We thank Elisha Wood-Charlson, Jackie Mueller, Karen Weynberg, and Kathy Morrow for their help and constructive input on this manuscript. We also thank the crew and captain of the Hanse explorer which provided us with a perfect working environment to conduct large parts of this research. Further we would like to thank the three anonymous reviewers for their time and helpful comments to improve the manuscript. This work was funded by the NSF Dimensions of Biodiversity and PIRE awards DEB-1046413 and OISE/IIA-1243541, respectively, the Gordon and Betty Moore Foundation, Investigator Award 3781, and the CIFAR Integrated Microbial Diversity Fellowship IMB-ROHW-141679, all to FR.

The authors have nothing to disclose.

Die hier vorgestellten Methoden liefert ein Werkzeug, um eine umfassende Bewertung der viralen und mikrobiellen Dynamik in aquatischen Ökosystemen zu generieren. Sie werden gezielt auf die stehend Lager von organischen und anorganischen Ressourcen zur Verfügung zu mikrobiellen Gemeinschaften zu quantifizieren und das Make-up der viralen und mikrobiellen Gemeinschaft zu charakterisieren. Neben der Quantifizierung viraler Fülle und mikrobielle Abundanz und Biomasse, genomische Sequenzinformation verrät ihre Gemeinschaft Struktur und Funktion. Alle Methoden wurden entwickelt oder geändert, um für den Einsatz in Fernfeldpositionen zu ermöglichen. Aber der Mangel an kontrollierten Umgebungs erzeugt inhärent eine Fehlerpotential. Hier diskutieren wir einige Vorbehalte mit jedem der untersuchten Parameter zugeordnet. Neben Potenzial für Kontamination während Probenhandling einige der Parameter auch ergeben Fehlerpotenzial in den analytischen Prozess. Von gelöstem organischem Kohlenstoff Kohlenstoffkontamination während der Probenahme erfolgen (Abtasten abwärts oder in der Nähe eines Bootes oder Taucher), während der Probenvorbereitung (Verschmutzung der Ausrüstung oder unbeabsichtigte Handhabung) und auch während der Lagerung der Probe (in anderen Proben, die organische Gefrier Lösungsmittel / flüchtigen). Die verschiedenen Verschmutzungsquellen Verhalten als wenige Handhabungsschritte wie möglich zu vermeiden, da jede Probe Verlagerung stellt eine zusätzliche Quelle der Verunreinigung. Die Probe sollte nicht in Kontakt mit irgendeinem Einzelteil nicht mit Säure gewaschen oder verbrannt zu bekommen. Schließlich Bezeichnen eines Speicher Gefrierschrank ausschließlich für Proben flüchtige organische Substanzen nicht enthalten, werden die Integrität der Proben bei längerer Lagerung zu gewährleisten. Wenn Proben nicht während einer längeren Reisezeit Versauerung der DOC-Proben mit konzentrierter HCl gefroren aufbewahrt werden (wie beschrieben 38-41) kann eine anwendbare Alternative sein. Um zu überprüfen, die Messgenauigkeit DOC Konsens Referenzmaterialien sollten reg verwendet werdenders während der DOC-Messung läuft. Besonders tiefe Meerwasser (&gt; 2000 m) Referenzen sind wertvoll bei der Beurteilung der Leistung der analytischen Maschine, wie sie in ihrem DOC-Gehalt 42 sehr stabil ist. Particulate Organic Matter Neben der Vermeidung von organischen Kohlenstoffverunreinigung, erfordert POM Probenahme besonders auf die Genauigkeit des gefilterten Volumens zu gewährleisten. Falls die gewählte Volumen von 500 ml sollte für jede mögliche Ursache abweichen dies muss angemerkt, die Menge des POM auf dem Filter zu dem Filtrat von dem es abgeleitet wurde gefangen bezieht. Anorganische Nährstoffe Wie bei organischen Kohlenstoff Probenahme, muss man auf mögliche Nährstoffprobenkontamination durch verschiedene Quellen wie Boote oder Abwassereinleitungen 12 erzeugt bezahlt werden. Filter für organischen Kohlenstoff Probenahme mit einer Nennporengrößen von 0,8 um verwendet werden, können nicht alle mikrobiellen Biomasse und sh ausschließenould daher auf 0,2 &amp; mgr; m-Filter für diesen Filtrationsschritt geändert werden. Ferner stellen Nachweisgrenzen ein Problem mit Nährstoffproben; vor allem in den nährstoffarmen Oberflächenwasser um viele Korallenriff Standorten (zB Cotner et al. 43). Nachweisgrenzen liegen etwa bei 0,1, 0,2 und 0,1 umol / L für Ammonium, Nitrat und Nitrit und ortho-Phosphat jeweils (siehe 36,12,37) Mikroskopie Neben Variationen in der Konzentration von Bildproben-Analyse von Objektträger weiterhin ergibt Fehlerpotential. Zum Beispiel können die Bilder unscharf in einigen Bereichen des Sichtfeldes ist, und in Ausrichtung in anderen. Als eine hochreine Aluminiumoxidmatrixfilters ist eine sehr starre Filtertyp kann jeder Schmutz unter dem Filter bewirken, dass der gesamte Filter auf einen Winkel zum Schlitten sitzen. Als Ergebnis können die Bilder unscharf konsistent in verschiedenen Teilen des Sichtfelds für eine gegebene Filter, wiederunabhängig von Mikroskop Ausrichtung. Remon Filter, wodurch die Unterseite der Filter sauber ist, kann dies zu verbessern, wenn sie beobachtet wird. Auch in einigen Fällen kann es zwei Brennebenen, in denen Viren und Mikroben gefunden werden. Dies ist das Ergebnis von gefärbten Gegenständen Ablösen von dem Filter bei der Montage und Aufschwimmen an der Unterseite des Deckglases, das zählt unzuverlässig machen kann. Daher ist es immer empfehlenswert, um die Qualität der Proben während des Prozesses zu überprüfen. Durchflusszytometrie Wie bei den Mikroskopie Proben kann es natürlich vorkommen Unterschiede zwischen Durchflusszytometrie Proben, die Anpassungen des analytischen Prozesses erforderlich. Zum Beispiel, abhängig von der Empfindlichkeit des Geräts, schwach fluoreszierende Prochlorococcus Zellen unterhalb des Rauschpegels sein und nicht quantifizierbar. Perlen dienen als interne Probenkontrolle (zB, um zu bestätigen, dass bzw. des InstrumentsOnse um Fluoreszenzsignale ist konsistent von Tag zu Tag (und bleibt während des Laufs selbst stabil). Wenn der Probe mit bekannter Konzentration zugesetzt wird, kann sie auch als eine interne Kontrolle, das Probenvolumen Lauf überprüfen zu dienen. Es wird jedoch empfohlen, immer ein Aliquot eines zuvor eingefroren &quot;Standard&quot; Meer Probe aufgetaut ist und zusammen mit den Proben von Interesse angefärbt, um eine zusätzliche Steuerung für biologische Probenhandhabungs zwischen 96-Well-Platte laufen Läufen bereitzustellen. Je nach Lage kann Seewasser Proben sehr unterschiedlich voneinander aussehen. Sortierung &quot;Vertreter&quot; der Bevölkerung und dann die Anzeige unter einem Epifluoreszenzmikroskop (EM) kann ein guter Weg, um Phytoplanktonpopulationen entweder Synechococcus sp. Oder photosynthetischen Eukaryoten