We thank James Maeda and Aaron Cooke for assistance with the filming and editing of this video. Funding was provided by the National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).

HINWEIS: Schritt 3 dieses Protokolls betrifft Wirbeltier Themen. Das Verfahren ist so konzipiert, dass die Tiere erhalten die humane Behandlung möglich und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der University of North Carolina Wilmington zugelassen. 1) Gewebeentnahme <ol><li> Verwenden Gewebe, das in seinem natürlichen Zustand der Flüssigkeitszufuhr und nicht gequetscht, ausgetrocknete oder übermäßig nass ist, da dies die Volumenkonzentration von Sekundärmetaboliten zu ändern. Geschnitten oder hacken Gewebe in Stücke oder Scheiben, die in ein 50 ml Zentrifugenrohr eingeschoben werden kann. Hinweis: Frisches Gewebe kann in einigen Fällen verwendet werden, aber es ist oft besser, schneiden oder hacken gefrorenem Gewebe, das nicht Gegenstand zu quetschen, wenn sie geschnitten. </li><li> Hinzufügen Gewebestücke zu 30 ml einer 1: 1 Mischung von Dichlormethan (DCM) und Methanol (MeOH) in einem graduierten Zentrifugenröhrchen bis zu einem Endvolumen von 40 ml erreicht wird. Achten Sie darauf, alle Schritte, die die Übertragung von durchführenLösungsmittel in einem Abzug bei ausreichender Belüftung verwenden. </li><li> Das Röhrchen verschließen und schwenken es mehrmals, dann während einer 4 Stunden Extraktionsdauer mehrmals schütteln. Hinweis: In dieser Zeit verbindet Wasser mit MeOH und der resultierende MeOH: Wasserphase trennt sich von der DCM-Phase. Das Gewebe wird wechselweise mit DCM und MeOH: Wasser als Emulsion wie die Röhren geschüttelt. </li><li> Übertragen der DCM-Extrakt in einen Rundkolben überführt und verdampft zur Trockne auf einem Rotationsverdampfer unter Verwendung niedriger Wärme (&lt;40 ° C). Mit minimalen Lösungsmittel, überweisen Sie den Trockenextrakt auf eine 20 ml Szintillationsfläschchen. Setzen Sie die Flasche mit einem Rotationsverdampfer Adapter und erneut zur Trockene verdampft auf einem Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (&lt;40 ° C). Hinweis: Der nächste Schritt ist die Verwendung eines selbst gemachten Druckinstrument, das durch Einschrauben die folgenden Punkte der Reihe nach auf das Ende einer Gewindestange montiert werden können: (1) Mutter (2) Waschmaschine, und (3) Hutmutter. Die Scheibe muss entweder perforiert oderversehen, so dass er kleiner als der Innendurchmesser eines 50 ml Zentrifugenröhrchens ist. </li><li> Zurückkehrend zu dem graduierten Zentrifugenröhrchen, das Gewebe und das MeOH enthält: Wasserextrakt, quetschen das Extraktionsmittel aus dem Gewebe durch Kompression. Übertragen Sie die MeOH: Wasser-Extrakt auf den gleichen Rundkolben und speichern gekühlt (&lt;10 ° C). </li><li> In MeOH in den Messzentrifugenröhrchen, bis die nun entwässert Gewebe wird für eine zweite Extraktion von 2 bis 6 Stunden Dauer untergetaucht, dann übertragen die neue MeOH zu extrahieren, um den gekühlten Rundkolben mit dem MeOH: Wasser-Extrakt. Wenn es irgendeine Besorgnis, dass das Gewebe nicht vollständig entnommen worden ist, wiederholen die 2 bis 6 h MeOH Extraktion. </li><li> Trocknen Sie den MeOH am Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (&lt;40 ° C). Die restliche wässrige