We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).

1. Allgemeine Überlegungen <ol><li> Siehe Tabelle der Werkstoffe / Ausrüstung für eine Liste der notwendigen Reagenzien. Führen Sie alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen. </li><li> Verwenden hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (hiFBS) für alle Medien Zubereitungen, die FBS enthalten. Zu erwärmen-Inaktivierung bei 56 ° C für 30 min ein 50 ml Aliquot von FBS erwärmen, alle 10 min invertierenden (siehe auch Tabelle 1). Hinweis: Wenn FBS ohne Hitzeinaktivierung verwendet wird, die epithelial-ähnlichen Phänotyp schneller ganzen Kulturen von SH-SY5Y-Zellen fortschreitet. </li><li> Vor dem Gebrauch, um die Medien in einem Inkubator zu wärmen und Gleichgewicht vor jedem Schritt eine richtige pH-Gleichgewicht zu schaffen. Beispielsweise 50 ml Medium dauert etwa eine Stunde vollständig äquilibrieren (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2). Hinweis: Dieses Protokoll verwendet ein zweistufiges Verfahren, das teilweise Aufspaltung differenzierten SH-SY5Y-Zellen benötigt werden mit Trypsin behandelt und erneut plattiert. Dies ist eine stressigeVerfahren für diese außerordentlich zerbrechlich Zellen. Daher ist es wichtig, die Zellen in Trypsin für eine minimale Zeitdauer inkubiert. Dies wird für die bevorzugte Abheben von Neuronen, so dass epithelial-ähnlichen Zellen noch an der Schale befestigt ermöglichen. </li><li> Führen Verreiben von differenzierten Zellen langsam mit einer 10 ml Kunststoffpipette mit der Spitze gegen den Boden des konischen Rohrs mit den Zellen. Führen Verreiben mit einer langsamen Geschwindigkeit, nach oben und unten nicht mehr als das Fünffache. </li></ol> 2. Durchgang von SH-SY5Y Wartung Kulturen <ol><li> Split Wartung Kulturen, wenn die Zellen 70-80% Konfluenz erreicht haben, und nicht mehr als 10 bis 15 Passagen. Kulturen müssen in der Regel alle 3-5 Tage passagiert werden (vorausgesetzt, Kulturen werden nicht mehr als 5-fach beim Spalten verwässert). </li><li> Um Durchgang Zellen aus einem T-75-Kolben, absaugen Medien ab, dann mit ca. 10 ml 1x PBS spülen. Hinweis: Wir empfehlen nicht, die SH-SY5Y Wartung Kulturen fu Aufspaltungeitere als 1: 5 während der Passagierung da dies die Zellen verursachen aufgrund der niedrigen Konfluenz zu sterben. </li><li> Absaugen PBS, und fügen Sie 2,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA (1x). </li><li> Inkubieren in Inkubator 2-3 min und Spitze sanft Zellen von der Oberfläche des Kolbens freizugeben. </li><li> In 10 ml Basiswachstumsmedien (siehe Tabelle 2) und verreiben 1-2 mal. </li><li> Spin down für 2 min bei 1000 · g, absaugen Medien, dann Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien. </li><li> Verdünnen Zellen von 1: 3 bis 1: 5 in einem Gesamtvolumen von 20 ml für normale Beschichtung in T-75-Kolben, oder zählen und Platte für Differenzierung (Kapitel 5). </li></ol> 3. Einfrieren SH-SY5Y-Zellen <ol><li> Einfrieren frühen Passagen von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen in Basic Wachstumsmedien, ergänzt mit 5% (v / v) DMSO. </li><li> Zunächst einfrieren Aliquots bei -80 ° C für 24 Stunden, dann Transfer zum flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung. Hinweis: Als Referenz wurde ein konfluenter (75-85%) T-75-Kolben wird fünf Ausbeute1 ml Aliquots von SH-SY5Y-Zellen zum Einfrieren. Jeder dieser Teilmengen sollten überall 2-5 Millionen Zellen insgesamt enthalten. </li></ol> 4. auftauen und Kultur Undifferenzierte SH-SY5Y Neuroblastomzellen <ol><li> Bereiten Grundwachstumsmedien. </li><li> Auftauen schnell gefrorenen Zellen in einem 37 ° C Wasserbad (ca. 2 min). </li><li> Die