Wir erkennen an, Julie Heward für die Hilfe bei der Vorbereitung der hNSCs und Lavaniya Thanabalasundaram für ihre technische Unterstützung mit HeLa Züchtung und Transfektion.

1. HNSC Differenzierung Dreidimensional (3D) Kultur HINWEIS: Trennen Sie und leiten hNSCs, aus ethischer genehmigt Gewebe, in einer früheren Veröffentlichung 2 beschrieben. Bitte beachten Sie die ethischen und institutionellen Richtlinien während des folgenden Verfahrens. 1.1) 3D Culture Mit 12-Well-Platte <ol><li> Verwenden Sie aseptische Technik während des gesamten Verfahrens. In einer biologischen Sicherheitswerkbank, die mit Wasser bewässert (WFIR) rehydratisieren Gerüste durch Zugabe von 2 ml / Vertiefung von 70% Ethanol hergestellt. Berühren Sie nicht die Gerüste durch den Verzicht auf die 70% Ethanol auf der Wand jedes gut. </li><li> Die 70% Ethanol vorsichtig absaugen und sofort abwaschen die Gerüste mit 2 ml / Vertiefung DMEM: F12 für 1 min. Zweimal wiederholen den Waschvorgang. Sorgfältig absaugen DMEM: F12 nach dem letzten Waschen. </li><li> Coat Gerüste durch Zugabe von 2 ml / Vertiefung von Laminin (10 ug / ml) in DMEM: F12. Inkubieren Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Brummenidified Inkubator für ein Minimum von 2 Stunden. Waschplatte mit warmem DMEM: F12. </li><li> Saatgut jedes Gerüst mit etwa 500.000 hNSCs in einem Volumen von 150 ul RMM + GF. </li><li> Inkubiere die Platte für 3 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator, sodass die Zellen, in die Gerüste zu regeln. </li><li> Fügen Sie 3,5 ml RMM in jede Vertiefung kümmert sich nicht um Zellen von Gerüsten zu entfernen. </li><li> Inkubieren der Platte für 7 Tage; ersetzen RMM Medium (3,5 ml / Vertiefung) nach 1 Tag (erste Fütterung) und wieder nach 2-3 Tagen aus der ersten Fütterung. </li><li> Nach 7 Tagen entfernen Medium und fixieren die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für Immunzytochemie (ICC) oder fügen Sie 500 ul / Vertiefung Lysereagenz für Gesamt-RNA-Extraktion (store Platte bei ≤ -80 ° C oder fahren Sie mit der Gesamt-RNA-Extraktion) . </li></ol> 1.2) Messung der Axon-Prozess Auswuchs <ol><li> Fleck 4% PFA fixiert differenzierte hNSCs nach einer Standard-ICC-Protokoll 20 mit β3-Tubulin (TUBB3) mit einem Fluorochrom konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen primären Antikörper. Gegenfärbung Zellkerne mit Hoechst (1 uM). </li><li> Erfassung repräsentativer Bilder von β3-Tubulin-gefärbten Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops; Bilder als TIFF- oder JPEG speichern. Maß für Axon Prozess Auswuchs mit einem Software-Messinstrument (zB Image-Pro Plus). </li><li> Öffnen Sie das Bild, wählen Sie die Option Messungen in der Werkzeugleiste und wählen Sie Trace-Funktion. </li><li> Um den Trace zu starten, wählen Sie den Startpunkt auf dem Axon Auswuchs, indem Sie die Maustaste los. Spur entlang der gesamten Länge des Axon-Auswuchs; der rechten Maustaste, um jede Spur zu beenden. Wiederholen Sie alle Axon outgrowthswith in das Blickfeld zu messen. </li><li> Express-Messungen als Pixel oder um (ausstehende Kalibrierung einrichten). Export Längenmessungen in ein Tabellenkalkulationsprogramm für die Proben vergleichende und statistische Analyse. </li></ol> 2. miRNA-Expressions Verwenden einer