Extrakt aus dem Rundkolben zur Szintillationsfläschchen, das das getrocknete unpolaren Extrakt, mit einem minimalen Volumen MeOH, den Rundbodenkolben zu spülen. </li><li> Evaporate des wässrigen Extrakts zur Trockne unter Verwendung niedriger Wärme (&lt;40 ° C) auf einem Vakuum-Konzentrator. Die Szintillationsfläschchen enthält nun die Gesamttrocken rohe organische Extrakt aus 10 ml Gewebe. Evakuieren Sie den Kopfraum der Flasche mit N2-Gas, um Oxidation zu verhindern, dicht schließen und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C). </li></ol> 2) Nahrungszubereitung <ol><li> Bereiten gefriergetrockneten Tintenfisch Mantel-Pulver. Hinweis: Squid Mantel stellt eine Nahrungsquelle, die vergleichbar mit der von anderen Makrozoobenthos ist und wird als Bestandteil in den Teilschritten von 2,2 verwendet werden. <ol><li> Gefrorene Tintenfischringe Mantel in warmem deionisiertem (DI) Wasser, dann pürieren in einem High-Speed-Mixer. </li><li> Gießen Sie eine dünne Schicht aus pürierten Tintenfisch Mantel auf ein flaches Backblech und Einfrieren (-20 ° C), dann bricht das Blatt von gefrorenen Kalmaren Püree in kleine Stücke zu gefriergetrocknet werden. </li><li> Lyophilisieren die gefrorene Kalmare Mantel Püree im Anschluss an die Betriebsabläufe des freeze Trockner. </li><li> Pulverisierten das lyophilisierte Stücke squid Mantel Püree in einem Hochgeschwindigkeitsmischer, um ein Pulver zu bilden. </li><li> In einer Abzugshaube, gießen Sie das pulverisierte Tintenfisch Mantel in eine Dreh Mehlsieb und zu sichten, um große Teile des Gewebes aus dem feinen Pulver zu trennen. </li><li> Übertragen Sie die fein pulverisierte Tintenfisch Mantel an einen verschließbaren Behälter. Evakuieren Sie den Behälterkopfraum mit N2-Gas, um Oxidation zu verhindern und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Futtermischung. Hinweis: Bei der Ausführung von mehreren aufeinander folgenden Assays praktisch ~ vorbereiten 100 ml Futtermischung ist es jedoch dieses Rezept kann auf kleinere Volumina skaliert werden, wenn nötig. <ol><li> Kombinieren einer Mischung von 3 g Alginsäure und 5 g gefriergetrocknete squid Mantel-Pulver mit 100 ml entionisiertem Wasser in einem 150 ml Becherglas. Rühre kräftig mit einem Mikrospatel für ein paar Minuten, bis das Pulver vollständig hydratisiert ist, und die Mischung homogen ist. Hinweis: Wenn gewünscht, Lebensmittelfarbe kann zu diesem st hinzugefügt werdenep: es ist einfacher, Farbstoff auf das Nahrungsmittelmischung, die sowohl behandelten und Kontrollmischungen erzeugen wird (Maskierung des natürlichen Pigments der Extrakt in dem Extrakt behandelten Mischung) hinzuzufügen, anstatt zu versuchen, die Farbe des Extraktes behandelten Mischung durch Zugabe überein Farbstoff auf das Kontrollgemisch. Eine grünliche oder bräunliche Lebensmittelfarbe ist oft wünschenswert, keine Pigmente im Rohextrakt zu maskieren. </li><li> Laden genau 10 ml Futtermischung in einen graduierten Spritze. Achten Sie darauf, um den Einschluss von Luftblasen während dieses Prozesses zu vermeiden. </li><li> Nehmen Sie die 20 ml Szintillationsfläschchen mit trockenen rohen organischen Extrakt aus der Tiefkühltruhe. Fügen Sie ein oder zwei Tropfen MeOH, dann rühren den Extrakt zu einer homogenen Mischung mit einem Mikrospatel. </li><li> Entnehmen Sie die eingesetzte 10-ml-Spritze von Lebensmittelmatrix in die 20 ml Szintillationsfläschchen und rühren mit einem Mikrospatel, um den Extrakt behandelten Futtermischung zu homogenisieren. Hinweis: Es kann helfen, die Spritze in kleineren Schritten (dh auswerfen auswerfen 2 ml und homogenisieren, dann r.EPEAT, bis alle 10 ml wurden homogenisiert wurde). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Assay-Pellets. <ol><li> Lädt ein sehr kleines Volumen der Extraktmischung (~ 1 ml) in eine Spritze aufgezogen und tauchen die Spitze der Spritze in eine Lösung von 0,25 M CaCl 2. Werfen Sie den Inhalt der Spritze, um eine lange, spaghettiartigen Strang zu bilden. </li><li> Nach ein paar Minuten wird der gehärtete Strang, hacken sie in 4 mm lange Pellets auf ein Glas Schneidebrett mit einer Rasierklinge, dann spülen Sie im Meerwasser. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 und 2.3.2 ohne einschließlich Gewebeextrakt, die Kontrolle Pellets zu machen. Achten Sie darauf, die Kontrolle-Pellets mit einem äquivalenten Volumen des Lösungsmittels zu behandeln (siehe Zusatz von MeOH zu behandelnde Mischung in Schritt 2.2.3) bis zur Lösungsmittelzugabe steuern. Wenn eine negative Kontrolle gewünscht, um zu bestätigen, dass Test Fisch aus Fütterung abgeschreckt werden, fügen Denatoniumbenzoat in einer Konzentration von 2 mg ml -1 in die Rohkost Mischung 27. </li></ol></li></ol> 3) Die SchmackhaftigkeitBioassays <ol><li> Führen Fütterungstests mit wild gefangenen Gelbphase bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, gehalten in Dreiergruppen in undurchsichtigen seitige Fächer von Labor Aquarien. </li><li> Liefern Futterpellets aus einem Becherglas von Meerwasser mit einer Glaspipette mit einem Gummiball. Hinweis: Es kann ein paar Tage dauern, um Fische zu trainieren, um Essen auf diese Weise erhalten. Ein Anlage Stimulus (zB ein paar Hähne der Pipette auf die Aquarienscheibe), die die Lieferung von Lebensmitteln voran kann hilfreich sein, um die Fische zu trainieren, um die Zugabe von Futterpellets erwarten. </li><li> Scoring-Pellets. Betrachten wir ein Pellet akzeptiert, wenn ohne weiteres durch den Fisch verzehrt. Betrachten wir ein Pellet verworfen wird, wenn nicht nach einer mindestens drei Versuchen durch ein oder mehrere Fische, um sie in ihrer Mundhöhle nehmen gegessen oder wenn das Pellet wird angefahren und nach einer solchen Versuch ignoriert. </li><li> Scoring Proben. Hinweis: Das Testverfahren ist als Flußdiagramm in Figur 1 dargestellten Gruppen von Fischen, die Futteraufnahme verweigern.Steuer Pellets bei jedem Schritt im Protokoll werden nicht weiter berücksichtigt. Es gibt zwei mögliche Ergebnisse von einem einzigen Durchlauf des Tests: Die Probe wird entweder angenommen oder abgelehnt. <ol><li> Beginnen Sie mit einer Steuer Pellet, um zu bestätigen, dass die Gruppe der Fische ist kooperativ. Bieten Sie einen behandelten Pellets. Wenn die Fische nehmen die behandelten Pellets, punkten die Probe als angenommen. Wenn die Fische weisen die behandelten Pellets bieten eine anschließende Kontrolle Pellet zu bestimmen, ob die Fische Fütterung eingestellt. Wenn die Fische nehmen die anschließende Kontrolle Pellet, punkten die Probe als abgelehnt. </li></ol></li><li> Replication. Wiederholen Sie