schnell überprüfen. Prochlorococcus Zellen sind in der Regel nicht sichtbar unter EM, weil sie zu schnell verblassen. Neben einem, Synechococcus sp Chlorophyll. Den ph enthalten auchotopigment phycoeurythrin (PE), die Licht mit kürzeren Wellenlängen (540-630 nm) als Chlorophyll A (660-700 nm) emittiert. Wenn Synechococcus Zellen mit blau / grünes Licht (470-490 nm) angeregt wird, werden sie golden erscheinen, wenn unter einem Emissionsfilter, die alle Wellenlängen des Lichts unterhalb 510 nm beseitigt angesehen. Im Vergleich dazu wird die eukaryotische Fraktion rot aussehen, wenn sie mit der gleichen Wellenlänge von Licht angeregt. Viral Metagenomics Es ist wichtig zu beachten, dass der Prozess der VLP-Konzentration und Lagerung beeinflußt die Gemeinschaft gewonnen. Viruspartikelverlust bei jedem Schritt in dem Verfahren auftreten, und somit kann die Auswahl von Virusreinigung und Anreicherungsprotokolle letztlich auf die beobachtete taxonomische Zusammensetzung und Vielfalt der resultierenden viralen metagenomes 44,45,18. Konzentration der Proben kann mit TFF 19 oder chemischer Basis Ausflockung 20 erfolgen. In der chemisch-basierten Ansatz, postulierenhungsweise geladenen Eisenionen binden die natürlich negativ geladenen Viruspartikel bilden große (&gt; 8 um) Eisenvirale Komplexe, die aus der Lösung ausflocken und kann mit 8 um Filter zurückgewonnen werden. Anschließend wird das Eisen von den Viruspartikeln chelatisiert und wieder gelöst unter Verwendung von Magnesium, Ascorbinsäure und EDTA, so konzentrierten viralen Partikel für die Nukleinsäureextraktion 20. Nach dem Vergleich dieser beiden gängigen Methoden schlossen wir, dass das Eisenchlorid-Verfahren ist weniger zeitaufwendig als TFF Viruskonzentration, kann jedoch einige Einschränkungen ergeben. Wir fanden, dass Dissoziation und Auflösung des Eisenvirale erfordert eine Zwei-fach konzentrierter Magnesium-Ascorbinsäure-EDTA-Lösung als berichtet 20, um zur Auflösung vor den Ascorbinsäure verschlechtert fortzufahren. Abgesehen von diesem Problem, reinigt das Protokoll Viruspartikel nach Größen Fraktionierung allein Entfernen mikrobiellen Verunreinigungen unter Verwendung von 0,2 &amp; mgr; m-Filtration. Große Viren nicht durch die filt gebenER (zB Yang et al. 46) und wird daher nicht in der Metagenom nachgewiesen werden, während einige Bakterien zu tun (McDole, unveröffentlichte Daten). Dies führt zu bakterieller Kontamination während diskriminieren große Viren. Das spezifische Problem aber ist auch zur Entfernung von Mikroben im Zusammenhang mit TFF Konzentration relevant. Da die Chloroformbehandlung wurde gezeigt, Chloroform empfindlichen Viren mit Lipidmembranen Außen 47 zu entfernen einige Studien darauf hin, dass 0,22 &amp; mgr; m Filtration kann verwendet werden, um den Großteil der Bakterien zu entfernen. Es sollte auch beachtet werden, dass das vorgestellte Verfahren zielt vor allem auf Bakteriophagen, die am häufigsten vorkommende Träger des genetischen Materials in Meeresumgebungen werden. Weil Phagen werden in der Regel dachte nicht zu häufig enthalten Lipide 48 sie widerstandsfähiger gegen Chloroform-Behandlung sind. Nach unserem Wissen eine &quot;catch-all&quot; Methode nicht auf dem neuesten Stand existieren. Das hier vorgestellte Verfahren ist aus ou angepasstr Felderfahrung in den letzten 10 Jahren in verschiedenen Meeresumwelt Spanning tropisch bis arktisch-Systeme. Mikrobielle Metagenomics Die Konstruktion von Metagenombanken für Mikroben (dh Bakterien und Archaea) einfacher ist als das virale metagenomes da es einfacher ist, die minimale DNA-Konzentration für Bibliotheksvorbereitung zu erzeugen. Linker Verstärkungs shotgun Bibliotheken (LASLs) 17,49,50 und Amplifikation des gesamten Genoms anhand mehrerer Displacement Amplifikation (MDA) sind die beiden am häufigsten verwendeten Verfahren, um eine ausreichende DNA für die Sequenzierung zu erzeugen. Die Verwendung von MDA, höhere DNA-Konzentrationen in mikrobiellen metagenomes erhalten, ist es manchmal notwendig. Dies kann jedoch Artefakte in den Sequenzdaten, wie etwa die Übersteuerung von Dinoflagellaten Miniringe verursachen. MDA Verfahren sind bekannt, um vorzugsweise zu verstärken einzelsträngige DNA und Kreis, was zu nicht-quantitative Ergebnisse 51,52. Die optimierten LASLs Ansatz 50 kann daher als bessere Alternative Verstärken sowohl mikrobieller und viraler DNA zur Sequenzierung metagenomic dient. Es ist wichtig zu beachten, dass die LASLs Ansatz hat mehrere Schritte erfordert anspruchsvolle Ausstattung, und ist an dsDNA Vorlagen beschränkt. Ferner ist die Gewebe DNA-Extraktions-Kits wurde gezeigt, dass DNA sowohl von Gram-positiven und Gram-negativen Stämmen extrahiert, aber es wurde nicht überprüft, um effektiv lysieren widerspenstigen mikrobiellen Taxa und ihre zugehörigen Strukturen wurden (zB bestimmte Archaea, Endosporen oder Pilzsporen) . Daher kann eine Perle Schlagen Schritt notwendig sein, DNA von bestimmten Mikroben erhalten. Diese umfassende Bewertung wird in einem besseren Verständnis der viralen und mikrobiellen Ökosystemfunktionen führen. Obwohl nur wenige Studien haben die Anstrengung, alle vorgeschlagenen Parameter einschätzen zu, viele wurden untersucht ausgewählte. Nelson et al. 53 vorgeschlagen, eine Verbindung zween spezifischen Riffhabitaten und Abreicherungen in beiden DOC und Bakterioplankton Konzentrationen relativ zu küstennahen Gewässern. Diese Konzentrationsänderungen wurden durch deutliche Differenzierungen Bakterioplankton Gemeinden begleitet. Dinsdale et al. 5 gezeigt, dass erhöhte anthropogenen Auswirkungen durch 10x höhere Häufigkeiten von Mikrobenzellen und virusähnlicher Partikel beigefügt. Mikrobiellen Gemeinschaften in Meeresgewässern umliegenden bewohnten Inseln hatte auch größere Fraktionen heterotrophs und potenzielle Krankheitserreger 5. Schließlich McDole et al. 4 zeigte, durch die Einführung des microbialization Score, dass menschliche Aktivitäten verlagern sich Energie auf die Mikroben, auf Kosten der macrobes. Diese Studien, zu speziellen mikrobiellen und Wasserchemie Parameter konzentriert, liefern neue Einblicke in die biochemische Struktur der marinen Ökosysteme. Die Kombination traditioneller Datenüberwachungs Ökosystem Bemühungen - wie Temperatur und pH-Werte, Fischbiomasse und diversity, benthische Abdeckung oder Exposition gegenüber menschlichen Einfluss - mit Wasserchemie und mikrobielle Assessments, wird wahrscheinlich in empfindlicher Umweltüberwachung Anstrengungen, die zu mehr gezielte Schutzbemühungen führen kann führen.