Stammzellen undEntwicklungswege Focused miRNA PCR Array 2.1) miRNA Gesamt-RNA-Extraktion <ol><li> Führen miRNA Extraktion auf Gerüsten und 2D gewachsen Proben (differenzierte und undifferenzierte, HNSC Steuerung). </li><li> Tau-Gerüste, in einem 12-Well-Platte eingesetzt wird, falls erforderlich. Kombinieren Lysereagenz Inhalt (500 ul) von 2 Vertiefungen in der gleichen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Endvolumen 1 ml Lysis-Reagens. Darauf achten, dass das Gerüst in der gut zu verlassen. </li><li> Für zuvor gesammelten als Trockenzellenpelle 2D gewachsen Proben (differenzierte HNSC 2D Kulturen und undifferenzierte Steuer) 1 ml Lyse-Reagenz und Inhalt in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Homogenisieren Sie jede Probe mit einer 1-ml-Spritze und eine kurze 20 bis 25 Gauge-Nadel. Führen Sie das Lysat durch die Nadel mit einer 1 ml Spritze bis zu 5 Mal, bis ein homogenes Lysat erreicht. </li><li> Fügen Sie 200 ul Chloroform zu jedem Eppendorf-Röhrchen und Kappe fest. Umkehren und Wirbelrohre zummischen Inhalten. </li><li> Zentrifuge je 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das Homogenat 15 Minuten lang bei ≥12,000 x g. </li><li> Wird die obere wässrige Phase von jeder Probe (zur Vermeidung der Übertragung jedes der Interrosafarbene Flüssigkeit) in ein frisches 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 750 &amp; mgr; l 100% Ethanol. Gründlich mischen durch Umdrehen. </li><li> Pipettieren von bis zu 700 &amp; mgr; l jeder Testprobe, einschließlich der Niederschlag, der in einen Mini-Säule in ein 2-ml-Collection-Tube. Schließen des Deckels und Zentrifuge bei ≥8,000 xg für etwa 30 sec bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen dieser Schritt unter Verwendung der Rest der Probe. </li><li> Durchführen einer DNA-Digest für 15 min. </li><li> Fügen Sie 700 ul Puffer RWT an den Mini-Säule und zentrifugieren Sie für ca. 30 Sekunden bei ≥8,000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l Puffer RPE und Zentrifugation für etwa 30 Sekunden bei ≥8,000 x g waschen Mini Spalte. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen wash.Centrifuge bei ≥12,000 · g für 1 min, um die Membran weiter zu trocknen. </li><li> Eluieren Gesamt-RNA in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen durch Zugabe von 40 &amp; mgr; l RNase-freies Wasser auf die Mini-Säule und Zentrifugieren für 1 min bei ≥8,000 x g. Messen Sie die Gesamt-RNA-Konzentration mit Hilfe eines geeigneten Spektralphotometer. </li></ol> 2.2) miRNA cDNA Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die Reverse-Transkriptase-Master-Mix. Jede Probe erfordert 4 ul 5x miScript HiSpec Puffer, 2 ul 10x nucleics Mix miScript 2 ul-Reverse-Transkriptase-Mix. </li><li> Aliquoten 8 ul der Master-Mix in einem PCR-Röhrchen, fügen erforderliche Volumen von Gesamt-RNA (250 ng), und fügen Sie RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 ul. </li><li> Inkubieren für 60 min bei 37 ° C.Incubate für 5 min bei 95 ° C bis miScript Reverse Transcriptase-Mischung zu inaktivieren. </li><li> Fügen Sie 200 ul RNase-freies Wasser zu je 20 ul Reverse-Transkriptions-Reaktion, bei -20 ° C, oder fahren Sie mit Echt timich sofort PCR. </li></ol> 2.3) Stammzellen und Entwicklungswege Focused miRNA