auflösung fehlt folgt; und Fluoreszenzmikroskopie Prüfung immunmarkierten Oberflächenrezeptoren, die chemische Fixierung von Zellen erfordert und daher keine ausreichende zeitliche Auflösung 1-6. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir und andere entwickelt und eingesetzt eine neue strategischetegie, dass ermöglicht die Visualisierung des dynamischen Einfügen von Rezeptoren in der PM mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung 7-17. Der Ansatz enthält Tagging von einem pH-sensitiven GFP, das superecliptic pHluorin 18, an den N-terminalen extrazellulären Domäne des Rezeptors. Superecliptic pHluorin hat die einzigartige Eigenschaft, Fluoreszenz bei neutralem pH-Wert und nicht fluoreszierenden bei saurem pH (pH &lt;6,0). Daher sind die markierten Rezeptoren nicht fluoreszierenden wenn sie innerhalb des Lumens des sauren intrazellulären Transport Vesikel oder endosomalen Kompartimenten, und sie werden nur leicht sichtbar, wenn an den extrazellulären neutralen pH-Umgebung ausgesetzt ist, an der äußeren Oberfläche der Uhr. Unsere Strategie konsequent ermöglicht es uns, PM Oberflächenrezeptoren von denen in intrazellulären Vesikeln zu unterscheiden. Um eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösungen, sowie die Empfindlichkeit erforderlich, um dynamische Menschenhandel von Rezeptoren zu untersuchen erreichen, beschäftigten wir insgesamt internen reflektierenion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die uns um die optimale räumliche Auflösung der optischen Bildgebung (~ 170 nm) zu erreichen aktivieren, um die zeitliche Auflösung der Video-Rate-Mikroskopie (30 Bilder / sec), und die Empfindlichkeit zu erfassen Fluoreszenz eines einzelnen GFP Molekül. Durch die Abbildung pHluorin-markierten Rezeptoren unter TIRFM konnten wir direkt visualisieren einzelnen Rezeptor-Insertionen in die PM in kultivierten Neuronen waren. Dieser Ansatz kann potentiell Bildgebung einem Membranprotein mit einer extrazellulären Domäne, die mit superecliptic pHluorin markiert werden könnte angewendet werden, und wird Dissektion der wichtigsten Mechanismen, die detaillierte Insertion verschiedener Membranproteine ​​(Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter, etc.) zu ermöglichen die Uhr.

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Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Aufrufe.  The Jackson Laboratory. Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.

Serie: Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...