The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

HINWEIS: Bitte beachten Sie zusätzliche Materialien Abschnitt S1 für eine Liste von Definitionen. Die QS-Verfahren im Zusammenhang mit US-EPA-Methode 1615 sind in der ergänzenden Materialien Abschnitt S2 beschrieben. 1. Filter Elutionsverfahren <ol><li> Erste Elution <ol><li> Platzieren 500 ml gepufferter 1,5% Rindfleischextrakt, pH 9,0, auf Raumtemperatur erwärmt in einem Meßzylinder. Öffnen Sie die Filterpatronengehäuse und fügen Sie eine ausreichende Menge an Rindfleischextrakt die elektro Filter vollständig zu bedecken. Ersetzen Sie das Filtergehäuse Deckel und gießen Sie die verbleibenden Rindfleischextrakt in einen sterilen Becher. </li><li> Nach 1 min Kontaktzeit, vorbei an der Rindfleischextrakt-Lösung in dem Gehäuse zusammen mit dem in der sterilen Becherglas langsam durch den Filter verbleibende einen Druckbehälter oder peristaltische Pumpe. Sammeln Sie das Eluat in einen 2 l Becherglas. </li></ol></li><li> Zweite Elution <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1 zusätzlich 500 ml gepufferte 1,5% Rindfleischextrakt unter Verwendung von, Aber die Kontaktzeit bei Schritt 1.1.2 bis 15 min zu erhöhen. </li><li> Fügen Sie den Rindfleischextrakt aus der zweiten Elution mit dem 2-Liter-Becher, dass von der ersten Elution enthält. In einer sterilen Rührstab in den Becher. </li></ol></li></ol> 2. Organische Flockung Konzentrationsverfahren <ol><li> Sterilisieren eine Kombinationstyp pH-Elektrode mit 0,525% Natriumhypochlorit für mindestens 5 min. Spülen Sie die Elektrode mit sterilem dH 2 O und dann mit 0,05 M Natriumthiosulfat entchloren. Kalibrieren Sie den pH-Messgerät mit pH 4 und 7-Standards. </li><li> Das Becherglas, das Eluat auf einer Rührplatte enthält. Schalten Sie die Platte und erhöhen die Rührgeschwindigkeit bis ein Wirbel gebildet wird. </li><li> Der pH-Wert des Eluats auf 3,5 ± 0,1 langsam durch tropfenweise Zugabe von 1,2 M HCl zu dem Eluat. In der HCl tropfenweise, weil die schnelle Zugabe Virus inaktiviert. Während dieser Zeit wird das Eluat trüb wie ein Niederschlag zu bilden beginnt. </li><li> Reduzieren Sie die Misch speed zu einem langsamen Umrühren und dann weiter den pH-Wert des Eluats auf 3,5 ± 0,1 bei Raumtemperatur für 30 min zu überwachen und zu warten. </li><li> Gießen des ausgefällten Rindfleischextrakt Suspension in eine oder mehrere Zentrifugenflaschen und zentrifugieren für 15 min bei 2.500 × g bei 4 ° C. Entfernen der Flaschen aus der Zentrifuge und entweder ansaugen oder langsam der Überstand dekantiert, den Verlust des pelletierten Niederschlag zu verhindern. Überstand verwerfen. HINWEIS: Es kann unter Rindfleischextrakt viele in der Menge und Qualität der Niederschlag eine beträchtliche Variation sein. Der Niederschlag von einigen viel produziert wird sich auflösen schnell, während die aus anderen Chargen mit Schwierigkeiten löst. </li><li> 30 ml 0,15 M Natriumphosphat auf die Zentrifugenflasche den Niederschlag enthält. <ol><li> Verwenden 0,15 M Natriumphosphat, pH 9,0, für Ausscheidungen von Rindfleischextrakt viele, die innerhalb von 5 Minuten auflösen. Man rührt 10 min nach der Niederschlag vollständig aufgelöst ist, und dann gehen Sie sofort 2,7 Schritt. </li><li> Verwenden, 0,15 M Natriumphosphat, pH 7,0-7,5 für alle anderen Ausfällungen. Rühre 10-15 Minuten auflösen, oder schwieriger Niederschläge, brechen sie mit einem sterilen Spatel auf, indem wiederholt die Lösung nach oben ziehen und nach unten während des Rühren mit einer Pipette, durch den Niederschlag bei 160 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbitalschüttler, oder durch eine Kombination dieser Verfahren. HINWEIS: Wenn mehr als eine Zentrifugenflasche verwenden, kombinieren die Niederschläge unter Verwendung von weniger als 30 ml Natriumphosphat und verwenden Sie dann den restlichen Teil der 30 ml, die Flaschen zu spülen, nachdem die Niederschläge in eine Flasche oder Becher zu kombinieren. </li><li> Wenn der kombinierte Niederschlag in einem flachen Boden Zentrifugenflasche ist, einen Rührstab in die Flasche hinzu. Gehen 2.6.5 zu Schritt. </li><li> Wenn