PCR Array <ol><li> Die PCR-Komponenten-Mix in einem 15-ml-Röhrchen durch Zugabe von 1375 ul 2x SYBR Green Master Mix, 100 ul miRNA cDNA-Präparation, 275 ul von 10x miScript Universalgrundierung, und 1000 ul RNase-freies Wasser (Gesamtvolumen 2750 ul). </li><li> Übertragen PCR-Komponenten-Mix auf einem PCR-Ladebehälter. Die Platte mit 96 Vertiefungen PCR-Array aus der versiegelten Beutel vorsichtig entfernen. </li><li> In 25 ul PCR-Komponenten Mischung in jede Vertiefung der PCR-Array mit einem 8-Kanal-Pipette oder ein 12-Kanal-Pipette mit nur 8 Tipps. Ändern Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt um eine Kreuzkontamination zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. </li><li> Dichtungsplatte mit optischer Klebefolie und zentrifugieren für 1 min bei 1000 xg bei Raumtemperatur (15-25 ° C), um Luftblasen zu entfernen. Sichtprüfung der Platte von unten, um sicherzustellen, keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden sind. </li><li> Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen PCR-Array in der Echtzeit-Cycler. </li><li> Programmieren Sie die Echtzeit-Cycler entsprechend: 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 min und 45 Zyklen für 15 Sekunden bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C einen einheitlichen (Fluoreszenz-Datenerfassung). </li><li> Exportieren Sie die Ct-Werte für alle Vertiefungen auf eine leere Excel-Tabelle für die Verwendung mit PCR-Array Datenanalyse Vorlage Excel und Web-basierte Software. HINWEIS: Software ist verfügbar <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Computergestützte Analyse für miRNA Ziel Vorhersage und Validierung von Ziel mRNAs durch Reporter Plasmid Transfektions und Ddual Luciferase Assay. 3.1) Computergestützte Analyse für miRNA Ziel Prediction <ol><li> Durchsuchen PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, online verfügbar Algorithmus zur Identifizierung von miRNA Ziel Vorhersage mRNAs. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Klicken Sie hier, PicTar Vorhersage von Wirbeltieren&quot;. Eine neue Seite wird geöffnet. </li><li> In der neuen Seite, PicTar Web-Interface, wählen Arten in dem Dropdown-Menü und legen miRNA von Interesse in der miRNA-ID ein. Klicken Sie auf der Suche nach Zielen eines miRNA. </li><li> Beachten Sie die Liste der Ziel-mRNAs durch aPicTar Punktzahl rangiert. HINWEIS: PicTar berechnet eine Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein gegebenes UTR durch die ausgewählte miRNA richtet werden, und basierend auf Saatgut Komplementarität Thermodynamik und einer kombi Vorhersage für übliche Ziele in Sätzen von coexprimiert miRNAs 22. </li><li> Verwendung DIANA-LAB (Ähnlich abrufen Liste der Ziel-mRNAs <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23 und Targetscan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24. Alternative online verfügbar Algorithmen. </li><li> Erstellen Sie eine Vergleichstabelle der miRNAs Basis Ranking unter Verwendung von verschiedenen Software-Tools. PicTar rangiert nach Punkten, DianaLab durch Präzision (basierend auf den Signal-Rauschabstand und einem Präzisions-Score zur Beurteilung der Bedeutung der erwarteten Ergebnisse) und Targetscan von aggregierten PCT (basierend auf Saatgut Komplementarität, thermodynamischen