Name: the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
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Die Autoren danken Prof. Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, und Dr. Serge Lyaschenko für hilfreiche Gespräche.

Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Konjugation von DFO-NCS bis J591 <ol><li> In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2-5 mg / ml-Lösung von J591 in 1 ml von entweder 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) oder 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4). </li><li> Löse DFO-NCS in trockenem DMSO in einer Konzentration zwischen 5-10 mM (3,8 bis 7,6 mg / ml). Mit Ultraschall oder Wirbel die Lösung sorgfältig durch, um eine vollständige Auflösung zu erleichtern. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 8,8-9,0 J591 durch Zugabe kleiner Aliquots (&lt;10 &amp; mgr; l) von 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Nachdem die Antikörperlösung in der richtigen pH, einen Volumen des DFO-NCS-Lösung entsprechend einem 3-4-fachen molaren Überschuß des bifunktionellen Chelators. <ol><li> Zur Prüfungweise hinzuzufügen 4-5 ul einer 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-Lösung (40,4 nmol DFO-NCS) zu 1 ml einer 2 mg / ml J591 Körperlösung (13,3 nmol J591). Die Menge an DMSO im fertigen wäßrigen Reaktionsmischung sollte 2% v / v nicht übersteigen. </li></ol></li><li> Inkubieren der Reaktion für 30 Minuten bei 37 ° C auf einem Heizblock Rühren bei 350 Upm. </li><li> Nach 1 h bei 37 ° C, Reinigen des resultierenden Immunkonjugat mit einem vorverpackten Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung von 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4) als Elutionsmittel. Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen J591-DFO Konstrukt ergeben. </li><li> Messung der Konzentration des J591-DFO Konstrukt auf einem UV-Vis-Spektrophotometers. </li><li> Wenn eine höhere Konzentration des Konstrukts gewünscht wird, konzentrieren die J591-DFO Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off. </li><li> Bewahren Sie die Lösung des fertigen J591-DFO Immunkonjugat bei -20 ° C im Dunkeln. </ol> 2. Radiomarkierung J591-DFO mit 89 Zr VORSICHT: Dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte oder bei anderen Arbeiten mit Radioaktivität Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Schritte unternommen werden sollten, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. HINWEIS: Im Interesse einer ordnungsgemäßen radiochemische Hinweis Haltung, sollte die Menge an Radioaktivität in der Probe unter Verwendung einer Dosiskalibrator gemessen und aufgezeichnet werden vor und nach den Schritten von 2,2 bis 2,13 in der folgenden Protokoll. Dies wird mit der genauen Bestimmung der radiochemischen Ausbeuten und spezifischen Aktivitäten zu helfen. <ol><li> Es wird eine Lösung von 0,5-2,0 mg J591-DFO in 200 ul 0,5 M HEPES-Puffer, pH 7,5. </li><li> Pipettieren Volumen des &lt;sup&gt; 89 Zr 4+ Stammlösung (in der Regel in 1,0 M Oxalsäure im Lieferumfang enthalten), entsprechend 1,0 bis 6,0 mCi (37-222 MBq) in ein 2-ml-Plastik Schraubverschluss Reaktionsgefäß. Stellen Sie die Lautstärke dieser Lösung auf insgesamt 300 ul mit 1,0 M Oxalsäure. </li><li> Den pH-Wert des 89 Zr 4+ Lösung auf 6,8-7,5 unter Verwendung von 1,0 M Na 2 CO 3. Beginnen durch Zugabe von 250 ul 1,0 M Na 2 CO 3 zu dem 89 Zr 4+ Lösung und anschließend Hinzufügen kleiner (&lt;10 ul) Aliquots von Base, um den gewünschten pH zu erreichen. </li><li> Fügen Sie die gewünschte Menge des pH-eingestellten 89 Zr 4+ Lösung der J591-DFO-Lösung in Schritt 2.1 vorbereitet. </li><li> Der pH-Wert des Radiomarkierungsreaktionsgemisch zu gewährleisten, dass sie innerhalb des gewünschten Bereichs von 6,8-7,5 fällt. </li><li> Inkubieren der Radiomarkierungsreaktion 60 Minuten lang bei RT auf einer Rührwerkskugelmühle Heizblock bei 350 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach 60 min Inkubation, messen Sie den radiolabeling Ausbeute der Reaktion mit radio TLC. <ol><li> Hierzu Spot 1 uCi Radiomarkierungsreaktionsmischung auf einem Kieselsäure-TLC imprägnierten Streifen. Lassen Sie den aliquoten trocknen, führen Sie den TLC unter Verwendung eines Elutionsmittels von 50 mM DTPA (pH 5,5) und analysieren die TLC Streifen mit Hilfe eines Radio-TLC-Scanner. 