Gefördert durch die NSF (0.854.551).

Ein. Pre-experimentelle Vorbereitungen <ol><li> Planen sechs Lösungen (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzungen): (a) 100 ml NZR (normal Zebrafisch Ringerlösung), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (niedrig Ca 2 +-Lösung), (e) 10 ml Locas + Papain, (f) 100 ml K +-interne Lösung. Lösungen (a), (b), (d) und (f) für bis zu einem Monat bei 4 ° C gelagert werden Lösungen (c) und (e) sollte der Tag des Experiments hergestellt werden. Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur, bevor Experimente sein. </li><li> Etikett und füllen vier 35 mm Petrischalen etwa zur Hälfte mit Lösungen (a), (c), (d) und (e). </li><li> Einen Sezieren Schale durch Füllen einer 60 mm Petrischale mit Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) und dann Schneiden einen Hohlraum hinein, durch die ein Fisch aufrecht sitzen, ohne umzukippen wird. </li><li> Bereiten zumindest zwei Zellisolation Werkzeugen durch Verkleben des Follikels Ende eines Hundehaare an das Ende eines GlasesPasteurpipette mit Sekundenkleber, so dass die Haare nach dem Ende der Pipette um etwa 0,5 cm erstrecken. Die Haare von Soft-Fell Hunde wie Labrador Retriever und Weimaraner gut funktionieren. </li></ol> 2. Isolierung von auditorischen und vestibulären Labyrinth <ol><li> Opfert einen Erwachsenen Zebrafisch durch Eintauchen in ein Becherglas mit NZR + Tricaine. Visuell überwachen die Kiemen bis alle Kiemendeckel Bewegungen aufgehört haben. Warten weitere zehn Minuten, bevor Sie Fische und Spülen mit frischem NZR. Diese Verfahren wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) der Pepperdine Universität, sondern Zulassung sollte von Ihrem eigenen Institution gewonnen werden. </li><li> Merken der Fisch das Sezieren Schale dorsal durch Einführen eines Standard Nähen Zylinderstift (etwa 2,5 cm lang) durch jede Augenhöhle und einen dritten Stift durch die dorsal-ventralen Achse etwa ein Drittel bis die Hälfte des Abstandes von Kopf bis zum Schwanz wie in dargestellt1A. </li><li> Unter einem Zoom (0,62-5x) Stereo Binokular mit 10x Okularen ausgestattet, verwenden Frühjahr Schere (Fine Science Tools Katalognummer 15000-02), um das Gehirn und ein kurzes Segment des Rückenmarks durch Entfernen des Schädels Dach von einem Punkt etwa aussetzen 0,5 cm kaudal des Niveaus der Kiemen vorn an der Nase des Fisches. Schneiden Sie das Rückenmark und heben das Gehirn mit feinen Pinzette (Fine Science Tools Katalognummer 11251-30) beim Schneiden der Spinalnerven und andere Anhänge, entfernen das Gehirn und entsorgen (Abbildung 1B). </li><li> Die ventrale Hälfte des Schädels Kapsel, bleibt bildet eine &quot;Schüssel&quot;, die Innenohr Organe enthält. Beachten Sie die prominenten, weiße, undurchsichtige Otolithen in den lagenas und Sacculi symmetrisch am caudalen Ende jedes Innenohr und die seitlich angebrachten Utriculus Otolithen mehr rostral (1C und 4A) befindet. </li><li> Entfernen Sie die Schale des Knochens durch Schneiden aller ventralen und seitlichen attachments unter leichtem Anheben aus dem Kopf mit feinen Pinzetten. Legen Sie sie in die Petrischale mit Locas (Abb. 1D und 4B). </li><li> Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, auseinander reißen die Schale an ihrem Mittellinie entweder durch Greifen der Seitenkanten des Knochens und Auseinanderziehen oder alternativ Trennen der rechten und linken Hälften, indem die Punkte der Zange in der Mitte und die Hälften neugierigen auseinander. Entfernen Sie die beiden Labyrinthe aus dem Knochen mit feinen Pinzette (Abbildung 2). </li><li> Überprüfen Sie die Labyrinthe der auditorischen und vestibulären Endorgane identifizieren: die Bogengänge, Primordialschläuche, sacculi und lagenas (4C). Die rosafarbenen Bereiche unter jedem otolith sind die Maculae mit den Haarzellen. Ebenso kennzeichnet ein Streifen von rosa in der Ampullen der Bogengänge die Cupula, wo die Haarzellen