der kombinierte Niederschlag in einer Zentrifuge Flasche mit einem konischen Boden ist, überträgt sie in ein kleines Becherglas und fügen Sie dem Becher mit einem Rührstab. </li><li> Stellen Sie die Flasche oder Becher auf einem Magnetrührer, und rühren, bis die precipitate vollständig gelöst hat. </li><li> Re-Sterilisieren einer Kombinationstyp pH-Elektrode mit 0,525% Natriumhypochlorit und entchloren mit 0,05 M Natriumthiosulfat, wie in Schritt 2.1 beschrieben. Kalibrieren Sie den pH-Messgerät mit pH 7 und 10 Standards. justieren langsam den pH-Wert des vollständig gelösten Niederschlag auf 9,0 mit 1 M NaOH und dann rühren für 10 min. </li></ol></li><li> Entfernen Sie den Rührstab und Zentrifuge des gelösten Niederschlag 10 min bei 4,000-10,000 xg und 4 ° C. </li><li> Füllen Sie vorsichtig den Überstand in ein Becherglas, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie einen Rührstab in den Becher und das Pellet verwerfen. </li><li> Das Becherglas auf einem Magnetrührer, und rühren Sie die Lösung. Mit 1,2 M HCl tropfenweise, um den pH-Wert auf 7,0 bis 7,5 einzustellen. </li><li> Filter sterilisieren den Überstand durch Hindurchleiten durch einen Sterilfilter enthält ein Vorfilter, das mit 15 ml von 1,5% Rinderextrakt vorbehandelt wurde, 0,05 M Glycin, pH 7,0-7,5. </li><li> Assayprobe Volume (S) Berechnungen: <ol><li> Verwenden Sie die Gleichung 1 S für alle Testproben mit Ausnahme der Lab Fortified Blank und dem Lab Reagenzblindwert zu berechnen, <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> Gleichung 1 wobei D (Volumen der ursprünglichen Wasseruntersuchende Probe) für das Grundwasser 500 L ist, TSV (Gesamtprobenvolumen) ist das Volumen des Feldes durch die 5-Zoll-elektropositiveren Patronenfilter geleitet Probe vom Labor erhalten und FCSV (Final Konzentrierte Probenvolumen) nach Filtration wird das Volumen in Schritt 2.10. Ein Beispiel ist in ergänzenden Materialien Abschnitt S4.1 gezeigt. </li><li> Berechnen S für das Labor Fortified Blank (LFB, dh eine positive Qualitätskontrolle mit gesäten analysenreinem Wasser) und dem Labor Reagenzblindwert (LRB, dh eine negative Qualitätskontrolle unter Verwendung von analysenreinem Wasser) durch die FCSV multipliziert mit 0,3. </li></ol></li><li> Teilen Sie die FCSV in dree subsamples. <ol><li> Bereiten subsamples 1 und 2 mit einem Volumen gleich dem 1,04 - fachen der Assay Probenvolumen. Gefriert diese Teilproben bei oder unter -70 ° C, wenn sie nicht die gesamte kultivierbare Virus-Assay analysiert werden können unter Verwendung von (Subsample 1, Schritt 4) oder verarbeitet für die molekulare Assays (nicht dargestellt) innerhalb von 24 h; Andernfalls halten bei 4 ° C. </li><li> Einfrieren des Restvolumens (Subsampling 3) bei oder unter -70 ° C. </li></ol></li><li> Berechnen Sie die Inokulum Volumen durch die S dividiert durch 10. </li></ol> 3. Gesamt kultivierbaren Virus Quantal Assay Hinweis: Für alle Schritte immer Lösungen hinzufügen sorgfältig Störung der Zellschicht zu vermeiden. <ol><li> Dekantieren oder absaugen Medien von Testgefäßen eine Monoschicht von BGM-Zellen bei 3-6 Tage nach der Spaltung enthält, und dann ein Volumen von ausgeglichener Salzlösung gleich den Medien entfernt hinzuzufügen. </li><li> Dekantieren oder die ausgewogene Salzlösung aus der Zellkultur te aspirierenst Gefäße verwendet werden und dann die Zellkultur-Testgefäße impfen <ol><li> Impfen 10 Testgefäße für jede Testprobe mit einem Volumen von Substichprobe 1 gleich dem Inokulum Volumen zusammen mit der gesamten kultivierbaren Virus quantal Testkontrollen (ergänzende Materialien Abschnitt S2.4). </li><li> Für die LFB und dem Lab Befestigte Probenmatrix (LFSM, dh ausgesät Wassermatrixprobe), bereiten 5-, 25- und 125-fachen Verdünnungen unter Verwendung von Unterabtastungs 3 und 0,15 M Natriumphosphat, pH 7,0-7,5 als Verdünnungsmittel. Ein Beispiel für ein Verfahren, um die Verdünnungen zur Herstellung wird in ergänzenden Materialien Abschnitt S3 gegeben. Impfen 10 gewaschen Zellkulturtestgefäße für jede Verdünnungsreihe 3.2.1 Inokulum Volume auf jedem Testgefäß zusätzlich zu den Gefäßen beimpft