den Testverfahren mit zehn unabhängige Gruppen von Fisch für jeden Extrakt. </li></ol> 4) Bewertung der Bedeutung <ol><li> Bewerten Sie die Signifikanz der Unterschiede in den Konsum von Steuer vs behandelten Pellets mit einer modifizierten Version des Fisher-Test 26. Ändern Sie den Test, so dass die Randsummen für Kontroll- und behandelten Pellets Fest, Behandeln sie beide als Stichproben. Hinweis: Diese bietet p = 0,057 bei 7 Pellets gegessen; daher wird jeder Extrakt als Abschreckung, wenn 6 oder weniger Pellets werden gegessen und schmackhaft, wenn 7 oder mehr Pellets werden gegessen. </li><li> Um die relative Schmackhaftigkeit zwischen Gruppen von Extrakten zu vergleichen sind die mittlere Anzahl von Pellets in jeder Gruppe gegessen. Halten Sie eine Schwelle von 6 Pellets so eine Gruppe von Wiederholungs Extrakte werden als abschreckend, wenn die mittlere Anzahl von Pellets gegessen + Standardfehler (SE) ≤6. Hinweis: In den repräsentativen Ergebnissen, ist die Gruppenzuordnung Arten, so replizieren Auszüge stammen aus verschiedenen Individuen und die relative Schmackhaftigkeit bei den einzelnen Spezies verglichen werden. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphitoxin,+a+new+high+molecular+weight+antifeedant+pyridinium+salt+from+the+Caribbean+sponge+Amphimedon+compressa.">Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa.</a> Journal of Natural Products. 58 (5), 647-652 (1995).</li><li>Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., K&#246;ck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).</li><li>Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antifeedant+triterpene+glycosides+from+the+Caribbean+sponge+Erylus+Formosus.">New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus.</a> Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).</li><li>Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+odor+from+sponges+of+the+genus+Ircinia+protect+them+from+fish+predators.">Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators.</a> Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).</li><li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defenses+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+I.+Assays+with+hermit+crabs.">Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).</li><li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars.">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li><li>Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+anti-predatory+defenses+of+Red+Sea+and+Caribbean+sponges.+I.+Chemical+defense.">Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense.</a> Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).</li><li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges:+Bad+taste+or+glass+spicules.">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Das hier beschriebene Verfahren stellt ein relativ einfaches, ökologisch relevanten Laborprotokoll für die Bewertung antipredatory chemische Abwehr in Meeresorganismen. Hier beschreiben wir die wichtigsten Kriterien, die von diesem Satz von Methoden erfüllt werden: (1) Geeignete Raubtier. Das Fütterungstest verwendet den bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, einer der am häufigsten vorkommenden Fische auf Korallenriffe in der Karibik. Die bluehead ist ein Genera...