Zellen in 9 ml Grundwachstumsmedien in einem 15 ml konischen Röhrchen, und dann 2 min bei 1.000 x g zentrifugiert. </li><li> Saugen Sie den Überstand, während man aufpassen, nicht die pelletierten Zellen zu stören, und sanft resuspendieren Zellen in 10 ml Basiswachstumsmedien. </li><li> Platte Zellen auf einem T-25-Kolben oder 60 mm 2 Gericht. </li><li> Am nächsten Tag ersetzen Medien toten Zellen zu entfernen. </li></ol> 5. Tag 0: Plating Cells für Differenzierung <ol><li> Siehe Abbildung 1 für die Differenzierung Zeitplan. </li><li> Spülen undifferenzierten Zellen mit 1x PBS, absaugen und dann trypsinize mit 1-2 ml erwärmt1x 0,05% Trypsin-EDTA. </li><li> Wenn Zellen in Trypsin sind, für ca. 3 min in einem Inkubator inkubiert. </li><li> Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 10 ml Basiswachstumsmedien, spülen Sie die Seiten der Flasche oder Schale, und verreiben sanft 1-3 mal. Übertragen Inhalt in einen 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge für 2 min bei 1000 · g, und die Medien anzusaugen, während man aufpassen, nicht das Pellet zu stören. </li><li> Pellet in 5 ml Basiswachstumsmedien und verreiben 1-3 mal. </li><li> Zählen von Zellen eine Zählkammer, verdünnte dann Grundwachstumsmedien zu 50.000 Zellen / ml verwendet wird. </li><li> Plate 2 ml Zellen pro 35 mm 2 Gericht für eine Gesamtmenge von 100.000 Zellen pro Schale und legen Sie wieder in Inkubator. </li></ol> 6. Tag 1: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1) <ol><li> Aliquoten 50 ml Differenzierung Medien # 1 (siehe Tabelle 2) und in einem 37 ° C Wasserbad inkubiert. </li><li> Wenn Medien erwärmt wird, damit sie in einem Inkubator ins Gleichgewicht (37° C, 5% CO 2) für mindestens eine Stunde eine richtige pH-Gleichgewicht vor der Verwendung herzustellen. </li><li> In Retinsäure (RA) (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. Anmerkung: Retinsäure ist lichtempfindlich und sollten in dunklen Flaschen bei 4 ° C gelagert werden </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator. </li></ol> 7. Tag 3: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5) </li></ol> 8. Tag 5: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 1) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 6 (Schritte 1-5) </li></ol> 9. Tag 7: Split Cells 1: 1 <ol><li> In RA erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Differenzierung Medien # 1 unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> In 200 ulerwärmt 0,05% Trypsin EDTA 1x pro 35 mm 2 Schüssel und warm in Inkubator etwa 2-3 min oder bis die Zellen von der Platte abgehoben sichtbar sind, wie unter einem Mikroskop beobachtet. </li><li> Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 1 mit RA pro 35 mm 2 Gericht und mit den Medien verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen. Hinweis: Während der Trypsinierung Schritte, nicht trypsinize nicht zu viele Gerichte auf einmal. Dies hilft neuronalen Kulturen zu gewährleisten, nicht zu lange in Trypsin inkubiert, die cytotoxisch sein können. </li><li> Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf Mal mit einem 10-ml-Plastikpipette. </li><li> Aliquoten 2 ml Zellsuspension in frischem 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator. </li></ol> 10. Tag 8: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 2) <ol><li> In RA (siehe &lt;strong&gt; Tabelle 1) erwärmt und Medien sofort ins Gleichgewicht gebracht, bevor Medien zu Gerichten hinzuzufügen. </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 2 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Schüssel und Rückkehr zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden, da sie