mit unverdünntem Subsample in Schritt 1 verwendet wird . </li><li> Für jede Testprobe von Schritt 3.2.1 (andere als die geimpft in Schritt 3.2.2), die CPE in allen 10 Wiederholungen nach 14 Tagen der Inkubation hat (siehe Schritt 3.3), prepare 5-, 25- und 125- und 625-fachen Verdünnungen von Substichprobe 3. Inoculate 10 gewaschen Zellkulturtestgefäße für jede Verdünnungsreihe ein Inokulum Volume auf jedem Testgefäß zusammen mit einem neuen Satz des gesamten kultivierbaren Virus quantal mit Testkontrollen (ergänzende Materialien Abschnitt S2.4). </li><li> das Inokulum über die Oberfläche der Zellmonolayern verteilen, indem die Gefäße hin und her kippen. Inkubieren Sie die Testgefäße bei Raumtemperatur für 80 bis 120 min auf einem mechanischen Schüttler bei 1-5 Schwingungen / min oder mit alle 15-20 min von den Gefäßen rocking jeder Virus zu ermöglichen anwesend Zellen zu adsorbieren. </li><li> In vorgewärmten Erhaltungsmedium, und dann brüten die Testgefäße bei 36,5 ± 1 ° C. </li></ol></li><li> Geben Sie für das Auftreten von CPE in jedem Testgefäß mit einem Mikroskop täglich für die ersten 3 d und anschließend untersuchen sie alle 2-3 Tage bis zum Tag 14. Übertragung alle Testgefäße, die ≥75% CPE zu einem Gefrierschrank zeigen auf oder eingestelltunter -70 ° C. Frieren Sie alle verbleibenden Kulturen und die gesamten kultivierbaren Virus quantal Testkontrollen bei oder unter -70 ° C, nachdem die Gefäße am letzten Tag der Prüfung. </li><li> Auftauen alle Kulturen und filtern ≥15% des Mediums aus jeder CPE-positiven Testgefäß durch ein 0,2 um Sterilfilter. Wenn das angegebene Volumen nicht durch den Filter aufgrund einer Verstopfung, zentrifugieren, das Medium für 10 min bei 1,500-18,000 xg und 4 ° C vor der Filtration übergeben werden. </li><li> Führen Sie einen zweiten Durchgang aller 1. Durchgang Testgefäße mit gewaschenen BGM Testgefäße. <ol><li> Impfen der neuen Testgefäße mit einer Impfung Volumen, das 10% des aufgetauten Medium von allen negativen Testgefäße und aus dem gefilterten Mediums aus positiven Gefäße darstellt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4-3.4.3, aber frieren jede Testgefäß , das am 1. Durchgang und positiv am 2. negativ war , wie in Schritt 3.3 beschrieben. Führen Sie einen 3. PassAlter als für den 2. Durchgang beschrieben nur die negativen Testkontrollen und Zellkulturen , die während des 1. Durchgang und positiv in der 2. Passage negativ waren. </li></ol></li><li> Identifizieren Sie einzelne Testgefäße als Virus positiv , wenn sie CPE zeigen sowohl in der 1. und 2. Passagen oder in dem Fall , in dem CPE erst in der 2. Passage auftritt, sowohl in der 2. und 3. Passagen. </li><li> Verwenden Sie USEPA Most Probable Number Rechner mit den Standard - Programmeinstellungen festgelegt , wie in Tabelle S2 gezeigt , um die Virus - Titer aller Testproben zu berechnen. <ol><li> Geben Sie die Anzahl der Virus positive Wiederholungs Prüfgefäßen aus Schritt 3.6 für jede Testprobe in den Rechner der MPN / ml Wert (M ml) und die obere (CL uml) und unteren (CL LML) 95% Vertrauensgrenzen / ml - Werte zu bestimmen . </li><li> Obtain der MPN / L - Wert (M L) des entsprechenden Testprobe 2 unter Verwendung der Gleichung. <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> Gleichung 2 M ml ist die MPN / ml Wert in Schritt 3.7, S ist der Assay Probenvolumen und D ist das Volumen der ursprünglichen Wasseruntersuchende Probe. </li><li> Berechnen Sie die obere Vertrauensgrenze / L durch den CL uml Wert für den M mL Wert ersetzt wird . Berechnen Sie die untere Vertrauensgrenze / L durch den CL LML Wert für den M mL Wert ersetzt wird . Eine Beispielrechnung wird in ergänzenden Materialien Abschnitt S4.2 gezeigt. </li><li> Bericht M mL Werte von 0 als ≤ 1 / D. Zum Beispiel, ≤ 0,002 MPN / L (≤ 1/500 L) für Grundwasserproben. </li><li> Berechnen Sie die MPN und 95% Vertrauens Grenzwerte für die einzelnen Lab Befestigte Blank und Lab ReAgent Blank , indem zuerst die Werte / ml in den Rechner durch S erhalten multipliziert und dann um 0,3 das Ergebnis geteilt wird . </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