89 Zr 4+ mit dem J591-DFO Konstrukt gebunden wird am Ursprung angezeigt (R f &lt;0.1), während die freien 89 Zr 4+ Kationen werden von DTPA Chelat werden und wird mit der Lösungsmittelfront (Rf eluieren&gt; 0,9). </li><li> Berechnen der Radiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Integrieren des Radiochromatogramm, indem die Fläche unter der Kurve von R f 0,0-0,1 durch die gesamte Fläche unter der Kurve, multipliziert mit 100. </li></ol></li><li> Wenn die Radiomarkierungsausbeute ausreicht (typischerweise eine theoretische spezifische Aktivität von&gt; 2 mCi / mg) Die Reaktion wird mit 5 ul 50 mM DTPA, pH 5,5. </li><li> Man reinige den resultierenden Immunkonjugat using eine vorverpackte Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung eines Elutionsmittels von entweder 0,9% sterile Kochsalzlösung mit 5 mg / ml Gentisinsäure oder 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure . Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugats ergeben. </li><li> Nach der Reinigung, überprüfen Sie die radiochemische Reinheit der 89 Zr-DFO-J591 mit Radio-TLC wie in Schritt 2.7 beschrieben. </li><li> Berechnen der Gesamtradiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Dividieren der Menge an Aktivität zu Beginn auf die Antikörperlösung durch die Menge an Radioaktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat getrennt zugegeben. </li><li> Berechnen Sie die endgültige spezifische Aktivität durch Dividieren der Menge an Aktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat isoliert von der Ausgangsmasse der DFO-J591 in der Radiomarkierungsreaktion. </li><li> Wenn eine höhere Konzentration gewünscht wird, konzentrieren the 89 Zr-DFO-J591 Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off. HINWEIS: Die Gentisinsäure im letzten Reinigungsschritt verwendet wird, ein radioSchutz verwendet, um den Abbau des Antikörpers durch Radiolyse minimieren 46 Während die Speicherung des 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat für bis zu 48 Stunden bei 4 ° C. möglich ist, ist es nicht empfehlenswert. Wenn das Radioimmunkonjugat gespeichert werden soll, zu verwenden 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure als Pufferspeicher, um das Risiko von Hypochlorit-vermittelte Radiolyse minimieren. 47 </li></ol> 3. In-vivo-PET-Bildgebung mit 89 Zr-DFO-J591 ACHTUNG: Wie in Protocol Abschnitt 2 dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle possible Schritte sollten unternommen werden, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. <ol><li> Bei männlichen athymischen Nacktmäusen subkutan Implantat 5 x 10 6 LNCaP-Prostatakrebszellen und lassen diese zu einem 100-150 mm 3 Xenograft (3-4 Wochen nach der Beimpfung) wachsen. 44 </li><li> Verdünne das 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat auf eine Konzentration von 1,0 mCi / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung. </li><li> Injizieren 200 ul des 89 Zr-DFO-J591-Lösung (200 &amp; mgr; Ci; 7.4 MBq). In die laterale Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen 48 </li><li> Bei der gewünschten Abbildungs ​​Zeitpunkt (zB 12, 24, 48, 72, 96 oder 120 h post-Injektion), betäuben die Maus mit einer 2% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bett des Kleintier-PET-Scanner, und Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Untersuchung mit einem 1% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. Vor Inbetriebnahme des Tieres auf das Scanner-Bett, überprüfen Anästhesie mit dem Zehe-Pinch-Methode und apply Augensalbe für die Augen der Maus, um das Trocknen während einer Narkose zu verhindern. 49 </li><li> Erwerben die PET-Daten für die Maus über einen statischen Abtastung mit einem Minimum von 40 Millionen koinzident Ereignisse unter Verwendung eines Energiefensters 350-700 keV und eine Koinzidenzzeitfenster von 6 nsec. 50 </li><li> Nach Abschluss der Akquisition des Bildes, darf die Maus nicht unbeaufsichtigt zu lassen, und stellen Sie sie nicht in einem Käfig mit anderen Mäusen, bis sie wieder zu sich kam. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Während die Konstruktion, radioaktive Markierung, und Abbildung 89 Zr-DFO-beschriftet Radioimmunkonjugate ist in der Regel ein ziemlich einfaches Verfahren, ist es wichtig, ein paar wichtige Überlegungen bei jedem Schritt des Prozesses zu halten. Beispielsweise, wenn die wahrscheinlichste Ursache für Bedenken während der Konjugation Schritt der Prozedur ist die Aggregation des Antikörpers während der Konjugationsreaktion. Dieses Problem ist häufig ein Produkt von schlechter Vermischung der Konjugations...