Chemische Ökologie durch die Zusammenarbeit von Chemikern und Ökologen entwickelt. Während der Teildisziplin der terrestrischen chemischen Ökologie gibt es schon seit einiger Zeit, dass der Meeres chemische Ökologie ist nur ein paar Jahrzehnte alt, hat aber wichtige Einblicke in die Evolutionsökologie und Gemeinschaftsstruktur von Meeresorganismen 8.1 zur Verfügung gestellt. Sie profitieren von den neuen Technologien von Tauchen und NMR-Spektroskopie, Organiker schnell erzeugt eine große Anzahl von Veröffentlichungen, die neuartige Stoffwechselprodukte von benthischen wirbellosen Meerestieren und Algen in den 1970er und 1980er Jahren 9. Unter der Annahme, dass sekundäre Pflanzenstoffe muss einen Zweck haben viele dieser Publikationen ist ohne empirische Beweise zugeschrieben ökologisch wichtigen Eigenschaften, neue Verbindungen zu dienen. Etwa zur gleichen Zeit wurden Ökologen auch die Vorteile der Einführung von Tauchen und Beschreibung der Verteilungen und Häufigkeiten von Bodentieren und Pflanzen früher her bekanntbin relativ unwirksam Probenahmeverfahren wie Baggerarbeiten. Die Annahme dieser Forscher war, dass nichts festsitzenden und weichen Körper muss chemisch verteidigt werden Verbrauch von Raubtieren 10 zu vermeiden. In dem Bemühen, den Empirismus zu dem, was sonst beschreibende Arbeiten an Arten Häufigkeiten einzuführen, begannen einige Ökologen Extrapolation chemische Abwehr von Toxizitätstests 11. Die meisten Toxizitätstests ging es um die Exposition der ganze Fische oder andere Organismen, um wässrige Suspensionen von rohen organischen Extrakte der wirbellosen Gewebe, mit anschließender Bestimmung der Trockenmasse Konzentrationen von Extrakten für die Tötung der Hälfte der Testorganismen verantwortlich. Allerdings sind Toxizitätstests nicht emulieren die Art, in der potenzielle Räuber wahr Beute unter natürlichen Bedingungen, und nachfolgende Studien haben keinen Zusammenhang zwischen Toxizität und Schmackhaftigkeit 12-13 gefunden. Es überrascht, dass Publikationen in renommierten Fachzeitschriften verwendet Techniken, die wenig oder gar keine ecological Relevanz 14-15 und dass diese Studien sind immer noch weit zitiert heute. Es ist noch alarmierender zu beachten, dass Studien, die auf Toxizitätsdaten weiterhin veröffentlicht 16-18 werden. Die hier beschriebene Bioassay-Methode wurde in den späten 1980er Jahren entwickelt, um eine ökologisch relevanten Ansatz für die Meeres chemischen Ökologen sorgen zu antipredatory chemische Abwehr zu bewerten. Das Verfahren erfordert ein Modell Raubtier, um eine rohe organische Extrakt aus den Zielorganismus zu einem natürlichen Konzentration in einer ernährungs vergleichbaren Lebensmittelmatrix probieren und bietet Schmackhaftigkeit Daten, die ökologisch sinnvoller als Toxizitätsdaten. Der allgemeine Ansatz zur Bewertung der antipredatory Aktivität der Gewebe von Meeresorganismen enthält vier wichtige Kriterien: (1) eine angemessene Generalist Räuber müssen in Fütterungstests verwendet werden, (2) Bio-Stoffwechselprodukte aller Polaritäten müssen erschöpfend aus dem Gewebe der extrahiert werden Zielorganismus, (3) die Metaboliten muss be an der gleichen Volumenkonzentration in einer ernährungs geeigneten experimentellen Nahrung vermischt als in dem Organismus, aus dem sie entnommen wurden, und (4) das experimentelle Design und statistische Ansatz müssen einen sinn Metrik relativ distastefulness hindeuten. Die unten aufgeführten Verfahren ist speziell auf antipredatory chemische Abwehr in der Karibik wirbellose Meerestiere zu bewerten. Wir beschäftigen die bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, als Modell Raubfische, weil diese Art häufig auf karibischen Korallenriffe und ist dafür bekannt, ein breites Sortiment von Makrozoobenthos 19 kosten. Gewebe aus dem Zielorganismus wird zuerst extrahiert, dann kombiniert mit einer Futtermischung, und schließlich, um Gruppen von T. angeboten bifasciatum zu beobachten, ob sie den Extrakt behandelten Lebensmitteln abzulehnen. Assay-Daten mit dieser Methode haben wichtige Einblicke in die Defensive Chemie mariner Organismen 12,20-21, l bereitgestelltife Geschichte Kompromisse 22-24 und Gemeinschaftsökologie 25-26.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A41220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C614-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryocool Heat Transfer Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-548-146</td>
			<td>For vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>154723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squid mantle rings</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Can be purchased at grocery store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denatonium benzoate</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>D5765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml graduated centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulbs for Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red bulbs for pellet delivery</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml round-bottom flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-067E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vial adapter for rotavap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K747130-1324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weightboats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-202B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml graduated syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml graduated syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fish-feeding laboratory bioassay to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Hier berichten wir über Ergebnisse der biologischen Tests für sechs Arten von gemeinsamen karibischen Schwämmen (Abbildung 2). Diese Daten wurden ursprünglich im Jahr 1995 von Pawlik et al. 12 veröffentlicht und zeigen, die Macht dieser Ansatz für die Unterschiede in der chemischen Abwehrstrategien unter Co-auftretende Taxa Umfrage. Die Ergebnisse wurden als mittlere Anzahl von Futterpellets Standardfehler (SE) für die einzelnen Arten gegessen + wiesen. Fast keine Pellets wurd...