befinden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Otolithen aus der Lagena und Utriculus mit den feinen Pinzette ( <strong&gt; 2 und 4C). Es ist nicht notwendig, die aus der otolith Sacculus entfernen, da dabei die sackförmigen Haarzellen beschädigen können. </li></ol> 3. Haarzelle Isolation <ol><li> Verwendung eines Kunststoff-Pipette (Fisher Scientific Katalog-Nummer 13-711-09.00), verschieben Sie die Endorgane der Schale mit Locas + Papain minimiert das Volumen der Flüssigkeit übertragen. </li><li> Inkubieren diese Strukturen in diese Lösung für dreißig Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, verschieben Sie die Strukturen an die Schale mit NZR + BSA und inkubieren bei dieser Lösung für mindestens 30 Minuten. Haarzellen bleiben bei dieser Lösung gesund für bis zu vier Stunden wird aber nach 1-2 Stunden nach der Isolierung verschlechtern (siehe nächste Schritte). </li><li> In Vorbereitung für Zellisolation, verschieben Sie eine der End-Organe auf die Schale mit NZR. </li><li> Für die lagenas und Primordialschläuche, verwenden Sie einen Hund Haare sanft abheben, Maculae-Blatt rosa epithelialen tissue die die Haarzellen (3A) enthalten. Die Maculae ueber ausgehöhlt (unter Verwendung eines Hundehaare) unter den Otolithen des Sacculi, und die von ihren cupulae Stellen im Inneren der Ampullen der Bogengänge. </li><li> Verwendung von zwei Zellisolation Werkzeuge Schritt 1.4 hergestellten verreiben eine Makula oder Cupula eine Trümmerfeld die die Haarzellen (3B) enthält erzeugen. Lassen Sie die Zellen mindestens fünf Minuten, um auf den Boden der Schale, bevor es zu begleichen. </li><li> Stellen Sie den Teller auf die Bühne eines inversen Mikroskops mit Phasenkontrast-Optik ausgestattet. Beachten Zellen unter 40-facher Vergrößerung und beachten Sie die Vielfalt in der Morphologie. Viele Zellen sind Avocado-förmigen während andere lang und dünn sind. Die Anwesenheit von apikalen Haarbündel identifiziert sie als Haarzellen und Phase-Brightness sichert ihre Gesundheit. Mikrophotographien von isolierten Haarzellen sind in 5 gezeigt. </li></ol> 4. Patch-Clamp Zebrafisch Haarzellen <ol><li> In Vorbereitung für perforated patch Ableitungen 5,6, bereiten Amphotericin-haltigen interne Lösung wie folgt: Platz 5 mg Amphotericin B (Sigma A4888) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen füllen und mit 100 ul DMSO. Unmittelbar Wirbels diese Lösung für 10-20 Sekunden, bis das gesamte Amphotericin gelöst ist. Dann Pipette 625 ul K +-interne Lösung in eine zweite Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 10 ul der Amphotericin Lösung des K +-interne Lösung und Vortex wie oben. Die Aktie Amphotericin Lösung wird mehrere Stunden dauern, aber verwerfen die endgültige Lösung nach einer Stunde. </li><li> Fabrizieren Patch-Pipetten von BF 150-86-10 Borosilikatglas (Sutter Instruments) unter Verwendung eines mehrstufigen Ziehvorrichtung (Sutter P-1000). Pipetten sollte Durchmessern von etwa 2 um kippen haben und Resistenzen von 1-3 MOhm haben mit den Lösungen in der Tabelle 1. Die Einstellungen auf dem Abzieher, dass die Arbeit gut sind wie folgt: Heat = Rampe minus10, Pull = 0, Velocity = 18, Delay = 1, Druck = 600. Die Formdie Spitze einer Pipette gut ersichtlich aus der Fotografie in der eingesetzten c aus 5. Blunt &quot;bullet-shaped&quot; Pipetten werden bevorzugt, da sie am wenigsten Zugang Widerstand während elektrophysiologischen Ableitungen bieten. </li><li> Verwenden Sie eine 28 Gauge Microfil Spritzennadel (MF28G-5; World Precision Instruments), ein Aufnahme-Elektrode zur Hälfte füllen mit der Amphotericin-haltigen K +-interne Lösung. </li><li> Anbringen der Elektrode an das Headstage eines Patch-Clamp Verstärkers. Anwenden -10 mV, 10 ms Spannungsstufen bei 10 Hz und aufrechtzuerhalten Überdruck in der Elektrode, wie sie durch die Luft / Lösungs-Grenzfläche manövriert wird und nach unten auf den Boden der Aufnahme in der Nähe der Schale Zellen. </li><li> Positionieren