USEPA - Methode 1615 wurde während der ungeregelten Contaminant Überwachung Verordnung des dritten Überwachungszyklus (UCMR3) 17 und in erster Linie für den Einsatz entwickelt zur Messung der Virus Auftreten im Grundwasser. Es teilt sich eine Reihe gemeinsamer Schritte mit der Informationssammlungsregel (ICR) Methode, 15,18 aber hat zwei kleine Unterschiede. Beide verwenden quantal Assays Virus, das CPE produzieren auf BGM-Zellmonolayern mit Quantifizierung basiert auf Most Probable Number (MPN) Berechnungen zu messen. Verfahren 1615 erlaubt die Verwendung eines neueren elektro Filter für Virus aus verschiedenen Wasser Matrices konzentriert und reduziert die Anzahl von Zellkultur Prüfgefäß repliziert pro Verdünnung von 20 bis 10. Sowohl kleinere Änderungen Gesamtverfahren Kosten zu senken. Die Verringerung der Anzahl der Wiederholungen verringert Arbeit, sondern führt zu einer geringfügig niedrigeren Nachweisgrenze. Obwohl Grundwasser niedrigere Konzentrationen des Virus zu erwarten ist als die Oberflächengewässer, 19,20 the Menge getestet der Probe ist das Fünffache des Oberflächenwassers, für die Unterschiede teilweise kompensiert wird. Die Verwendung von weniger Wiederholungen wird für die meisten Oberflächengewässer angemessen sein, aber einige werden die Probenverdünnung erfordern. Methode 1615 hat mehrere kritische Schritte und Einschränkungen. Rindfleisch Extrakte variieren von Charge zu Charge. Jede Partie sollte für die Wirksamkeit des Virus Elution und die Fähigkeit zur Viruskonzentration durch die sekundären Konzentrationsstufen getestet werden, wie ergänzende Materialien Abschnitt S2.3 ist. Das Verfahren verwendet genaue Formeln für die Menge der Probe auf die Berechnung BGM-Zellkulturen zu inokulieren und Virustiter zu bestimmen. Ungenaue Ergebnisse werden erzeugt, wenn diese Formeln sind nicht streng befolgt. Eine aseptische Technik muss für die Aufrechterhaltung der Zellkulturen verwendet werden. Nicht infizierte BGM-Zellkultur-Steuerelemente, die Not während des Zeitraums von 14 Tagen Inkubation wahrscheinlich zeigen, weisen auf Probleme mit der Zellkultur Wartung. Große Sorgfalt muss auch taken während mit der Inokulation Schritte, das Pipettieren von und Medium neben Zellkulturflaschen Kreuzkontamination zu vermeiden. Die Qualitätskontrollen in ergänzenden Materialien Abschnitt S2 beschrieben sind, müssen streng befolgt werden. Abschnitt S2 bietet auch Ratschläge zur Fehlerbehebung für Qualitätsfragen. Der primäre Mechanismus der Virus Adsorptionsfilter zu elektropositiven ist eine auf die Stärke der positiven Ladung auf dem Filter und der Stärke der negativen Ladung &#39;Virus im Zusammenhang mit seinem isoelektrischen Punkt und dem pH - Wert des Wassers Belastung im Zusammenhang mit Interaktion 21 getestet. Elution von Filter wird auch durch die Stärke dieser Wechselwirkung beeinflusst. Weil sie unter den Virustypen und sogar zwischen Stämmen innerhalb derselben Art, die Elution von den Filtern unterschiedlich ist nicht einheitlich. Dies bedeutet, dass jedes Ergebnis kann die tatsächliche Höhe der Virus in Umwelt Gewässern unterschätzen. Die Verwendung der einzelnen BGM-Zelllinie unterschätzt auch Virus Auftreten. Die Reichweitevon Enterovirus , die CPE in dieser Zelllinie in erster Linie auf Polioviren und Enterovirus B Spezies Serotypen sowie einige Reoviren 14,15,22 begrenzt produzieren kann. Andere infektiöse Virustypen werden nicht erkannt. Poliovirus Einziehungen von Boden und Reagens - Qualität Wasser erfüllt die US - EPA - Methode 1615 Performance Akzeptanzkriterien für beide Leistungsbewertung (PE, dh Wasser ausgesät Reagenzqualität Proben mit Titern unbekannt einem Analysten, die die Leistung des Analytikers vor dem Start werden verwendet , um zu bewerten einer Studie) und LFB Proben (ergänzende Materialien Tabelle S1). Die 58% ige Rückgewinnung aus dem Grundwasser das Kulturverfahren unter Verwendung ist ähnlich wie die von anderen berichtet unter Verwendung von Leitungswasser 23,24. Die mittlere Rückgewinnung aus den LFB Proben von 111% mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 100% erfüllt auch die Akzeptanz Verfahren Leistungskriterien, obwohl sie höher sind als die für PE-Proben beobachtet during der ICR. ICR bedeuten Ring Erholung 56% mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 92%, während mittlere labor Einziehungen 36-85% variiert (CVs 58-131%; nicht veröffentlichte Daten aus der ICR-PE-Datenbank). Höhere Gewinnungsraten wurden in dieser Studie für niedrige Samen LFB Proben beobachtet als für höhere Samenproben (122 im Vergleich zu 42%). Zu der Zeit, dass die ICR geplant wurde, wurde erwartet, dass PE-Proben niedrigen Startwerte empfangen würden geringere Ausbeute haben, dass Bezieher hoher Samen. beobachtet hier für die LFB Proben, Erholung Poliovirus für ICR PE Proben waren 71% auf, die ähnliche (CV 100%), 54% (CV 69%) und 44% (71% CV) für Saatgut Werte ≤300 MPN, 300- 1500 MPN und&gt; 1500 MPN sind. Es gibt viele Methoden zur Messung infektiösen Virus in Wasserproben 25. Dieses Verfahren ist von Bedeutung in Bezug auf andere Verfahren, die in dem Grad der Standardisierung. Die Standardisierung umfasst nicht nur Qualität und Leistung steuert,sondern verwendet auch definierte Volumina und Formeln, um sicherzustellen, dass alle analytischen Laboratorien das Verfahren identisch durchführen. Ohne Standardisierung ist es schwierig, Ergebnisse in Laboratorien zu vergleichen und somit die Standardisierung ist wichtig, wenn, groß angelegte Studien in mehreren Analyselabors durchzuführen. Mit dem eingebauten in der Normung könnte diese Methode in Zukunft weiter ausgebaut werden, um zusätzliche Virustypen und Zelllinien umfassen. Forschungen im Gange Daten bereitzustellen für die Aufnahme von Adenoviren in die Methode.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Enteroviren sind eine heterogene Gruppe von Viren, die den menschlichen Darm-System zu infizieren, und die über die fäkal-oral übertragen werden. Diese Viren geben Oberflächen- und Grundwasser durch Kläranlage und Klärgrube Abwasser, nicht richtig konstruiert oder gebrochen Klärgruben, kaputte Abwasserleitungen, Mischwassereinleitungen und andere Punkt und Nicht-Punktquellen 1-4. Infektionen des Menschen und Krankheiten von Wasser Viren auftreten durch den Verzehr von kontaminierten oder unzureichend desinfizierte Wasser oder durch Freizeit-Wasserkontakt. Krankheitssymptome können leichte bis schwere Gastroenteritis einzubeziehen; Bindehautentzündung; Fieber; oberen Atembeschwerden; Hand, Maul- und Klauenseuche; Myokarditis; aseptische Meningitis; Enzephalitis; Lähmung; Sepsis 5-8 und Tod 9,10. USEPA-Methode 1615 sieht ein Verfahren vor infektiösen Partikel Enterovirus in der Umwelt- und trinken Wasser zu messen. Diese Gewässer kann ein enthaltenMischung von infektiösen und nicht-infektiösen Virionen, sondern nur die infektiösen Partikel stellen eine potentielle Gefahr für die Gesundheit. Infektiöse Viruspartikel verlieren Infektiosität im Laufe der Zeit in der Umwelt- und trinken Wasser aus dem Verlust von Protein - Kapsid Integrität, Schäden an Nukleinsäuren durch UV - Strahlung aus dem Sonnenlicht, und Schäden aufgrund irgendwelcher Desinfektionsmittel , die 11 bis 13 vorhanden sein können. Die gesamte Prozedur kultivierbaren Virus in dem Verfahren vorgesehen ist, bei der Herstellung von zytopathische Effekte (CPE) in der Buffalo Green Monkey Niere (BGM) Zelllinie basiert. Diese Zelllinie wurde aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Umwelt virology Feld gewählt 14,15, obwohl der Bereich von infektiösen Virustypen erkannt werden 15 hauptsächlich auf bestimmte Enteroviren beschränkt. Der Zweck dieses Papiers ist es Methode 1615 die Verfahren zur Elution von fünf Zoll elektropositiveren Patronenfilter, sekundäre Konzentration und Messung der gesamten kultivierbaren Viren zu beschreiben. Eine Auswertung derGesamtverfahren wird in Cashdollar et al. 16 beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:149px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Beef extract, desiccated powder</td>
			<td style="width:120px;">BD Bacto</td>