Meeresökosysteme sind auf ein breites Spektrum von Störungen, die in Veränderungen von Nährstoffverfügbarkeit auf die Biomasse des Topraeuber führen ausgesetzt. Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben mehrere Studien die Bedeutung der mikrobiellen Gemeinschaften in marinen Ökosystemen 4.1 demonstriert. Es ist offensichtlich, dass Veränderungen in der bakteriellen und viralen Gemeinschaft sind eng mit der allgemeinen Verschlechterung der Meeresumwelt 5 verbunden. Diese Veränderungen können durch veränderte geochemischen in der Wassersäule, wie die Verfügbarkeit von Sauerstoff oder Kohlenstoff Remineralisierung 6,7 erleichtert. Als Folge der Wechselwirkung zwischen dem Makroorganismen, Wasserchemie und mikrobielle Aktivität Rückkopplungsschleifen können die Rate der Verschlechterung des Ökosystems 8 beschleunigen. In den 1970er und 80er Jahren wurden mehrere Versuche unternommen, um Stoffkreisläufe in marinen Ökosystemen 9-11 entwirren. Eine der größten Herausforderungen für diese frühen Studien war der Mangelstandardisierter Ansätze, die beurteilt biogeochemische Parameter zu messen. Zwar gab es Protokolle zur Verfügung, vor allem auf Meerwasser Nährstoffe 12,13 wurden die Bewertung der Kohlenstoffdynamik und der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur durch die Werkzeuge und Methoden zur Verfügung beschränkt. Mit der JGOFS EQPac Methoden Vergleich Sharp et al. 14 vorgeschlagen, zum ersten Mal eine zuverlässige und standardisierten Protokoll für gelöste organische Kohlenstoff (DOC) Konzentration Abschätzungen. Durch den frühen 2000er Jahren die analytischen Herausforderungen zur Verfügung stehenden Ressourcen der mikrobiellen Gemeinschaft war damit weitgehend gelöst zu bestimmen und Ansätze zur mikrobiellen Gemeinschaften in kontrollierten Kulturumgebungen charakterisieren gegründet worden war (siehe DeLong 15). Die traditionellen Sequenzierungsverfahren zu diesem Zeitpunkt weitgehend verließ sich auf kultivierte klonalen Kulturen. Frühumwelt Gen-Sequenzierung von natürlichen Proben zeigten jedoch, dass die Mehrheit der mikrobiellen biologischen Vielfalt war von cultiv verpasst wordenation-basierte Methoden 16. Im Jahr 2002 Breitbart et al. 17 verwendet Shotgun-Sequenzierung zum ersten Mal, um die virale Community im Umweltseewasserproben zur Festlegung eines Verfahrens, das gesamte Genom von unkultivierten Meeres viralen Gemeinden sequenzieren zu beschreiben. Innerhalb der bestehenden mikrobiellen Assessments, bleiben Viren besonders untersuchte, wie die meisten schwierig zu kultivieren sind und es fehlt ein universell konservierten Marker wie die 16S ribosomale RNA (rRNA) Gene in der Regel für die Beurteilung der Vielfalt und Gemeinschaft Profilierung eingesetzt. Die metagenomic Sequenzierung Ansatz bietet eine Alternative zur Kultur abhängig und Gen-Targeting Verfahren zur Analyse komplexer viraler Gemeinden. Während die ersten viralen Metagenomen aus Meerwasser erzeugt wurden mittels Sanger-Sequenzierung 17 sequenziert, hat die Entwicklung der nächsten Generation Sequenzierungstechnologien und verbesserte molekulare Techniken, um einen raschen Anstieg der metagenomische Studien 18 LED </sup&gt;. Die aktuelle Labor-Workflow für die virale Metagenomik beinhaltet die Trennung, Anreicherung und / oder Konzentration von Viruspartikeln, gefolgt von Nukleinsäure (DNA oder RNA) Extraktion, Bibliothek Vorbereitung, und Sequenzierung 19-21. Um das vorhandene Wissen auf die virale, mikrobielle und biochemische Funktion in aquatischen Ökosystemen zu fördern, den Vergleich von Daten-Sets in verschiedenen Systemen auf der ganzen Welt ist unerlässlich. Doch die etablierten Protokollen weitgehend für Nearshore-Umgebungen mit leicht zugänglichen Laboreinrichtungen entwickelt worden. Damit ist der Mangel an standardisierten Feldmethoden behindert diese Quer Ökosystem Vergleiche. Hier stellen wir ausführlich getestet und gut standardisiert Anpassungen aus dem Stand der Technik Forschungsprotokolle für den Einsatz in Fernfeldpositionen. Diese Methoden wurden in mehreren Studien überspannt den letzten zehn Jahren 5,22 bewährt und werden derzeit von verschiedenen Meereslabors auf der NOAA verwendet sowieReef Abschätzung und Monitoring Program (RAMP) in der gesamten pazifischen Ozean 4. Die Probenahmeprotokolle sind Wasser-chemischen Parametern (anorganische und organische Kohlenstoffkonzentrationen, anorganischen Nährstoffkonzentration), virale und mikrobielle Abundanz (direkte Keimzahlen, direkte virale zählt, und Durchflusszytometrie zu autotroph vs heterotroph Kennziffern analysieren) und viralen und mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur und Stoffwechselpotenzial durch Metagenom-Analyse (für eine Übersicht siehe Abbildung 1). Die aus den hier beschriebenen Methoden erhaltenen Ergebnisse sind, um die Schlüssel biogeochemischen Hintergrund Parameter benötigt, um umfassend zu charakterisieren aquatischen Ökosystemen aufzuklären erforderlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1307">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:217px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:325px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Niskin collection and processing units (Hatay Niskins)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration setup&#160;</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 &#8211; 36 % Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A508-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">High-density polyethylene (HDPE) container</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Combustion oven (550&#176; C)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml HDPE vials&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02-896-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">25 mm GF/F filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-874-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>XX62-000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile, non-powdered gloves</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">19-170-010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bilge pump&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Thirsty Mate 124PF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 l collapsible low-density polyethylene carboy&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>e.g., Reliance Fold A Carrier II</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>CFP-2-E-9A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum-cured silicon tubing for TFF</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>96440-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hose clamps</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>P-68007-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-77410-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8.0 &#181;m polycarbonate Track-Etched Membrane filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>09-300-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#181;m polyvinylidene difluoride cylindrical filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>SVHV010RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synthetic nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-125-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml plastic scintillation bottle&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>03-341-72C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clean bucket (10 - 20 L)</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">32 % paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 % glutaraldehyde</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 &#181;m&#160; high-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>6809-6022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10,000 X SYBR Gold nucleic acid stain&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DAPI solution 25 &#181;g ml-1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular grade water</td>
			<td>sigma aldrich</td>
			<td>W-4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>BP351-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP399-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>G31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slide</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delicate task wipe&#160;</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide Station with vacuum pump</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Figure 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:217px;">Macherey-Nagel</td>
			<td>740952.1</td>
			<td>Nucleospin tissue kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Proteinase K (20 mg ml-1)</td>
			<td style="width:217px;">Lifetechnologies</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-proof 100% Ethanol</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45503-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium chloride (CsCl)</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>bp1595-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 ml syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.02 &#181;m alumina matrix disposable syringe filter</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>O992613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">Ultra-clear centrifuge tubes</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra - swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:217px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:149px;">333790</td>
			<td>SW41 Ti Rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DNase I (100 u &#181;l-1)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>260913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2482-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP228-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycogen</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">G-1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 % Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:217px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:149px;">15058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 X Tris-EDTA (TE) pH 8.0</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2473-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">02674-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20 &#956;g ml-1 Proteinase K</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1700-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP1145-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1</td>
			<td style="width:217px;">sigma aldrich</td>
			<td style="width:149px;">p3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:616px;">50ml Oak Ridge Tube&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Sci</td>
			<td style="width:149px;">05-562-16B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology

Hier stellen wir eine Reihe von sorgfältig getestet und gut standardisierte Forschung Protokolle für den Einsatz in abgelegenen Meeresumgebungen angepasst. Die Probenahmeprotokolle umfassen die Beurteilung der zur Verfügung stehenden Ressourcen der mikrobiellen Gemeinschaft (gelöster organischer Kohlenstoff, partikulären organischen Substanz, anorganische Nährstoffe) und eine umfassende Beschreibung der viralen und bakteriellen Gemeinschaften (über direkte virale und Keimzahlen, Aufzählung autofluoreszierenden Mikroben und Bau von viralen und mikrobiellen Metagenomen). Wir verwenden eine Kombination von Verfahren, die eine dispergierte Gebiet der wissenschaftlichen Disziplinen umfasst bereits etablierten Protokollen und einige der neuesten Techniken entwickelt darzustellen. Besonders metagenomische Sequenzierungstechniken für virale und bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung verwendet, haben erst in den letzten Jahren etabliert und werden daher noch zu ständigen Verbesserung unterzogen. Dies hat zu einer Vielzahl von Probennahme und Probenverarbeitung Verfahren curren führtently in Gebrauch. Der Satz von hier vorgestellten Methoden bietet eine aktuelle Ansatz zu sammeln und zu verarbeiten Umweltproben. Parameter mit diesen Protokollen angesprochen ergeben das Minimum auf wesentliche Informationen zu charakterisieren und zu verstehen, die zugrunde liegenden Mechanismen der viralen und mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik. Es gibt einfach zu Richtlinien, umfassende Umfragen durchzuführen, folgen und diskutiert kritische Schritte und mögliche Vorbehalte relevant für jede Technik.