schnell austrocknen kann. </li></ol> 11. Tag 9: Bereiten extrazellulären Matrix (ECM) beschichteten Schalen <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen von ECM-Lösung auf Eis und verdünnen 1: 100 in kaltes DMEM. </li><li> Dispense 2 ml Mischung in jedem 35 mm 2 Schüssel und sicherzustellen, dass das gesamte Boden der Schale bedeckt ist. </li><li> In einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1 h oder über Nacht. </li><li> Saugen Sie Mischung und lassen für etwa 1 Stunde in einer Haube an der Luft trocknen. Bei einer Raumtemperatur für bis zu 2 Monate. </li></ol> 12. Tag 10: Transfer Zellen aufECM-beschichtete Platten 1: 1 <ol><li> In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. </li><li> vorsichtig absaugen aus Medien und entsorgen. </li><li> Zugabe von 200 &amp; mgr; l Trypsin zu jedem erwärmt 35 mm 2 Schüssel und erlauben etwa 1-2 min bei Raumtemperatur inkubiert oder bis Neuronen werden sichtbar aus der Schale gehoben, wie unter einem Mikroskop beobachtet. Hinweis: Führen Sie diese Trypsinierung Schritt bei Raumtemperatur, um nicht zu über brüten Neuronen mit Trypsin und Schäden verursachen. Neuronen Freisetzung aus Platten viel schneller als epithelial-ähnlichen Zellen in diesem Stadium. </li><li> Stillen Sie das Trypsin durch Zugabe von 2 ml Differenzierung Medien # 2 pro 35 mm 2 Gericht und die Medien nutzen verbleibenden neuronalen Zellen von der Platte zu spülen. Dann übertragen Inhalt auf eine 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Kombinieren Sie Inhalte von bis zu 10 Gerichte in der 50 ml konischen Röhrchen und sanft verreiben langsam nach oben und unten nicht mehr als fünf mal mitein 10-ml-Plastikpipette. </li><li> Dispense 2 ml Zellsuspension in ECM-beschichtete 35 mm 2 Geschirr und zurück zum Inkubator. </li></ol> 13. Tag 11: Änderung Medien (Differenzierung Medien # 3) <ol><li> In RA (siehe Tabelle 1) erwärmt und ins Gleichgewicht gebracht Medien unmittelbar vor dem Hinzufügen von Medien zu Gerichten. </li><li> absaugen sanft alten Medien und entsorgen. </li><li> Langsam 2 ml Differenzierung Medien # 3 (siehe Tabelle 2) mit RA pro 35 mm 2 Gericht und zurück zum Inkubator. Nicht in die Neuronen über einen längeren Zeitraum der Luft ausgesetzt werden. </li></ol> 14. Tag 14: Ändern Medien (Differenzierung Medien # 3) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3) </li></ol> 15. Tag 17: Letzte Medienwechsel (Differenzierung Medien # 3) <ol><li> Wiederholen Sie Abschnitt 13 (Schritte 1-3) </li></ol> 16. Tag 18: Neuronale Kulturen gebrauchsfertig <ol><li> Ändern Medien an die frische Differentiation Medien # 3 mit RA alle 3 Tage Neuron Gesundheit zu erhalten. Hinweis: Die Zellen in Neurone differenziert werden sollte, und weisen einen neuronalen Phänotyp. Kulturen typischerweise stabil für bis zu 14 Tage nach der terminalen Differenzierung jedoch Dauer Neuron Lebensfähigkeit hängt von Passagezahl der undifferenzierten Zellen zu Beginn der Differenzierung. Höhere Durchgang Zahlen ergeben differenzierten Neuronen mit einer kürzeren Lebensdauer. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das obige Protokoll bietet eine einfache und reproduzierbare Methode homogene und lebensfähigen humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen. Dieses Protokoll nutzt Techniken und Praktiken, die mehrere zuvor veröffentlichten Methoden 4.1 und Ziele integrieren, um die besten Praktiken der einzelnen zu beschreiben. Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen beruht auf allmähliche Serumentzug; die Zugabe von Retinsäure, neurotrophen Faktoren und extrazellulären Matrixproteinen; und Serien Spaltung für differenzierte re...