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A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Dieser Bioassay verwendet ein Modell Raubfische, die Anwesenheit von Futter Abschreckung Metaboliten aus organischen Extrakte der Gewebe von Meeresorganismen auf natürlichen Konzentrationen mit einem ernährungsphysiologisch vergleichbaren Lebensmittelmatrix zu bewerten.

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

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Research

JoVE Journal

Environment

9.3K Aufrufe.  University of North Carolina Wilmington.  Dieser Bioassay verwendet ein Modell Raubfische, die Anwesenheit von Futter Abschreckung Metaboliten aus organischen Extrakte der Gewebe von Meeresorganismen auf natürlichen Konzentrationen mit einem ernährungsphysiologisch vergleichbaren Lebensmittelmatrix zu bewerten. 

Serie: A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Entwirren der unsichtbaren Spieler im Ozean - ein Feld Führer zu Wasserchemie und Marine Mikrobiologie

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

Forschung

Umwelt

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be subsampled throughout the experiment1&#8211;7. Subsampling of large volumes can be problematic for several reasons: 1) it causes variation in the total volume and the surface area:volume ratio of the culture during the experiment; 2) pseudo-replication (i.e., replicate samples from the same treatment flask8) is often employed rather than true replicates (i.e., sampling from replicate treatments); 3) the duration of the experiment is limited by the total volume; and 4) axenic cultures or the usual bacterial microbiota are difficult to maintain during long-term experiments as contamination commonly occurs during subsampling.
The use of microtiter plates enables 1 ml culture volumes to be used for each replicate, with up to 48 separate treatments within a 12.65 x 8.5 x 2.2 cm plate, thereby decreasing the experimental volume and allowing for extensive replication without subsampling any treatment. Additionally, this technique can be modified to fit a variety of experimental formats including: bacterial-algal co-cultures, algal physiology tests, and toxin screening9&#8211;11. Individual wells with an alga, bacterium and/or co-cultures can be sampled for numerous laboratory procedures including, but not limited to: WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry, microscopy, bacterial colony forming unit (cfu) counts and flow cytometry. The combination of the microtiter plate format and WATER-PAM fluorometry allows for multiple rapid measurements of photochemical yield and other photochemical parameters with low variability between samples, high reproducibility and avoids the many pitfalls of subsampling a carboy or conical flask over the course of an experiment.

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.

A Small Volume Bioassay um bakterielle / Phytoplankton Co-Kultur Bewerten Sie mit Wasser-Pulse-amplitudenmodulierten (WATER-PAM) Fluorometrie

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Laboratory Simulation of an Iron(II)-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling from hydrothermal sources in the Precambrian ocean was oxidized by molecular oxygen [O2] produced by cyanobacteria. The oldest BIFs, deposited prior to the Great Oxidation Event (GOE) at about 2.4 billion years (Gy) ago, could have formed by direct oxidation of Fe(II) by anoxygenic photoferrotrophs under anoxic conditions. As a method for testing the geochemical and mineralogical patterns that develop under different biological scenarios, we designed a 40 cm long vertical flow-through column to simulate an anoxic Fe(II)-rich marine upwelling system representative of an ancient ocean on a lab scale. The cylinder was packed with a porous glass bead matrix to stabilize the geochemical gradients, and liquid samples for iron quantification could be taken throughout the water column. Dissolved oxygen was detected non-invasively via optodes from the outside. Results from biotic experiments that involved upwelling fluxes of Fe(II) from the bottom, a distinct light gradient from top, and cyanobacteria present in the water column, show clear evidence for the formation of Fe(III) mineral precipitates and development of a chemocline between Fe(II) and O2. This column allows us to test hypotheses for the formation of the BIFs by culturing cyanobacteria (and in the future photoferrotrophs) under simulated marine Precambrian conditions. Furthermore we hypothesize that our column concept allows for the simulation of various chemical and physical environments &#8212; including shallow marine or lacustrine sediments.