			<td style="width:143px;">211520</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic tubes</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">3775/945373</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hank&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">14170-112</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mechanical rocking platform</td>
			<td style="width:120px;">Daigger</td>
			<td style="width:143px;">EF4907G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">14-285-729</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing filter with prefilter</td>
			<td style="width:120px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">28143-295</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing syringe filter</td>
			<td style="width:120px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">431219</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">pH Standards</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">33643, 33646, 33648</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">M1018 or M4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Leibovitz L-15</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium bicarbonate, 7.5%</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin, EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. ii. total culturable virus assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Das Virus wurde von der Quelle Grundwasser von drei Trinkwasseraufbereitungsanlagen konzentriert und ein eigener Brunnen mit elektro Filter. Zwei Probensätze, bestehend aus einem Feldprobe und LFSM Kontrolle wurden von den Kläranlagen zu verschiedenen Gelegenheiten gesammelt, und ein Probensatz wurde aus dem eigenen Brunnen gesammelt. Insgesamt Virus Erholung wurde von einer Pflanze und eine Probe von einem anderen aus der Berechnung ausgeschlossen wurden unter Verwendung von LFSM Proben aus zwei der Pflanzen und der privaten Brunnen (zwei Proben bestimmt, da der MPN-Wert des Saatguts mit jeder Probe verwendet nicht genau wegen ermittelt werden konnte abnorme CPE Ergebnisse unter Wiederholungs Kolben). Bedeuten Poliovirus Erholung von Grundwasserproben gemittelt 58% mit einem Variationskoeffizienten von 79% (2) 16. Kein kultivierbaren Virus wurde in einem der doppelten ungeimpfte Grundwasser Feldproben nachgewiesen. Leistungsmerkmale der Methode wurde auch unter Verwendung von LFB s gemessenspiele geändert durch zwei verschiedene Samen Ebenen verwenden. Es wurde ein &quot;low&quot; Titer von 300 MPN von Poliovirus verwendet wurde, die Leistung auf einem Niveau zu bewerten, weniger als die &quot;Standard&quot; 500 MPN LFB Ebene in USEPA Methode 1615. A &quot;hoch&quot; Titer von 1000 MPN von Poliovirus verwendet Leistung bei der zu testen Pegel der LFSM Kontrolle. Diese Kontrollen in ähnlicher Weise mit einer durchschnittlichen Wiedergewinnung von 111% und einem Variationskoeffizienten von 100% (Abbildung 2). Alle LRB Proben waren negativ , und alle LFB Proben innerhalb der Akzeptanzbereich (ergänzende Materialien Tabelle S1) durchgeführt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Abbildung 1. Filter Elution. Ein Schema für die Verwendung eines Druckbehälters für Patronenfilter Elution gezeigt. Positive Luftdruck wird verwendet, um Rindfleischextrakt Lösung im Druckbehälter durch das Kassettengehäuse con drückenTaining die elektroPatronenFilter. Eine peristaltische Pumpe kann für den Druckbehälter ausgewechselt werden, wobei der Einlass der Pumpe in den Behälter des Rindfleischextrakt Lösungsaufnahme gelegt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mittlere Poliovirus Recovery (%) von Boden und Reagenz-Grade Wasser. Die mittlere prozentuale Ausbeute für Poliovirus vom Boden gezeigt wird ( <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) und analysenreinem Wasser ( <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) Proben. Die zwölf Reagenzqualität Wasserproben umfasste sechs ausgesät mit 300 MPN und sechs ausgesät mit 1000 MPN des Poliovirus. Fehlerbalken stellen Standardfehler.