freien Bindungsenergie, die Erhaltung über verschiedene Arten), siehe Tabelle 1. </li></ol> 3.2) Validierung von Ziel mRNAs durch Reporter Plasmid Transfektions-und Dual-Luciferase Assay. HINWEIS: 3&#39;UTR Luciferase Reporter für die Validierung der Ziel-mRNA wurde zuvor beschrieben 25. <ol><li> Transfektion <ol><li> Seed HeLa-Zellen bei einer Dichte von 10 5 Zellen / Well in 24-Well-Platte. </li><li> Nach 24 Stunden, Co-Transfektion von HeLa-Zellen mit 1,5 ul Transfektionsreagenz und entweder 100 ng NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39;-UTR-Plasmid sowie 20 nM miRNA imitiert (hsa-miR-96-5p für SOX5 3217; UTR und hsa-miR-7-5p und hsa-miR-17-5p für NR4A3 3&#39;UTR beziehungsweise) pro Vertiefung. </li><li> Co-Transfektion von Kontrollvertiefungen mit NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmid und Fluorochrom markiert Negativkontrolle siRNAs. Die Transfektion von Kontrollvertiefungen mit Fluorochrom markiert Negativkontrolle siRNAs ermöglicht Auswertung der Transfektionseffizienz und macht Mimik miRNA 3&#39;UTR bind Spezifität. </li></ol></li><li> Die Messung der Dual-Luciferase-Aktivitäten <ol><li> Messen Sie Firefly und Renilla-Luciferase-Aktivitäten 24 h nach der Transfektion. Entfernen Zellwachstumsmedium. </li><li> Bereiten Sie Arbeitslösung I durch Zugabe von 50 ul Substrat I in 10 ml Lösung I; gründlich mischen. Fügen Sie 300 ul der Arbeitslösung I in jedes 24-Loch. </li><li> Übertragen Sie den Inhalt jeder 24 gut in 3 Wells einer 96 weiße Platte wurden 100 ul jeder. Warten Sie 10 min und messen Firefly Luziferase in Luminometer Set für Lumineszenz Erwerb. </li><li> Bereiten Sie Arbeits solutIonen II durch Zugabe von 50 ul Substrat II in 10 ml Lösung II; gründlich mischen. 100 l Arbeitslösung I in jedes 96-Loch bereits 100 ul der Arbeitslösung, die I. </li><li> Warten Sie 10 min und messen Renilla-Luciferase in Luminometer Set für Lumineszenz Erwerb. Berechnen des Verhältnisses der Lumineszenz von der Firefly-Luciferase, um die Renilla-Luziferase. </li></ol></li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

Alle Autoren sind Mitarbeiter, Lager und / oder Aktienoptionsinhaber in ReNeuron AG oder ihre Muttergesellschaft. Diese Studie wurde von ReNeuron (RENE.L) unterstützt.

Die Entwicklung neuer in vitro-Tests zur Bewertung und Verbesserung der Differenzierung von Stammzellen ist seit jeher für die Untersuchung ihrer Funktionen und therapeutische Fähigkeiten eine Herausforderung. Langfristige und stabile Befestigung hNSCs, für die Entwicklung eines robusten 3D in vitro Differenzierungstest erforderlich ist, wurde durch Testen mehrerer 3D-Substrate mit verschiedenen Eigenschaften in der Bezeichnung von Materialien und Strukturen gerichtet. Im Rahmen der Assay-Entwicklung haben wir ebenfalls bewertet optimale Zellaussaat Konzentration und identifiziert die Anforderung für die Gerüste an Laminin beschichtet werden. Obwohl unsere hNSCs kann spontan bei differen 4-OHT und Wachstumsfaktor Entfernung, die Durchführung einer 3D-Kultursystem zeigte eine signifikante Verbesserung in ihrer Differenzierungsfähigkeit wie durch Axon-Auswuchs Verfahren gemessen im Vergleich zu Standard-2D-differen hNSCs. Um die Wirkung der 3D-induzierten differe untersuchenntiation