Die Fähigkeit, in vitro Modellsysteme zu verwenden, hat sich stark verbessert den Bereichen Neurobiologie und Neurowissenschaften. Zellen in Kultur bieten eine effiziente Plattform Proteinfunktionalität und molekularen Mechanismen der spezifischen Phänomene zu verstehen, die Pathologie der Krankheit und Infektion zu charakterisieren, und die vorläufigen Testarzneimittelprüfungen durchzuführen. In der Neurobiologie umfassen die wichtigsten Arten von Zellkulturmodellen abgeleitet primären neuronalen Kulturen von Ratten und Mäusen, und Neuroblastom-Zelllinien, wie Ratte B35-Zellen 5, Neuro-2A Mauszellen 6 und Ratten-PC12-Zellen 7. Obwohl die Verwendung solcher Zelllinien signifikant die Feld fortgeschritten ist, gibt es mehrere Störfaktoren, die mit Umgang mit nicht-menschlichen Zellen und Gewebe. Dazu gehören Verständnis speziesspezifische Unterschiede in Stoffwechselprozessen, Phänotypen von Krankheitsmanifestation und Pathogenese bei Anwendung im Menschen verglichen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass dieRe gibt erhebliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch Genexpression und Transkriptionsfaktor-Signalisierung, Hervorhebung der Einschränkungen von Tiermodellen und die Bedeutung des Verstehens, die Wege zwischen Nagern und Menschen 11.08 konserviert sind. Andere haben die Verwendung von humanen neuronalen Zelllinien, einschließlich der N-Tera-2 (NT2) menschlichen Teratokarzinom Zelllinie und induzierbare pluripotente Stammzellen (iPS) eingesetzt. Diese Zelllinien sorgen für gute Modelle für die in vitro menschliche Systeme. Jedoch Differenzierung von NT2-Zellen mit Retinsäure (RA) führt zur Erzeugung eines gemischten Population von Neuronen, Astrozyten und radialer Gliazellen 12, einen zusätzlichen Reinigungsschritt notwendig, um reine Populationen von Neuronen erhalten. Zusätzlich zeigen NT2 Zellen eine sehr variable Karyotyp 13, wobei mehr als 60-Chromosomen in 72% der Zellen. iPS-Zellen zeigen Variabilität bei der Differenzierung zwischen verschiedenen Zelllinien und variieren in der Differenzierung Effizienz<html> 14. Es ist daher wünschenswert, eine konsistente und reproduzierbare humanen neuronalen Zellmodell zu haben diese Alternativen ergänzen. SH-SY5Y Neuroblasten-ähnlichen Zellen sind ein Subklon des Eltern Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH. Die Elternzelllinie wurde im Jahr 1970 von einer Knochenmarkbiopsie erzeugt, die 15 beide Neuroblast artig und Epithel-ähnlichen Zellen enthält. SH-SY5Y-Zellen haben einen stabilen Karyotyp, bestehend aus 47-Chromosomen, und kann von einer Neuroblasten artigen Zustand zu reifen menschlichen Nervenzellen durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen, einschließlich der Verwendung von RA, Phorbolester, und spezifische Neurotrophine wie Gehirn stamm unterscheiden neurotrophic factor (BDNF). Vor deutet darauf hin, dass die Verwendung verschiedener Methoden zur spezifischen Neuronen Subtypen wie adrenergen auswählen, cholinergen und dopaminergen Neuronen 16,17. Dieser letztere Aspekt macht SH-SY5Y-Zellen, die für eine Vielzahl von neurobiologischen Experimenten. ontent &quot;&gt; Mehrere Studien haben wichtige Unterschiede zwischen SH-SY5Y-Zellen in ihrem undifferenzierten und differenzierten Zuständen festgestellt. Wenn SH-SY5Y-Zellen sind undifferenziert, sie vermehren sich und treten schnell unpolarisierten zu sein, mit sehr wenigen, kurzen Prozessen. Sie wachsen häufig in Klumpen und express Marker indikativ für unreife Neuronen 18,19. Wenn differenziert, erstrecken sich diese Zellen lang, verzweigt Prozesse, Verminderung der Zellproliferation, und in einigen Fällen polarisieren 2,18. ausdifferenzierten SH-SY5Y-Zellen zuvor gezeigt wurde, ein auszudrücken Vielzahl von verschiedenen Markern von reifen Nervenzellen, einschließlich des Wachstums-assoziierten Protein (GAP-43), neuronale Zellkerne (NeuN), Synaptophysin (SYN), synaptischen Vesikel Protein II (SV2), Neuron spezifische Enolase (NSE) und Mikrotubuli-assoziierten Protein (MAP) 2,16,17,20 und 4 die Expression von glial Marker wie glial fibrillary acidic protein (GFAP) fehlt. In weiteren Unterstützung, die SH-SY5Y-Zellen differenziert represent eine homogene neuronalen Population, die Entfernung von BDNF führt zu zellulären Apoptose 4. Dies deutet darauf hin, dass das Überleben von differenzierten SH-SY5Y-Zellen auf trophischen Faktoren abhängig ist, ähnlich Neuronen zu reifen. Verwendung von SH-SY5Y-Zellen erhöht ist, seit der Subklon 1978 3 hergestellt wurde. Einige Beispiele für