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

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Research

JoVE Journal

Environment

8.7K Aufrufe.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Serie: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

Ein kleines Volumen Verfahren für Viral Konzentration von Wasser

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

Forschung

Umwelt

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VACUSIP eine verbesserte Inex Methode für<em&gt; In Situ</em&gt; Messung von partikulären und gelösten Verbindungen, die durch Active Suspension Feeders Verarbeitet

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

Optimierte Verfahren zur Bestimmung der Adsorption von Phosphonaten auf Granular Ferric Hydroxid mit einer miniaturisierten Phosphor Entschlossenheit Methode

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

Mikroplot-Design und Pflanzen- und Bodenprobenvorbereitung für 15Stickstoffanalysen

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

Elektrostatische Methode zur Entfernung organischer Partikel aus dem Boden

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The rhizosphere chemistry of wetland plants is particularly challenging to capture because of steep oxygen gradients from the roots to the bulk soil. Here a protocol is described that effectively preserves root structure and rhizosphere chemistry of wetland plants through slam-freezing and freeze drying. Slam-freezing, where the sample is frozen between copper blocks pre-cooled with liquid nitrogen, minimizes root damage and sample distortion that can occur with flash-freezing while still minimizing chemical speciation changes. While sample distortion is still possible, the ability to obtain multiple samples quickly and with minimal cost increases the potential to obtain satisfactory samples and optimizes imaging time. The data show that this method is successful in preserving reduced arsenic species in rice roots and rhizospheres associated with iron plaques. This method can be adopted for studies of plant-soil relationships in a wide variety of wetland environments that span concentration ranges from trace-element cycling to phytoremediation applications.

We describe a protocol to sample, preserve, and section intact roots and the surrounding rhizosphere soil from wetland environments using rice (Oryza sativa L.) as a model species. Once preserved, the sample can be analyzed using elemental imaging techniques, such as synchrotron X-ray fluorescence (XRF) chemical speciation imaging.

Eine Methode zur Erhaltung von Feuchtgebietswurzeln und Rhizosphären für die Elementarbildgebung

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...