auf HNSC miRNA-Expression verwendeten wir eine PCR-Array. Im Vergleich zu Standard-Chip-Microarray-PCR-Array bietet die Vorteile einer direkten Quantifizierung und Validierung der miRNA von Interesse. Obwohl das PCR-Array wird im Ausdruck der Gesamtzahl der miRNA pro Array, beispielsweise in hier weniger als 96 beschränkt, es kann so zugeschnitten werden, umfassen spezifisch miRNAs von Interesse, in unserem Fall bereits in der Stammzellentwicklung berichtet. Die Expression des Weges fokussiert miRNAs wurde in 3D- und 2D-differen hNSCs Profil verglichen mit undifferenzierten hNSCs. Die signifikant herunterreguliert miRNAs wurden ausgewählt und analysiert, um ihre mutmaßlichen Ziel-mRNAs mit der Absicht der Bestimmung ihrer Funktionalität und biologische Interpretation mit Online-Algorithmen (DIANA Lab PicTar und TargetScans) beurteilen. Eine einzelne miRNA kann Hunderte von Zielen erkannt und aus diesem Grund haben wir überprüft miRNA Interaktionen mit 3&#39;UTR mRNAsthat können geeignete Kandidaten in einem seinxonal Regulierung. NR4A3, ein Ziel der hsa-miR-7 und miR-17-Familie, ist ein Mitglied der Familie NR4A Kernrezeptoren, die, je nach dem Grad des Ausdrucks, in der Differenzierung, Überleben, Apoptose und Regulierung der Hippocampus beteiligt Axon Führung 26. Ähnlich SOX5, ein Ziel von HSA-miR-96, wird berichtet, dass der Zellzyklusprogression in der neuralen Vorläuferzellen 27 Axonlänge 28, Migration, Differenzierung nach der Migration, und die Vorsprünge von Neuronen 29 steuern. Sowohl SOX5 und NR4A3 wurden als direkte Ziel-mRNA von hsa-miR-96 hsa-miR-7 und 17 jeweils durch Dual-Luciferase-Reporter-Assays identifiziert werden, und. Dual-Luciferase (Firefly und Renilla) stützt sich auf zwei verschiedenen Reportergenen in demselben Plasmid und bietet ein verbessertes System ermöglicht Normalisierung für Auswirkungen durch suboptimale Transfektion und zytotoxische Wirkung gegenüber einer einzigen Luciferase-Plasmid-System verursacht. Im Rahmen unseres Assay-Entwicklung wir auch unsere Transfektion conditi optimiertons, um einen hohen Wirkungsgrad zu erzielen. Die protocolsdescribed hier kann genutzt werden, um weiter zu optimieren und zu charakterisieren, in vitro Differenzierung HNSC die für präklinische Studien und zukünftige klinische Anwendungen implementiert werden können intransplantation Protokolle.

Stammzellforschung spielt eine zentrale Rolle in der regenerativen Medizin, die auch umfasst die Disziplinen des Tissue Engineering, Entwicklungs Zellbiologie, Zelltherapeutika, Gentherapie und Biomaterialien (Gerüsten und Matrizen). Stammzellen sind in beiden Organ Entwicklungund Gewebereparatur wichtig; zu verstehen, wie Stammzellen funktionieren ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung neuer Stammzell-basierten Behandlungen ein. CTX0E03 ist eine klonale, konditional immortalisierten humanen neuralen Stammzellen (HNSC) Linie 2 vom ersten Trimester menschlichen fetalen Kortex isoliert. CTX0E03 hat Qualitätsmerkmale, die für die klinische Zellbank unter guten Herstellungspraxis (GMP) 3 definiert. HNSCs kann spontan in Nervenzellen, Gliazellen und Oligodendrozyten differenzieren und haben sich als neurologische Defizite zu verbessern, wenn in einem Nagetiermodell der fokalen Ischämie 2,4,5 