Aufgrund ihrer bemerkenswerten Empfindlichkeit, Affinität und Selektivität wurden Antikörper langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen. Jedoch wurde ihre Anwendung in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) durch das Fehlen eines geeigneten Positronen emittierende Radioisotope für die Etikettierung behindert. 1-3 Einer der kritischsten Aspekte bei der Konzeption der Radioimmunkonjugate wird passend zum physikalischen Zerfall Halb Zeit des Radioisotops für die in vivo Pharmakokinetik des Antikörpers. Genauer gesagt wurden Antikörper oft relativ lang, mehrtägigen biologischen Halbwertszeit und müssen daher mit Radioisotopen mit vergleichbaren physikalischen Halbwertszeit gekennzeichnet sein. Für PET-Imaging-Anwendungen, haben Antikörper traditionell mit radioaktiv markiertem 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h), 86 Y (t 1/2 = 14,7 Stunden) oder 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 jedoch jedediese Radioisotope besitzt erhebliche Einschränkungen, die ihre Eignung für die klinische Bildgebung behindern. Während Radioimmunkonjugate mit 86 Y und 64 Cu beschriftet sind vielversprechend in präklinischen Untersuchungen nachgewiesen, beide Isotope besitzen physikalische Halbwertszeiten, die zu kurz, um effektiv für die Bildgebung beim Menschen sind. 124 I hingegen hat eine nahezu ideale physikalische Halbwertszeit für Bildgebung mit Antikörpern, aber es ist teuer und hat suboptimal Abklingeigenschaften, die relativ geringe Auflösung klinischen Bildern führen. Ferner können 124 I-markiertem Radioimmunkonjugaten Subjekt in vivo Dehalogenierung, ein Verfahren, das Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse senken kann. 6,7 Der Antrieb, ein Positronen emittierende Radioisotop zu 64 Cu, 86 Y ersetzen zu finden, und 124 I in Radioimmunkonjugate hat den jüngsten Anstieg der Forschung über 89 Zr-markierten Antikörpern angeheizt. 8-12 Ter Grund für die Einführung der 89 Zr ist einfach: das Radiometall besitzt nahezu idealen chemischen und physikalischen Eigenschaften für den Einsatz in diagnostischen PET Radioimmunkonjugate 13 89 Zr wird über die 89 Y (p, n) 89 Zr Reaktion auf ein Zyklotron mit einer produziert. im Handel erhältlich und 100% natürlich reichlich 89 Y Ziel. 14,15 Die Radiometall hat eine Positronen-Ausbeute von 23%, zerfällt mit einer Halbwertszeit von 78,4 Stunden und Positronen emittiert mit der relativ geringen Energie von 395,5 keV (Abbildung 1). 13,16,17 Es ist wichtig zu beachten, dass 89 Zr emittiert ebenfalls eine hohe Energie 909 keV γ-Strahl mit 99% Effizienz. Während dieser Emission nicht energetisch nicht mit den emittierten 511 keV Photonen, erfordert es zusätzliche Überlegung im Hinblick auf Transport, Handling und Dosimetrie. Trotz dieser Einschränkung, diese Zerfallseigenschaften letztlich bedeuten, dass 89 Zr hat nicht nur eine günstigere hAlf-Lebensdauer für die Bildgebung mit Antikörpern als 86 Y und 64 Cu kann aber auch erzeugen Bilder mit höherer Auflösung als 124 I, welche mit Positronen höheren Energien von 687 bis 975 keV und einer Anzahl von Photonen mit Energien innerhalb 100-150 keV emittiert die 511 keV Positronen erzeugt Photonen. 13. Darüber hinaus ist 89 Zr auch sicherer in der Handhabung und weniger teuer herzustellen und residualizes in Tumoren wirksamer als sein Gegenstück Radiojod. 18,19 Eine mögliche Einschränkung von 89 Zr ist, dass es keinen ein therapeutisches Isotopolog zB 86 Y (PET) vs. 90 Y (Therapie). Dies schließt die Konstruktion von chemisch identischen, Surrogat-Bildgebungsmittel, die als dosimetrische scouts für ihre therapeutischen Gegen eingesetzt werden können. Das heißt, Untersuchungen legen nahe, dass 89 Zr-markierten Antikörpern zu tun haben Potenzial als Bild Surrogate für 90 Y und 177 Lu-markierten Immunkonjugate.20,21 Vom chemischen Standpunkt aus als ein Metall der Gruppe IV, besteht 89 Zr als vier Kationen in wässriger Lösung. Die Zr 4+ Ion hoch geladenen, relativ groß (effektive Ionenradius = 0,84 Å), und kann als eine &quot;harte&quot; Kation klassifiziert werden. Als solches weist es eine Präferenz für die Liganden mit bis zu acht Fest anionische Sauerstoffdonatoren. Einfach die häufigste Chelator in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate verwendete Desferrioxamin (DFO), ein Siderophor-abgeleitete, azyklische Chelator, die drei Hydroxamatgruppen. Der Ligand stabil koordiniert den Zr 4+ Kationen schnell und sauber bei RT bei biologisch relevanten pH-Werten, und das erhaltene Zr-DFO-Komplex bleibt stabil im Laufe mehrerer Tage in Kochsalzlösung, Blutserum und Vollblut. 