Mikroskopie Mikroskopie Proben können und sollten sofort untersucht werden, um sicherzustellen, dass sie in der gewünschten Qualität sind. Um Fülle und Größenverteilung der Bakteriengemeinschaft zu messen, wird DAPI gleitet durch Epifluoreszenzmikroskopie untersucht werden (Anregung / Emission: 358/461 nm, siehe McDole et al 2012). (6A). Zellzahlen und Abmessungen können mit Bildbearbeitungssoftware (zB ImagePro oder ImageJ) gesammelt werden. Aus Länge und Breite Zellvolumen (V) werden, indem die Annahme, dass alle Zellen, die die Form von Zylindern mit halbkugelförmigen Kappen Verwendung der folgenden Gleichung abgeleitet sind: V = π / 4 × B 2 (L - w / 3) wobei L die Länge und die Breite w ist jeder Zelle 23,4. Mikrobielle Biomasse kann dann mit vorher festgelegten größenabhängigen Beziehungen fo geschätzt werdenr marine mikrobielle Gemeinschaften 24. Generell marinen Bakterien haben eine Länge von 0,1 bis 4 um, sondern gehen bis ~ 8 um in einigen Orten. Während die Filter (0,2 um) mit DAPI gefärbt wird nur Bakterien zeigen, die für die SYBR Gold-Färbung (0,02 um) verwendeten Filter enthalten Bakterien und Viren. Messen der Häufigkeit von Viren nach dem gleichen Protokoll wie für Mikroben jedoch eine Anregung 325-375 nm verwendet werden und das Emissionsmaximum liegt bei 537 nm (Abbildung 6B). Um quantitative Daten zu erzeugen, muss die Probenmenge in Abhängigkeit von der viralen Hülle und Fülle in der ursprünglichen Probe angepasst werden. Die richtige Lautstärke zu filtern wird am besten empirisch für eine bestimmte Wasserkörper bestimmt. Beispiele von Mikroaufnahmen enthaltenden Proben mit unterschiedlichen Viruskonzentrationen sind in Figur 7 dargestellt. Ergebnisse aus früheren Studien legen nahe, dass Virus MicrobeVerhältnisse (VMR) reichen im Allgemeinen von 1 bis 50 in aquatischen Systemen 25-29, und in zwischen 3 und 20, mit einem Durchschnitt von etwa 6 in Korallenriffsystemen (Knowles unveröffentlichte Daten). Durchflusszytometrie Zusätzlich zu den direkten zählt und Größenabschätzung der mikrobiellen Gemeinschaft können Einschätzungen des Verhältnisses von autotrophen zu heterotrophen Mikroben über Durchflusszytometrie weiter von den gesammelten Proben extrahiert werden (beispielhafte Durchflusszytometrie in Abbildung 8 angegebenen Ausgang). Um die Anzahl der Gesamtbakterienzellen zu bestimmen, werden Proben mit SYBR Green I gefärbt und eine Photovervielfacherröhre mit einer 530/30 Bandpass-Filter wird zur Detektion verwendet. Ein Kanal für Chlorophyll (Rücken an Rücken LP Spiegel, was zu einer Reihe von 675 bis 735 nm) und Phycoerythrin (585/42 Bandpassfilter) wird verwendet, um die Fülle der autotrophs in ungefärbten Proben zählen. Um die Fülle der heterotrophen Mikroben, die autotrophen zählt von dem nicht festzustellen,Bunt Teil werden dann aus dem SYBR-gefärbten Gesamtkeimzahl (McDole et al. eingereicht) subtrahiert. Viral Metagenomics Viral Metagenomik nutzt eine kulturunabhängige molekular Ansatz zur viralen Ökologie, mit der gesamten genomischen Sequenzinformation zur Gemeinschaft Struktur und Funktion zu bestimmen. Metagenomics wurde Erweiterung der Kenntnisse über die Komplexität und Vielfalt der viralen Gemeinden auf lokaler 17 bis globaler Ebene 30. Die jüngste Entwicklung einer breiten Palette von bioinformatischen Tools für die Analyse von viralen metagenomische Daten Rechenengpässe verringert, so dass für eine umfassendere Sicht der der virosphere durch die Linse der Metagenomik. Die hier vorgestellten Methoden markieren die Isolierung und Anreicherung von Viruspartikeln aus Meerwasser unter Verwendung einer Kombination aus Vorfiltration mit großer Porengröße Nylon Netz um Schmutz und Zellmaterial zu entfernen, KonzentrationProben mit TFF (Figur 3) und eine anschließende Filtration 0,45 um zu größeren Zellen zu entfernen. Dieses Verfahren erzeugt etwa eine 100x konzentrierte Probe (5B-5E), die uns an nachgelagerte Prozesse in kleineren Volumina durchführen können. Um das Wachstum der verbleibenden mikrobiellen Zellen in der viralen Lysat zu verhindern und daher Änderungen in der viralen Hülle und Fülle der Probe während der langen Laufzeit zwischen Bodenstation und Labor wird oft Chloroform bis zu einer Endkonzentration von 2% für die Lagerung gegeben. Nach der Isolierung und Reinigung von VLPs, Epifluoreszenzmikroskopie mit Nukleinsäure-Farbstoffe, wie SYBR Gold werden verwendet, um das Vorhandensein und die Reinheit der Viruspartikel (5B-5E) zu verifizieren. Hier präsentieren wir zwei virale Metagenomen aus der südlichen Linie Insel Korallenriff, gesagt, die Starbuck (STAR7) und Millennium (CAR9; zuvor als Caroline bekannt) Inseln. Ein Gesamtvolumen von 120 L sample Wasser wurde von jedem Standort in einer Tiefe von 10 Metern erfasst und verarbeitet werden, wie in Kapitel 3.7 und 5.2 beschrieben. Die aus dem Cäsiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation gereinigt VLPs wurden 3,3 x 10 8 Teilchen / ml für CAR9 (5D) und 2,9 x 10 9 Partikel pro ml für STAR7, wie nach dem in Absatz 4 (5B) beschriebenen Verfahren überprüft. Die Gesamtmenge der DNA aus diesen Proben isoliert wurden, wurden etwa 400 ng, bezogen auf das Nanodrop Messung. DNA wurde mit Phi29 Polymerase amplifiziert und durch die Environmental Genomics Core Facility in 2011 sequenziert Die Eigenschaften der Sequenzdaten ist in Tabelle 1 dargestellt. Basierend auf Ähnlichkeitssuchen mit bestehenden Datenbanken, die Mehrheit (&gt; 70%) der Sequenzen oft landeten uncharakterisierte, dh unbekannter Herkunft und Funktionen. Ebenso sind die beiden hier dargestellten viromes präsentiert mehr als 97% der unbekannten Sequenzen. Als Ergebnis nicht-Datenbankabhängige Analyse wurde für die Analyse verwendet und eine neue Arm der Forschung Gelegenheit eröffnet auf der &quot;dunklen Materie&quot; im viralen Metagenomik (Seguritan et al. im Druck). Mikrobielle Metagenomics Die Analyse der mikrobiellen Metagenomen ermöglicht die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft und der Funktionsbeschreibung dieser Gemeinschaften. Beispiele dafür sind Schätzungen des Vorhandensein von Krankheitserregern und Virulenz 5,22 oder Vergleiche zwischen den Veränderungen in macrobial Gemeinschaftsstruktur oder verfügbaren Nährstoffe und Fülle von Arten und ihre vorherrschende Stoffwechselwege (Abbildung 9; Kelly et al 2014).. Wasserchemie Wasserchemie Parameter der Regel die umfangreichen analytischen Verarbeitung für den gewünschten Daten zu erzeugen; Proben für die DOC-Analyse wird über Hochtemperatur-katalytische Oxidation 31,3 gemessen werden2, partikulären organischen Substanz (POM) über Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie zu einem Elementaranalysator 33-35 und anorganische Nährstoffe von Flow Injection Analysis 36,12,37 verbunden. Nach einem erfolgreichen Abschluss aller Analysen werden in Tabelle 1 gezeigt Information verfügbar sein, um die Charakterisierung der mikrobiellen und viralen Gemeinschaften ergänzen. Diese Informationen können mit stabilen Isotopenverhältnisse des organischen Kohlenstoffs und Stickstoffproben ergänzt werden (siehe Haas et al. 35) und die Verhältnisse zwischen autotrophs und heterotrophs (McDole et al. Eingereicht). <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Übersicht über im Protokoll Abschnitt beschriebenen Methoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figu ansehen</a>re. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Probenbearbeitung rig Setup. Die Filtration Setup hier eingeführt (schematische Zeichnung nach links, eigentliche Bild rechts) ist nicht unbedingt erforderlich, um Proben zu erzeugen, sondern wird den Prozess deutlich beschleunigen. Der Aufbau besteht aus einer Grundplatte, auf der die Hatay Niskin Einheiten (1) montiert sind. Auf der Austrittsöffnung nach unten, werden Hatay Niskin Einheiten mit Silikonschläuchen der in-line-Filterhalter (2) verbunden ist. Diese lassen das abgetastete Wasserdurchlauf durch die jeweiligen Filter in die HDPE Probenahmefläschchen (3) montiert rechts unter. Der Filtrationsprozess wird durch Druckluft (4), und durch einen Druckmesser (5) geregelt beschleunigt. Ein Überlaufbecken verhindert Verschütten von Wasser während der Wechsel der HDPE Fläschchen oder POM Filtration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte</a>Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig3highres.jpg" /> Abbildung 3 Tangentialstromfilter Formation. Nylon (von Thurber et al. 19 modifiziert) Sieb filtriert Probenwasser wird aus dem Behälter (1) über eine peristaltische Pumpe (2) zu einer tangentialen Strömungsfilter (3) gepumpt. Die Messwasser wieder in den Vorratsbehälter (1) entlang der Rücklaufleitung (4) in der Abwesenheit von Gegendruck. Bei Gegendruck wird durch eine Schlauchklemme (5) an der Rücklaufleitung angelegt wird, gelangt Wasser durch den Filter und wird verworfen bzw. den Filtratbehälter (6) geliefert wird. Probenwasser ersetzt wird, wie es das Filtrat Linie konzentriert wird, bis das gesamte Probenwasser in den Schlauchleitungen konzentriert. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Objektträger Filtration Setup.Gleichmäßig zu verteilen DAPI und SYBR Gold-gefärbten Proben auf die jeweilige Matrix aus Aluminiumoxid-Filter (1), benötigen Filter, um zwischen dem Filterturm (2) und Schaft des Filtrationsverteilers mit einer Klemme (4) angeordnet und befestigt werden. Ein druckgeregelte Vakuum (5) wird die Filtrationsprozess (schematische Zeichnung oben, eigentliche Bild Bodenplatte) zu beschleunigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" /> Figur 5. Reinigung und Konzentration von Phagenpartikeln. Insgesamt 1 ml jeder Cäsiumchlorid-Dichtegradienten auf einander vor führt die vorbehandelten Probe (A) überlagert. Jede Schicht sollte außerhalb der Röhre markiert werden, um die Extraktion nach Ultrazentrifugation erleichtern. Rote Pfeil markiert, wo das Rohr wird auf ex durchstochen