transplantiert. Die CTX0E03 hNSCs sind derzeit in klinischen Studien für Schlaganfall Behindekeit (NCT01151124 6 und NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNAs eine durchschnittliche 22 Nukleotide lang und regulatorische Moleküle 7 bewiesen, sie kodieren Proteine, sondern binden 3 Prime-untranslatierten Region (3&#39;-UTR) von mRNAs, die Regulierung ihrer Stabilität und Übersetzung in Proteine. MiRNAs sind bekannt, die zur Regelung einer Anzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Entwicklung, Proliferation und Differenzierung 8 teilzunehmen. Mehrere miRNAs sind bei der Regulierung des Schicksals und Spezifikation von neuralen Stammzellen 9 in Verbindung gebracht. In zweidimensionalen (2D) Standardkulturumgebung der Komplexität der in vivo-Umgebung nicht übereinstimmen und folglich der Induktion und Regulation der Differenzierung HNSC nicht optimal ist. In vivo werden die Zellen durch eine dreidimensionale (3D) Mikroumgebung von anderen zusammen umgeben Zellen und extrazellulärer Liganden, darunter auch vieleTypen von Kollagenen, Laminin und andere Matrixproteine ​​(der extrazellulären Matrix, ECM). Frühere Studien haben berichtet, dass die architektonischen Topographie der Materialien nachahmt ECMs und deren Geometrie beeinflusst Zellphänotyps und Verbleib 10-15. Eine Anzahl von im Handel erhältlichen 3D Gerüste zur Verfügung stehen; Wir verwendeten ein hochporöses Polystyrol-Gerüst mit einer gut definierten und einheitlichen Architektur entworfen in eine 200 um dicke Membran, die ein 3D-Raum in die Zellen eindringen können und differen 16-18 liefert. Hierin 2D- und 3D-Differenzierungsassays werden zur axonprocess Auswuchs zu bewerten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um die miRNA-Expression einer klinischen Grade HNSC Linie Profil zu miRNA Auswirkungen auf die Differenzierung weiter zu untersuchen. Die Methoden hier dargestellt sind auf die, die ursprünglich in 19 beschrieben basiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

Neurale Stammzellen (NSCs) sind in der Lage, Selbsterneuerung und Differenzierung in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten unter spezifischen lokalen Mikroumgebungen. Im hier präsentieren wir eine Reihe von für die dreidimensionale (3D) Differenzierung und miRNA-Analyse einer klonalen humanen neuralen Stammzellen (HNSC) Linie derzeit in klinischen Studien für Schlaganfall Behinderung (NCT01151124 und NCT02117635, Clinicaltrials.gov) verwendet, Methoden. HNSCs wurden aus ethischer genehmigten ersten Trimester menschlichen fetalen Kortex abgeleitet und Verwendung von retroviralen Integration einer einzigen Kopie der c-mycER TAM konstruieren bedingt verewigt. Wir beschreiben, wie Axon Prozess Auswuchs hNSCs auf 3D-Gerüsten und wie man damit verbundenen Änderungen der miRNA-Expression mit Hilfe der PCR-Array zu quantifizieren differenziert messen. Außerdem veranschaulichen wir Computeranalyse mit dem Ziel, die Auswahl miRNA mutmaßlichen Ziele. SOX5 und NR4A3 wurden als geeignet miRNA vermeintlichen Ziel deutlich ausgewählt identifiziert herunterregulierend miRNAs in differenzierten HNSC. MiRNA-Target-Validierung wurde am SOX5 und NR4A3 3&#39;UTRs von Dual-Reporter-Plasmid-Transfektion und Dual-Luciferase-Assay durchgeführt.