22 Computational Studien stark darauf hin, dass DFO bildet einen sechsfach koordinierten Komplex mit Zr 4+ in dem das Metallzentrum an die Drei Neut koordiniertral und drei anionische Sauerstoffdonoren des Liganden sowie zwei exogene Wasserliganden (Abbildung 2). 23,24 Die in vivo Verhalten Radioimmunkonjugate Einsatz der 89 Zr-DFO Konjugation Gerüst war im Allgemeinen sehr gut. Jedoch in einigen Fällen, Bildgebung und Biodistribution akuten Studien erhöhten Aktivität in den Knochen von Mäusen mit 89 Zr-markierte Antikörper injiziert wird, Daten, die zeigt, dass die osteophiles 89 Zr 4+ Kation aus der Chelator in vivo freigesetzt und anschließend mineralisiert ergab in den Knochen. 25 Kürzlich, insbesondere Liganden eine Reihe von Untersuchungen über die Entwicklung von neuartigen 89 Zr 4+ Chelatoren mit acht Sauerstoffspender sind in der Literatur erschienen. 24,26,27 Dennoch derzeit DFO ist die am weitesten verbreiteten Chelator mit großem Abstand in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate. Eine Vielzahl von unterschiedlichenBiokonjugation Strategien wurden angewendet, um den DFO Antikörper binden, einschließlich bioorthogonalen Click-Chemie, die Reaktion von thiolreaktiven DFO Konstrukte mit Cysteine ​​im Antikörper, und die Reaktion des aktivierten Esters tragenden DFO Konstrukte mit Lysinen in den Antikörper. 4,28- 30 leicht die häufigste Strategie jedoch ist die Verwendung von einem Isothiocyanat tragende Derivat von DFO, DFO-NCS (Abbildung 2). 22 Diese kommerziell verfügbaren bifunktionellen Chelator robust und zuverlässig stabile, kovalente Bindungen mit Thioharnstoff Lysine der Formen Antikörper (Abbildung 3). In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von 89 Zr-DFO-markierten Radioimmunkonjugaten in der Literatur berichtet worden. Präklinische Untersuchungen haben besonders reichlich gewesen, mit Antikörpern, die von der bekannteren Cetuximab, Bevacizumab und Trastuzumab mehr esoterischen Antikörper wie die CD105-Targeting-TRC105 und fPSA-Targeting 5A10. 30-36 In jüngerer Zeit sind eine geringe Anzahl von frühen Phase der klinischen Studien mit 89 Zr-DFO-markierte Antikörper in der Literatur aufgetaucht. Insbesondere Gruppen in den Niederlanden veröffentlichten Studien beschäftigt 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89 Zr-DFO-Ibritumomab-Tiuxetan, und 89 Zr-DFO-Trastuzumab. 21,32,37 Darüber hinaus eine Reihe von weiteren klinischen Studien mit 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate sind derzeit im Gange, einschließlich Untersuchungen hier am Memorial Sloan Kettering Cancer Center mit dem PSMA-Targeting 89 Zr-DFO-J591 für Prostata-Krebs-Bildgebung und die HER2-Targeting 89 Zr-DFO-Trastuzumab bei Brustkrebs Bildgebung. 23, 30 Darüber hinaus, während radiomarkierten Antikörpern bleiben die häufigsten 89 Zr-markierte Radiopharmaka, die Radio auch zunehmend mit anderen Vektoren, einschließlich Peptide, Proteine ​​und Nanomaterialien eingesetzt. 38-43 </sup&gt; Die Modularität dieser 89 Zr-DFO Kennzeichnungsmethode ist eine enorme Bereicherung. Das Repertoire der Biomarker-Targeting-Antikörper ist immer größer, und das Interesse an der Durchführung in vivo PET-Bildgebung mit diesen Konstrukten legt kräftig zu. Als Ergebnis, glauben wir, dass die Entwicklung standardisierter Verfahren und Protokolle können Sie das Feld profitieren. Eine ausgezeichnete schriftliche Versuchsprotokoll für DFO-NCS Konjugation und 89 Zr Radiomarkierung wurde bereits von Vosjan veröffentlicht, et al. 22 Wir sind der Meinung, dass die visuelle Demonstration von dieser Arbeit bereitgestellt könnte weiter helfen Ermittler neue zu diesen Techniken. In dem Protokoll bei Seits wird die Prostata-spezifischen Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung des 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugats,und (3) in vivo PET mit 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr]Zr-oxalate</td><td>Various, including Perkin-Elmer</td><td></td><td>Caution: Radioactive material</td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Cut into strips 0.5 cm wide</td></tr></tbody></table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