werdenTrakt des VLP-Fraktion. (BE) Mikroskopische Aufnahmen von Viruskonzentrate: Epifluoreszenz-Aufnahmen von 0,45 &amp; mgr; m filtriert repräsentativen Viruskonzentrate STAR7 (B) und CAR9 (D). Große Teilchen einschließlich Bakterienzellen wurden aus den 0,45 um-Filtrat von beiden STAR7 (B) und CAR9 (D) Proben sichtbar, während nur VLPs (weiße Pfeile) nach der Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation bleiben; Stern 7 (C) und CAR9 (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" /> Abbildung 6. Beispiel für DAPI und SYBR Gold-Mikrograph Analyse. Screenshot aus der Analyse von (A) DAPI und (B) SYBR Gold-gefärbten Objektträger Beispiel. (A) Länge und Breite (um) der markierten Teilchen(= Mikroben) kann mit Hilfe einer Bilderzeugungsprogramm bewertet werden. Beachten Sie die Aggregation in der Mitte des Bildes. Diese Cluster müssen von nachfolgenden Analyse ausgeschlossen werden. (B) Bei der Analyse von Viren und Bakterien müssen durch Größenschwellen in VLP und zellulären Größenbereiche (VLP rot, zelluläre grün) klassierte werden. Beachten Sie, dass es in der Regel einige schwache VLPs durch den jeweiligen Bildbearbeitungsprogramm Uncategorized. Diese VLPs als schwache weiße Punkte erscheinen muss manuell gezählt und addiert, um die automatisierten virale zählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" /> Abbildung 7. Konzentrationen SYBR Gold gefärbten Proben. Mikroskopische Aufnahmen einer 0,02 Aluminiumoxid-Matrix-Filter, die verschiedene Anzahlen von SYBR gefärbten Virusproben. Abbildung A zeigt afilter, die eine geeignete Menge an Meerwasser gefiltert, während die Konzentrationen auf dem Filter in B gezeigt zu hoch und in C für zuverlässige Werte zu niedrig sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" width="600" /> Abbildung 8. Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse Ausgang eines Riff-Wasserprobe. Panel (A) zeigt die Wassermolekül Grade nur mit gelb-grün fluoreszierende Mikrosphären (0,75 Mikrometer), verwendet werden, um eine minimale Hintergrund mit den Geräteeinstellungen zu überprüfen. Platte (B) zeigt das Ausgangssignal des Riffs Probe Lauf mit identischen Einstellungen und Layout wie in A. Man beachte, daß die Kügelchen immer noch an der gleichen Stelle mit mehreren Populationen von autotrophs gesehen werden, zusammen. (C) </strong&gt; Die gleiche Probe wie in (B), verwendet, um Back-Gate-Durchflusszytometer, Targeting SYBR positive Ereignisse (autotrophe + heterotrophen Zahl) und der Minimierung Hintergrund. (D) Der Vertreter Riff-Wasserprobe mit SYBR Green I. Mit Bunt die in (C) fest Gating wurden insgesamt Keimzahlen erzeugt und heterotrophen und autotrophen Mikroben durch Chlorophyll Autofluoreszenz partitioniert (siehe McDole et al. 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig8highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" width="600" /> Abbildung 9. Beispiel der mikrobiellen Metagenom Daten. Muster zwischen den mikrobiellen metagenomische Sequenzdaten und Ort abhängigen Variablen. Hier ist die relative Häufigkeit von Synechococcus </em&gt; spp. positiv mit der prozentualen Abdeckung von Korallen korreliert, während Pelagibacter spp. nicht (linke Felder). Der Stoffwechselweg zur konjugativen Transfer positiv mit Nitratkonzentrationen korreliert, während der Stoffwechselweg zur DNA-Reparatur war konsistent zwischen allen Metagenomen (rechte Felder). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131fig9highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Stern 7 </td><td> CAR9 </td></tr><tr><td> Gesamtzahl der Reads </td><td> 939.311 </td><td> 591.600 </td></tr><tr><td> Anzahl der vorverarbeiteten Liest </td><td> 579.664 </td><td> 360.246 </td></tr><tr><td> Mittlere Sequenzlänge (bp) </td><td> 395 ± 131 </td><td> 451 ± 159 </td></tr><tr><td> Kommentierte Sequenzen (%) </td><td> 42.218 (7,3%) </td&gt; <td> 9,117 (2,5%) </td></tr><tr><td> Unbekannt (%) </td><td> 537.446 (92,7%) </td><td> 351.129 (97,5%) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Daten Merkmale von zweirädrigen viromes aus den südlichen Line Islands, Starbuck und Millennium erzeugt. Der Grad der Annotation auf BLAT mit der MG-RAST Server. <img alt="Tabelle 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" width="700" /> Tabelle 2. Repräsentative Ergebnisse zeigen Daten aus verschiedenen Websites, während einer Expedition. Die hier zu beurteile Parametern gehören Wasserchemie Messungen gepaart mit mikrobiellen und viralen Häufigkeiten. Die Tabelle enthält weitere Dateinamen, die sich auf den jeweiligen metagenomische Daten für jede Entnahmestelle. Kohlenstoff und anorganischen Nährstoffkonzentrationen sind in mmol / L angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52131/52131table2.jpg" target="_blank">Bitte</a>Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Entwirren der unsichtbaren Spieler im Ozean - ein Feld Führer zu Wasserchemie und Marine Mikrobiologie