Laboratory Simulation of an IronII-rich Precambrian Marine Upwelling System to Explore the Growth of Photosynthetic Bacteria

We simulated a Precambrian ferruginous marine upwelling system in a lab-scale vertical flow-through column. The goal was to understand how geochemical profiles of O2 and Fe(II) evolve as cyanobacteria produce O2. The results show the establishment of a chemocline due to Fe(II) oxidation by photosynthetically produced O2.

Labor Simulation eines Eisen (II) -reichen Präkambrium Meeres Upwelling-System das Wachstum von Bakterien zu erkunden Photosynthetic

A conventional concept for the deposition of some Precambrian Banded Iron Formations (BIF) proceeds on the assumption that ferrous iron [Fe(II)] upwelling ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Ökotoxikologische Methode mit Meeresbakterien<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Zur Beurteilung der akuten Toxizität von Umweltschadstoffen

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extraktion von Organochlor-Pestiziden aus Kunststoff-Pellets und Kunststoff-Typ-Analyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Entwicklung neuer Methoden zur Quantifizierung der Fisch-Dichte mit Unterwasser-Stereo-Video-Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster (Nephrops norvegicus)

We present a protocol related to a video-tracking technique based on the background subtraction and image thresholding that makes it possible to individually track cohoused animals. We tested the tracking routine with four cohoused Norway lobsters (Nephrops norvegicus) under light-darkness conditions for 5 days. The lobsters had been individually tagged. The experimental setup and the tracking techniques used are entirely based on the open source software. The comparison of the tracking output with a manual detection indicates that the lobsters were correctly detected 69% of the times. Among the correctly detected lobsters, their individual tags were correctly identified 89.5% of the times. Considering the frame rate used in the protocol and the movement rate of lobsters, the performance of the video tracking has a good quality, and the representative results support the validity of the protocol in producing valuable data for research needs (individual space occupancy or locomotor activity patterns). The protocol presented here can be easily customized and is, hence, transferable to other species where the individual tracking of specimens in a group can be valuable for answering research questions.

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster Nephrops norvegicus

Here we present a protocol to individually track animals over a long period of time. It uses computer vision methods to identify a set of manually constructed tags by using a group of lobsters as case study, simultaneously providing information on how to house, manipulate, and mark the lobsters.

Langfristige Video Tracking Cohoused Wassertiere: A Case Study of der Bewegungsorgane Tagesaktivität der Kaisergranat (Nephrops Norvegicus)

We present a protocol related to a video-tracking technique based on the background subtraction and image thresholding that makes it possible to ...

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. Non-destructive microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging has become a powerful and emerging protocol in biology, due to technological advancements in sample staining methods and innovations in microCT hardware, processing computers, and data analysis software. However, this protocol is not commonly used, as it is in the medical and industrial fields. One of the reasons for this limited use is the lack of a simple and comprehensible manual that covers all of the necessary steps: sample collection, fixation, staining, mounting, scanning, and data analyses. Another reason is the vast diversity of metazoans, particularly marine invertebrates. Because of marine invertebrates&#8217; diverse sizes, morphologies, and physiologies, it is crucial to adjust experimental conditions and hardware configurations at each step, depending on the sample. Here, microCT imaging methods are explained in detail using three phylogenetically diverse marine invertebrates: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Suggestions on performing microCT imaging on various animals are also provided.

Microfocus X-ray CT microCT Imaging of Actinia equina Cnidaria, Harmothoe sp. Annelida, and Xenoturbella japonica Xenacoelomorpha

Here, protocols for performing microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of three marine invertebrate animals are explained in detail. This study describes steps such as sample fixation, staining, mounting, scanning, image reconstruction, and data analyses. Suggestions on how the protocol can be adjusted for different samples are also provided.

Mikrofokus-Röntgen-CT (microCT) Bildgebung von Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) und Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...