deren Verwendung umfassen Untersuchung Parkinson-Krankheit 17, Alzheimer-Krankheit 21 und die Pathogenese von viralen Infektionen einschließlich Poliovirus 22, Enterovirus 71 (EV71) 23,24 , Varicella-Zoster-Virus (VZV) 1, humanen Cytomegalovirus 25 und Herpes simplex-Virus (HSV) 2,26. Es ist wichtig, dass mehrere Studien unter Verwendung von SH-SY5Y-Zellen, diese Zellen in ihrem undifferenzierten Form verwendet zu beachten, vor allem im Bereich der neurovirology 27-36. Der Unterschied in der beobachteten Phänotyp von undifferenzierten gegenüber differenzierten SH-SY5Y-Zellen wirft die Frage auf whether die beobachtete Fortschreiten der Infektion würde in reifen differenzierten Neuronen unterschiedlich sein. Beispielsweise unterscheiden SH-SY5Y-Zellen haben einen höheren Wirkungsgrad von HSV-1 Aufnahme gegen die undifferenzierten, SH-SY5Y-Zellen vermehren, was zu einem Mangel an Oberflächenrezeptoren zurückzuführen sein kann, die HSV binden und modulieren Eintrag der undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen 2. Es ist daher wichtig, dass, wenn ein Experiment zum Testen Neuronen in vitro fokussiert Gestaltung, SH-SY5Y-Zellen, um differenziert werden die genauesten Ergebnisse für die Übersetzung und Vergleich zu in vivo-Modelle zu erhalten. Die Entwicklung einer zuverlässigen Methode humanen neuronalen Kulturen zu erzeugen ist zwingend notwendig Forscher zu ermöglichen Translationsexperimente durchzuführen, die genau den menschlichen Nervensystems modellieren. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein Verfahren, das beste Verfahren der vorangegangenen Methoden 4.1 zu bereichern für den menschlichen Neuronen abgrenzt, die differenziert werdenVerwendung von Retinsäure.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">B-27</td>
			<td style="width:141px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:133px;">17504-044</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:141px;">Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">D0627</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">DMSO</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">4-X</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:141px;">Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">M5650</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Fetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">GlutamaxI</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">35050-061</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Glutamine</td>
			<td style="width:141px;">Hyclone</td>
			<td style="width:133px;">SH30034.01</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:141px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP366-1</td>
			<td style="width:232px;">See Table 1 for preparation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:141px;">MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">E0282</td>
			<td style="width:232px;">See step 11 of the protocol</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">21103-049</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:141px;">Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15140-122</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">Retinoic acid (RA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">R2625</td>
			<td style="width:232px;">Should be stored in the dark at 4&#176; C because this reagent is light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">SH-SY5Y Cells</td>
			<td style="width:141px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-2266</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:141px;">0.5% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">15400-054</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:141px;">Falcon 35mm TC dishes</td>
			<td style="width:141px;">Falcon (A Corning Brand)</td>
			<td style="width:133px;">353001</td>
			<td style="width:232px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of the sh-sy5y human neuroblastoma cell line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Derzeit gibt es viele Fälle auf dem Gebiet der Neurobiologie und neurovirology wo undifferenzierten SH-SY5Y-Zellen als Funktionsmuster für den menschlichen Neuronen verwendet werden 27-36, und wichtiger ist, kann undifferenzierten Zellen Phänotypen fehlt wie eine optimale Virusaufnahme 2, die notwendig für eine genaue Interpretation. Es ist wichtig, dass, wenn SH-SY5Y-Zellen oder andere in vitro neuronale System werden die Zellen in geeigneter Weise in Neurone differenziert, um Daten z...