In Abbildung 1 ist die Untersuchung und Quantifizierung von HNSC Differenzierung auf 3D-Gerüsten im Vergleich zu herkömmlichen flachen Oberfläche Kulturen (2D) visualisiert und expressedas Axons Prozess Auswuchs Messungen. In Abbildung 2 ist representedthe Workflow und die Ergebnisse für die miRNA-Quantifizierung mit Stammzellen und Entwicklungswege konzentriert miRNA PCR-Array unterschiedliche Expression von miRNAs in 2D und 3D differenzierte hNSCs Vergleich zu undifferenzierten Kontrolle zu untersuchen. Nach miRNA vergleichende Analyse zwischen differenzierte und undifferenzierte hNSCs und Computeranalyse zur Zielvorhersage, SOX5 und NR4A3 (NOR1) wurden als vermeintliche Ziel-mRNAs identifiziert. Um die direkte Interaktion zwischen den miRNAs und deren vermeintlichen Ort auf der mRNA 3&#39;UTR verwendeten wir zwei im Handel erhältlichen Plasmiden, die entweder SOX5 oder NR4A3 3&#39;UTR-Sequenz eingefügt hinter der Glühwürmchen-Luciferase-Reportergens, studieren ein<html> nd in einem gemeinsamen Plasmid Renilla-Luciferase-Gen für die Normierung. Die repräsentativen Ergebnisse der 3 &#39;UTR Luciferaseaktivität Herunterregulierung ist in Abbildung 3 dargestellt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Abb. 1: Die Differenzierung der hNSCs auf 3D-Gerüste, und die Bewertung von Axons Prozess es Auswuchs (A) Im Anschluss an Standard-ICC-Färbung für β3-Tubulin (grün) und Kerne mit Hoechst (blau) repräsentative Mikrogegengefärbt wurden erworben und Messung von Prozessen gab Axon mit Hilfe einer Bildanalyse-Software durchgeführt. (B) Diagramme die Berichterstattung über die Messung des Axons Prozess Auswuchs in 2D und 3D unterschieden hNSCs 1 (1W) oder 3 Wochen (3W) durchgeführt.com / files / ftp_upload / 52.410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Abb. 2: Schematische Workflow von miRNA-Profiling in differenzierten hNSCs Gesamt-RNA, einschließlich miRNAs wurde von beiden differenzierten hNSCs auf 3D-Gerüsten und Standard-2D-Kulturen oder undifferenzierte Steuer extrahiert. 250 ng Gesamt-RNA wurden retro transkribiert mit einer Methode, die die selektive Umwandlung von reifen miRNAs in cDNA für miRNA Quantifizierung mit menschlichen Zelldifferenzierung und Entwicklung miScript miRNA PCR-Array ermöglicht. Die geo-Mittelwert SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A und RNU6-2 wurde zur Datenanalyse auf der Basis der 2 -ΔΔct Methode verwendet. Wesentliche Veränderungen wurden als +/- 1,5 fache nach oben und unten Regelung auf eine sta definierttistically erheblichem Maße. Die Daten wurden mittels web-basierte Software verfügbar Die Ergebnisse sind als clustergram ausgedrückt analysiert. Geändert von 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Abbildung 3: Validierung von miRNA Ziel prognostiziert mRNA mit einem Dual-Luciferase-Assay-Bericht. (A) Vertreter Diagramm eines Dual-Luciferase-Reporter-Plasmid als Werkzeug benutzt, um 3&#39;-UTR-Sequenz als direktes Ziel einer miRNA validieren. (B) Vertreter mikroskopische Aufnahme, die Transfektionseffizienz. (C) &#160; Signale, ausgedrückt in relativen Luciferase-Aktivität, aus menschlichem 3 &amp; #39; UTR Reportern ofSOX5 und NR4A3 Gene signifikant niedergeschlagen in Gegenwart von hsa-miR-96 und hsa-miR-7 und 17 miRNA imitiert auf. Geändert von 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> Targetscan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Zielgens </td><td> Zielorte / Gene gefunden </td><td> Genauigkeit </td><td> Ergebnis </td><td> Aggregate P CT </td></tr><tr><td> hsa-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6,74 </td> &lt;td&gt; 0,94 </td></tr><tr><td> hsa-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4,75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> hsa-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0,17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; hsa-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5,87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5,38 </td><td> 0,63 + 0,37 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Liste der miRNA Ziel Vorhersage mRNAs. Vertreter Tabelle von miRNAs, Zielvorhersage Gene und Algorithmen-Analyse (vorherzusagenion / Partitur / Aggregat versehen mit Diana Lab, PicTar und Targetscan beziehungsweise). Geändert aus der Tabelle 3 19.

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Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K Aufrufe.  ReNeuron. With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Serie: Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Differenzierung der SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zelllinie

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Zika-Virus-Infektion der kultivierten menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen für Immunocytochemical Analyse

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...