Die außergewöhnliche Affinität, Spezifität und Selektivität der Antikörper machen sie außergewöhnlich attraktive Vektoren für den Tumor gerichtet PET-Radiopharmaka. Aufgrund ihrer mehrtägigen biologische Halbwertszeit muss Antikörper mit Positronen emittierende Radionuklide mit relativ langen physischen Verfall Halbwertszeiten zu kennzeichnen. Traditionell sind die Positronen emittierende Isotope 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h) und 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h) wurden verwendet, um Antikörper zu beschriften PET-Bildgebung. In jüngerer Zeit jedoch hat das Feld eine dramatische Zunahme in der Verwendung der Positronen emittierende Radiometall 89 Zr in Antikörper-basierten PET-Bildgebungsmittel beobachtet. 89 Zr ist ein nahezu ideales Radioisotop für die PET-Bildgebung mit Immunkonjugaten, da sie eine physikalische Halb besitzt -Leben (t 1/2 = 78,4 Stunden), die mit den in-vivo-Pharmakokinetik von Antikörpern kompatibel ist und gibt eine relativ niedrige energy Positronen, die Bilder mit hoher Auflösung produziert. Außerdem Antikörper können unkompliziert mit 89 Zr mit dem Siderophor abgeleitete Chelator Desferrioxamin (DFO) gekennzeichnet werden. Bei diesem Protokoll wird die Prostata-spezifische Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung eines 89 Zr- DFO-mAb Radioimmunkonjugat, und (3) in-vivo-PET mit einem 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs.