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Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Differenzierung der SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zelllinie

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

differentiation-of-the-sh-sy5y-human-neuroblastoma-cell-line

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

70.8K Aufrufe.  The Pennsylvania State University. It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications. 

Serie: Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local microenvironments. In here, we present a set of methods used for three dimensional (3D) differentiation and miRNA analysis of a clonal human neural stem cell (hNSC) line, currently in clinical trials for stroke disability (NCT01151124 and NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs were derived from an ethical approved first trimester human fetal cortex and conditionally immortalized using retroviral integration of a single copy of the c-mycERTAMconstruct. We describe how to measure axon process outgrowth of hNSCs differentiated on 3D scaffolds and how to quantify associated changes in miRNA expression using PCR array. Furthermore we exemplify computational analysis with the aim of selecting miRNA putative targets. SOX5 and NR4A3 were identified as suitable miRNA putative target of selected significantly down-regulated miRNAs in differentiated hNSC. MiRNA target validation was performed on SOX5 and NR4A3 3&#8217;UTRs by dual reporter plasmid transfection and dual luciferase assay.

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is to efficiently revert lineage-primed, conventional human pluripotent stem cells (hPSC) maintained on either feeder-free or feeder-dependent conditions to a na&#239;ve-like pluripotency with improved functionality. This chemical na&#239;ve reversion method employs the classical leukemia inhibitory factor (LIF), GSK3&#946;, and MEK/ERK inhibition cocktail (LIF-2i), supplemented with only a tankyrase inhibitor XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverts conventional hPSC to a stable pluripotent state adopting biochemical, transcriptional, and epigenetic features of the human pre-implantation epiblast. This LIF-3i method requires minimal cell culture manipulation and is highly reproducible in a broad repertoire of human embryonic stem cell (hESC) and transgene-free human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. The LIF-3i method does not require a re-priming step prior to the differentiation; N-hPSC can be differentiated directly with extremely high efficiencies and maintain karyotypic and epigenomic stabilities (including at imprinted loci). To increase the universality of the method, conventional hPSC are first cultured in the LIF-3i cocktail supplemented with two additional small molecules that potentiate protein kinase A (forskolin) and sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signaling (LIF-5i). This brief LIF-5i adaptation step significantly enhances the initial clonal expansion of conventional hPSC and permits them to be subsequently na&#239;ve-reverted with LIF-3i alone in bulk quantities, thus obviating the need for picking/subcloning rare N-hPSC colonies later. LIF-5i-stabilized hPSCs are subsequently maintained in LIF-3i alone without the need of anti-apoptotic molecules. Most importantly, LIF-3i reversion markedly improves the functional pluripotency of a broad repertoire of conventional hPSC by decreasing their lineage-primed gene expression and erasing the interline variability of directed differentiation commonly observed amongst independent hPSC lines. Representative characterizations of LIF-3i-reverted N-hPSC are provided, and experimental strategies for functional comparisons of isogenic hPSC in lineage-primed vs. na&#239;ve-like states are outlined.

We present a protocol for efficient, bulk, and rapid chemical reversion of conventional lineage-primed human pluripotent stem cells (hPSC) into an epigenomically-stable na&#239;ve preimplantation epiblast-like pluripotent state. This method results in decreased lineage-primed gene expression and marked improvement in directed multilineage differentiation across a broad repertoire of conventional hPSC lines.

Chemischen Rückfall von herkömmlichen menschlichen pluripotenten Stammzellen in eine naiv-artigen Zustand mit verbesserten Multilineage Differenzierung Potenz

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...