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

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Research

JoVE Journal

Environment

25.2K Aufrufe.  San Diego State University. Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments. 

Serie: Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Forschung

Umwelt

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Saubere Probenahme und Analyse von River und Estuarine Waters für Spurenmetallforschung

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VACUSIP eine verbesserte Inex Methode für<em&gt; In Situ</em&gt; Messung von partikulären und gelösten Verbindungen, die durch Active Suspension Feeders Verarbeitet

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of scientific publications address microplastic pollution of the sea surface. The protocol below describes the methodology for sampling, sample preparation, separation and chemical identification of microplastic particles. A manta net fixed on an &#187;A frame&#171; attached to the side of the vessel was used for sampling. Microplastic particles caught in the cod end of the net were separated from samples by visual identification and use of stereomicroscopes. Particles were analyzed for their size using an image analysis program and for their chemical structure using ATR-FTIR and micro FTIR spectroscopy. The described protocol is in line with recommendations for microplastics monitoring published by the Marine Strategy Framework Directive (MSFD) Technical Subgroup on Marine Litter. This written protocol with video guide will support the work of researchers that deal with microplastics monitoring all over the world.

The protocol below describes the methodology for: microplastics sampling on the sea surface, separation of microplastic and chemical identification of particles. This protocol is in line with the recommendations for microplastics monitoring published by the MSFD Technical Subgroup on Marine Litter.

Protokoll für die Mikroplastik Probenahme auf der Meeresoberfläche und Probenanalyse

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Controlled-release of Chlorine Dioxide in a Perforated Packaging System to Extend the Storage Life and Improve the Safety of Grape Tomatoes

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties of the pouch were monitored in containers with or without fruit. The pouch was affixed to the inside of a perforated clamshell containing grape tomatoes, and the effect on microbial population, firmness, and weight loss was evaluated during a 14 day storage period at 20 &#176;C. Within 3 days, the ClO2 concentration in the clamshells reached 3.5 ppm and remained constant until day 10. Thereafter, it decreased to 2 ppm by day 14. The ClO2 pouch exhibited strong antimicrobial activity, reducing Escherichia coli populations by 3.08 log CFU/g and Alternaria alternata populations by 2.85 log CFU/g after 14 days of storage. The ClO2 treatment also reduced softening and weight loss and extended the overall shelf life of the tomatoes. Our results suggest that ClO2 treatment is useful for extending the shelf life and improving the microbial safety of tomatoes during storage without impairing their quality.

Here, we describe a protocol for the application of a novel, slow-release ClO2 product that reduces spoilage and extends the shelf life of fresh fruit. The slow-release ClO2 product was added to standard commercial grape tomato packaging and tested against Escherichia coli and Alternaria alternata.

Zur kontrollierten Freisetzung von Chlordioxid in einem perforierten Verpackungssystem zu verlängern die Haltbarkeit und Verbesserung der Sicherheit von Tomaten, Trauben

A controlled-release chlorine dioxide (ClO2) pouch was developed by sealing a slurry form of ClO2 into semipermeable polymer film; the release properties ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment during manufacturing and transport. Because of their environmental persistence, they are widely distributed in the oceans and on beaches all over the world. They can act as a vector of potentially toxic organic compounds (e.g., polychlorinated biphenyls) and might consequently negatively affect marine organisms. Their possible impacts along the food chain are not yet well understood. In order to assess the hazards associated with the occurrence of plastic pellets in the marine environment, it is necessary to develop methodologies that allow for rapid determination of associated organic contaminant levels. The present protocol describes the different steps required for sampling resin pellets, analyzing adsorbed organochlorine pesticides (OCPs) and identifying the plastic type. The focus is on the extraction of OCPs from plastic pellets by means of a pressurized fluid extractor (PFE) and on the polymer chemical analysis applying Fourier Transform-InfraRed (FT-IR) spectroscopy. The developed methodology focuses on 11 OCPs and related compounds, including dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its two main metabolites, lindane and two production isomers, as well as the two biologically active isomers of technical endosulfan. This protocol constitutes a simple and rapid alternative to existing methodology for evaluating the concentration of organic contaminants adsorbed on plastic pieces.

Microplastics act as vector of potentially toxic organic contaminants with unpredictable effects. This protocol describes an alternative methodology for assessing the levels of organochlorine pesticides adsorbed on plastic pellets and identifying the polymer chemical structure. The focus is on pressurized fluid extraction and attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy.

Extraktion von Organochlor-Pestiziden aus Kunststoff-Pellets und Kunststoff-Typ-Analyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Construction of a Low-cost Mobile Incubator for Field and Laboratory Use

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water quality. However, commercially available incubators are often costly, difficult to transport, not flexible in terms of volume, and/or poorly adapted to local field conditions where access to electricity is unreliable. The purpose of this study was to develop an adaptable, low-cost and transportable incubator that can be constructed using readily available components. The electronic core of the incubator was first developed. These components were then tested under a range of ambient temperature conditions (3.5 &#176;C - 39 &#176;C) using three types of incubator shells (polystyrene foam box, hard cooler box, and cardboard box covered with a survival blanket). The electronic core showed comparable performance to a standard laboratory incubator in terms of the time required to reach the set temperature, inner temperature stability and spatial dispersion, power consumption, and microbial growth. The incubator set-ups were also effective at moderate and low ambient temperatures (between 3.5 &#176;C and 27 &#176;C), and at high temperatures (39 &#176;C) when the incubator set temperature was higher. This incubator prototype is low-cost (&lt; 300 USD) and adaptable to a variety of materials and volumes. Its demountable structure makes it easy to transport. It can be used in both established laboratories with grid power or in remote settings powered by solar energy or a car battery. It is particularly useful as an equipment option for field laboratories in areas with limited access to resources for water quality monitoring.

This paper describes a method for building an adaptable, low-cost and transportable incubator for microbial testing of drinking water. Our design is based on widely available materials and can operate under a range of field conditions, while still offering the advantages of higher-end laboratory-based models.

Bau eines Low-Cost mobilen Inkubator für Feld und Labor

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water ...