Der erste Schritt bei diesem Protokoll die Konjugation DFO-NCS an den Antikörper ist typischerweise ziemlich robust und zuverlässig. Im Allgemeinen kann die gereinigte Chelator modifizierten Immunkonjugat in&gt; 90% Ausbeute erhalten werden, und unter Verwendung von 3 Moläquivalenten DFO-NCS in der Anfangs Konjugationsreaktion wird eine Anpassungsgrad-Markierung der Chelatbildner von etwa 1,0-1,5 DFO zu erhalten / mAb. Die 89 Zr radioaktiven Markierung und Reinigungsschritte des Verfahrens sind ebenfalls e...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Die Biokonjugation und Radiosynthese<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-markiertem Antikörper

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

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17.1K Aufrufe.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

Serie: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von<sup&gt; 125</sup&gt; I-markiertem Azide prosthetische Gruppe

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Forschung

Chemie

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Herstellung und Auswertung der<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-markierte Dreizähnige Chelate für Pre-Targeting Bioorthogonale Chemie

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Biotechnik

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

Pretargeted Radioimmuntherapie basierend auf die Inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder-Reaktion

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung des Zelltransports: Eine Methode der radioaktiven Markierung von Zellen

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

Krebsforschung

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Immunologie und Infektion

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is represented by the equilibrium dissociation constant, KD, and can be calculated as the concentration of antibody at which half the antibody binding sites are occupied at equilibrium. This method can be generalized to any radiolabeled antibody or other protein and peptide scaffolds. In contrast to cell-based methods, the choice of immobilized antigens is particularly useful for validating binding affinities after long-term storage of antibodies, distinguishing binding affinities of fragment antigen-binding region (Fab) arms in bispecific antibody constructs, and determining if there is variability in antigen expression between different cell lines. This method involves immobilizing a fixed amount of antigen to specified wells on a breakable 96-well plate. Then, nonspecific binding was blocked in all wells with bovine serum albumin (BSA). Subsequently, the rAb was added in a concentration gradient to all wells. A range of concentrations was chosen to allow the rAb to reach saturation, i.e., a concentration of antibody at which all antigens are continuously bound by the rAb. In designated wells without immobilized antigen, nonspecific binding of the rAb can be determined. By subtracting nonspecific binding from total binding in the wells with immobilized antigen, specific binding of the rAb to the antigen can be determined. The KD of the rAb was calculated from the resulting saturation binding curve. As an example, binding affinity was determined using radiolabeled amivantamab, a bispecific antibody for epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytoplasmic mesenchymal-epithelial transition (cMET) proteins.

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Here, a method is described to determine the binding affinity (KD) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens. KD is the equilibrium dissociation constant that can be determined from a saturation binding experiment by measuring the total, specific, and nonspecific binding of a radiolabeled antibody at various concentrations to its antigen.

Bestimmung der Bindungsaffinität (KD) von radioaktiv markierten Antikörpern gegen immobilisierte Antigene

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

Medizin

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

Source: Membreno, R., et al. <a href="https://www.jove.com/v/59041"> Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

Pretargeted Radioimmuntherapie: Eine Methode zur gezielten Verabreichung von therapeutischen Radionukliden an Tumore

Source: Membreno, R., et al.  Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (2019).
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Die Biokonjugation und Radiosynthese

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von

Herstellung und Auswertung der