Sie die Elektrode orthogonal zu einer gesund aussehende Zelle. Wenn die Elektrode nahe genug an der Zelle ist, so dass es sich von der abfließenden Lösung beginnt, schnell umkehren Druck, Anlegen eines geringen Vakuums an die Elektrode, bis die Zelle &quot;springt&quot; darauf. Sofort aufhören Sog auf the Elektrode und Auftragen Haltepotential von -70 mV auf der Innenseite der Elektrode. Innerhalb von ein paar Sekunden ein Gigaohm Dichtung bilden. </li><li> Beachten Sie die kapazitiven Stromspitzen bei Beginn und Beendigung der Spannung Schritte, die bald nach der Dichtung Bildung erscheinen. Weiterhin die Perforation der Membran unter der Elektrode durch die Amphotericin überwachen, indem beobachtete, wie die Transienten in der Größenordnung wachsen, um ihre maximale Größe (in ca. 10 Minuten). </li><li> Um die Ausarbeitung der whole-cell (perforiert)-Konfiguration in einer gesunden Zelle zu bestätigen, zu entlocken außen K + Ströme durch die Anwendung hyperpolarisierenden und depolarisierende Schritte Spannung. Die meisten Haarzellen haben prominente Auswärtsströme (siehe Abbildung 6). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 4 zeigt Bilder während der Schritte der Zellisolation entnommen. In Feld A können die Otolithen mit den lagenas, saccluli und Primordialschläuche assoziiert gesehen throu werdengh die dünne Schicht der Knochen, überlagert sie. Diese opake Strukturen bieten bequeme Landmarken in der sicheren Entfernung der Endorganen von dem Tier während der nachfolgenden Schritte der Zerlegung zu erleichtern. Panel B zeigt die &quot;Schüssel&quot; des Knochens, die intakten Labyrinthen und die prominenten Otolithen in den Primordialschläuche, lagenas und sacculi enthält. Panel C zeigt ein Labyrinth, das aus dem Knochen entfernt wurde. Man beachte die große otolith mit Wellenschliff in der Lagena die Eiszapfen-förmigen otolith im Sacculus und bohnenförmige otolith im utricle. Einige der Vielfalt in Größe und Morphologie in Zellen aus der Lagena isoliert gesehen ist in Abbildung 5 dargestellt. Eine gesunde Zelle ist leicht als Phase hell mit einem scharfen Rand identifiziert. Zellformen lassen sich grob in zwei Klassen eingeteilt werden: Avocado-förmig (avo) und lang und dünn (thn), obwohl die Größen der Zellen innerhalb jeder Gruppe können erheblich variieren (vgl. zB avo 1 und avo 3). Einschub zeigt einen Cluster vondrei Zellen, die nicht vollständig voneinander getrennt. Die schwarze Farbe und körniges Aussehen der Zelle in Einschub b leicht identifiziert diese Zelle tot ist. Einschub c zeigt die Spitze eines Patch-Pipette, die die geeignete Form und Dimensionen zum Aufzeichnen von diesen Zellen. Die aktuellen Spuren in 6 gezeigt wurden in Reaktion auf Hyperpolarisieren und depolarisierenden Stufen Potential auf einer Lagena Zelle ähnlich der avo 2 in 5 gezeigt auferlegt erhalten. Übliche Reaktionen in Zellen verschiedener Größen und Formen können sehr unterschiedlich hindeutet Vielfalt in dem Komplement von spannungsabhängigen Kanälen. Figuren 1-3: Cartoons Darstellung der Schritte in der Isolierung von Haarzellen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Abbildung 1. Entfernen des Schädels capsule mit den Innenohr Labyrinthe aus Zebrafisch. A. Geopfert Zebrafisch Dorsalseite Merken bis zu sezieren Gericht. B. Offenen Schädel, entfernen und entsorgen Gehirn. C. Beachten Otolithen in Primordialschläuche, lagenas und sacculi. D. Entfernen ventralen Teil des Schädels Kapsel die Labyrinthe. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Abbildung 2. Entfernen der Labyrinthe vom Schädel Kapsel. A. Knacken Sie neben Schädel Kapsel ihre Mittellinie. B. Entfernen Labyrinthe aus den Knochen. C. Entfernen Sie die Otolithen aus den lagenas und Primordialschläuche mit einer Pinzette. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Abbildung 3. Isolierung von Haarzellen von Labyrinthen. A. Heben Sie maculae mit einem Hund Haar. B. Verreiben Maculae mit zwei Hundehaare. C. Verwenden Sie isolierte Haarzellen für Patch-Clamp. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bilder während der Schritte bei der Isolierung von einzelnen Zellen aufgenommen. A. Nach Entfernen des Gehirns, die mit den beiden Otolithen lagenas und Sacculi (Pfeile) und Primordialschläuche (Pfeilspitzen) zugeordnet visualisiert werden kann. B. Nach Entfernung des ventralen Teil des Schädels, die die Kapsel Innenohr Organe des Tieres enthält. Die Karikatur in der rechten Hälfte des B identifiziert die Standorte der linken Utriculus, Lagena und Sacculus. Die gestrichelte Linie zeigt die ungefähre Position der linken Labyrinth. C. Rechts Labyrinth (Ansicht von medial) D: Cartoon Zeichnung wichtigsten Teile des Labyrinths in C. a: anterior halbkreisförmigen Kanal, b: horizontal Kanal, c: posterior Kanal, d: utrikulären otolith, e: saccular otolith, f: lagenal otolith. Maßstabsbalken in D repräsentiert 1 mm für die A und B, 0,5 mm für C und D. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Abbildung 5 Isoliert, gesunde Zellen von der Lagena, die die Vielfalt der Morphologie; avo:. Avocado geformten Zellen; thn: lange, dünne Zellen. Inset a: Cluster aus drei vollständig isolierten Zellen; Einschub b: tote Zelle; Einschub c: Spitze des Patch-Elektrode in elektrophysiologischen Ableitungen von Zebrafisch Haarzellen verwendet. Maßstab = 20 um gehört zu der Hauptfigur und allen Einsätzen. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Abbildung 6. Currents in einem Patch erfasst geklemmt Haarzelle. Gemittelten Antworten in einer Zelle (t ähnlicheo avo 2 in 5) zu drei Präsentationen von Spannungsstufen in 10 mV Schritten von -140 mV bis +70 mV von einem Haltepotential von -70 mV aufgetragen. Beachten Sie die Inaktivierung Strom, der bei mehr depolarisiert Potenziale erscheint. Spannungsstufe Größen werden neben einigen der Spuren gezeigt.

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea.">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li><li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish.">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sorgfältige Präparation der Endorgane und schonende Behandlung der Zellen ist entscheidend für die erfolgreiche Isolierung von gesunder, intakter und physiologisch aktive Haarzellen. Die Einhaltung der folgenden Tipps sollen Ihnen versichern Erfolg: <ol><li> Es ist einfacher, gesunde Zellen vor kleinere Fische (2-2,5 cm Länge) erhalten. Größere Fische haben viele weitere Fetttröpfchen, dass obskure Visualisierung während der Dissektion Prozess. </li><li> Vorsicht beim Entfernen der Otolithen, die die Haarzellen überlagern werden. Berühren Sie die Zellen, wenn packte die Otolithen mit einer Pinzette. </li><li> Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Maculae und cupulae ausgeschaltet werden als Bleche und die Zellen aus dem Epithel verrieben abgehoben. </li><li> Wir finden die Verwendung eines Hundehaare um Zellen verreiben überlegen zu sein anderer Methoden, einschließlich der Verwendung von menschlichen Wimpern 7, die nicht so verjüngt und weniger flexibel. </li><li> Während Patch-Clamp, Anwendung von Überdruck auf tEr Elektrode, wie sie durch die Luft / Lösung Schnittstelle ist wichtig, dass die Spitze sauber läuft. Die Freisetzung des Überdrucks an die Zelle ermöglichen, zu &quot;springen&quot; auf die Elektrode ist ebenfalls wichtig. Diese Methode löscht ein kleines Volumen von Amphotericin-haltigen Lösung entfernt von der Spitze, wodurch die Wahrscheinlichkeit zur Bildung einer Abdichtung mit dem Gigaohm Zelle. In unseren Experimenten verwenden wir die perforierten Patch Aufnahmetechnik anstelle der traditionellen whole-cell-Konfiguration wegen der Fragilität der Zellen. Versuch &quot;go Ganzzell&quot; führt oft zum Verlust der Gigaohm Dichtung. </li></ol> Die hier beschriebene Methode erbringt Hunderte von gesundem Haar Zellen pro Tier. Die Technik kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung über einem Binokular. Ein früherer Bericht in JoVE beschreibt die Präparation des Innenohrs im Zebrafisch mit einem ventralen Zugang 8. Diese Autoren zeigen die dissektion von ganzen, Paraformaldehyd-fixierten Innenohr Organe. Wir ermutigen die Leser dieses Video zum Vergleich mit unseren Methoden zu beobachten. Ein Vorteil der hier vorgestellten Verfahren ist die Gewinnung von lebenden Zellen nützlich für physiologische Untersuchungen. Neben ihrer Verwendung bei der Patch-Clamp-Experimente, um die spannungsgesteuerte Kanäle studieren (wie hier gezeigt) die Verwendung dieser Zellen erweitert werden zu Zelle Resonanz 9,10, Monitor Neurotransmitterfreisetzung indem Kapazitätsmessungen 11,12 untersuchen kann, ob Neuromodulation induziert durch die Aktivierung von Liganden gesteuerte Kanäle 13 sowie erschließen die Fülle der Informationen, die aus Verwendung von Mutanten, die sowohl Hör-und Gleichgewichtsstörungen 14 beeinflussen entnommen werden kann.

<table border="1"><tbody><tr><td> Lösungsname </td><td> Rezept </td></tr><tr><td> (A) NZR (Normal Zebrafisch Ringer) (in mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 3 Glucose, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + Tricaine </td><td> NZR + 0,02% 3-Aminobenzoesäure-ethylester Methansulfonat (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) + BSA NZR </td><td> NZR + 0,4% Rinderserumalbumin (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Low Ca 2 +-Lösung) (in mM) </td><td> 100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl 2, 0,05 MgCl 2, 3 Glucose, 30 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) Locas + Papain </td><td> Locas + 0,05% L-Cystein (Sigma C1276) + 0,2% Papain (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-interne Lösung (in mM) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7,3. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Solutions.

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

Patch-Clamp-Analyse der spannungsabhängigen Kanälen in sensorischer Haarzellen aus einer Vielzahl von Arten isoliert wurden zuvor beschrieben 1-4 aber das Video stellt die erste Anwendung dieser Techniken Haarzellen von Zebrafisch. Hier zeigen wir, ein Verfahren auf gesunder, intakter Haarzellen aus allen Innenohr Endorganen isolieren: Sacculus, Lagena, Utriculus und Bogengänge. Darüber hinaus zeigen wir die Vielfalt im Haar Zellgröße und Morphologie und geben Sie ein Beispiel für die Art von Patch-Clamp-Aufnahmen, die erhalten werden können. Der Vorteil der Verwendung dieser Zebrafischmodell Systems gegenüber anderen resultiert aus der Verfügbarkeit von Zebrafisch-Mutanten, die sowohl Gehör und Gleichgewicht beeinflussen. In Kombination mit dem Einsatz von transgenen Linien und andere Techniken, die genetische Analyse und Manipulation der Zelle isoliert und elektrophysiologische Methoden nutzen hier vorgestellten sollten einen besseren Einblick in die Rollen Haarzellen p erleichternlag in der Vermittlung dieser sensorischen Modalitäten.

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Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Der Zweck dieses Videos ist es, Verfahren zur Gewinnung von gesunden, intakten Haarzellen aus den Innenohr Organe ausgewachsener Zebrafisch und dann mit ihnen für Patch-Clamp-Untersuchungen zur Charakterisierung der biophysikalischen Eigenschaften ihrer spannungsabhängigen Kanälen ausgerichtet demonstrieren.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Aufrufe.  Pepperdine University. Der Zweck dieses Videos ist es, Verfahren zur Gewinnung von gesunden, intakten Haarzellen aus den Innenohr Organe ausgewachsener Zebrafisch und dann mit ihnen für Patch-Clamp-Untersuchungen zur Charakterisierung der biophysikalischen Eigenschaften ihrer spannungsabhängigen Kanälen ausgerichtet demonstrieren.

Serie: Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...