Dieses Protokoll beschreibt, wie eine vorgezielte Methodik auf die gezielte Strahlentherapie von Krebsxenographen im Mausmodell angewendet wird. Die vorgezielte Radioimmuntherapie oder PRIT ermöglicht es uns, Antikörper und Radioligand getrennt zu injizieren und die beiden in vivo mit Klickchemie kombinieren zu lassen. Während wir PRIT mit einem Xenographenmodell von Dickdarmkrebs präsentieren, kann diese Technik auf jedes Oberflächenantigen angewendet werden, das auf Antikörper abzielt.
Es ist wichtig, ein Antigen zu wählen, das nicht schnell internalisiert oder ausgiebig vergossen wird, da diese die Wirksamkeit des Ansatzes reduzieren können. Zur Synthese von huA33-TCO wird zunächst eine 125-Mikroliter-Lösung von 40 Milligramm pro Milliliter TCO-NHS in trockenem Methylformamid in einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr vorbereitet. Diese Lösung kann aliquoted und bei 80 Grad Celsius für den Einsatz in zukünftigen Experimenten eingefroren werden.
In einem separaten 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr eine fünf Milligramm pro Milliliter Lösung von huA33 in einem Milliliter Phosphat gepufferter Saline zubereiten. Stellen Sie mit kleinen Aliquoten von 0,1 Mol-Natriumcarbonat den pH-Wert der Antikörperlösung auf 8,8 bis 9,0 ein. Verwenden Sie entweder pH-Papier oder ein pH-Messgerät mit einer Mikroelektrode, um den pH-Wert zu überwachen, und achten Sie darauf, dass der pH-Wert 9,0 nicht überschreitet.
Fügen Sie der Antikörperlösung ein Volumen hinzu, das 40 Moläquivalenz von TCO-NHS entspricht. Um eine Ausfällung des hydrophoben TCO-NHS zu verhindern, fügen Sie ihn langsam und mit Rührung hinzu. Lassen Sie die Reaktion bei 25 Grad Celsius auf einem thermischen Mischer für eine Stunde mit leichter Rührung inkubieren.
Bevor Sie das huA33-TCO-Immunoconjugat mit einer vorverpackten Einweg-Größenausschlussspalte reinigen, gleichnden Sie die vom Lieferanten beschriebene Größenausschlussspalte aus, um alle Konservierungsstoffe zu entfernen, die während der Lagerung in der Spalte vorhanden sind, wobei die Säule in der Regel fünfmal mit einem PBS-Volumen gewaschen wird, das dem Volumen der Säule entspricht. Fügen Sie das Reaktionsgemisch der Größenausschlussspalte hinzu und notieren Sie das Volumen des Reaktionsgemisches. Nachdem das Reaktionsgemisch in die Spalte eingedrungen ist, fügen Sie eine angemessene Menge an PBS hinzu, um das Gesamtvolumen der der Kolonne zugesetzten Lösung auf 2,5 Milliliter zu erhöhen.
Sammeln Sie das Produkt mit zwei Milliliter PBS als Eluent. Messen Sie die Konzentration des huA33-TCO mit einem UV-Visspektrophotometer, das die Wellenlänge bei 280 Nanometern überwacht. Wenn eine Lösung mit einer höheren Konzentration von Immunkonjugat gewünscht wird, konzentrieren Sie die huA33-TCO-Lösung mit einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000-Molekulargewichts-Cutoff nach Herstelleranweisungen.
Bewahren Sie das fertige huA33-TCO-Immunoconjugat bei 4 Grad Celsius im Dunkeln auf. Wenn es mehr als vier Tage in der Zukunft verwendet werden soll, lagern Sie es bei 80 Grad Celsius im Dunkeln. In einem 1,7 Milliliter Zentrifugenrohr fügen Sie 200 Mikroliter 0,25 Molaren-Ammoniumacetatpuffer auf pH 5,5 eingestellt hinzu.
Fügen Sie die gewünschte Menge Lutetium-177 Chlorid in die Pufferlösung ein. Die hinzugefügte Menge hängt von der Anzahl der Probanden im Experiment und den verabreichten radioaktiven Dosen ab. Tetrazin PEG7-DOTA in DMSO in das radioaktive Gemisch geben.
Der hinzugefügte Betrag hängt von der Anzahl der getesteten Probanden ab. Lassen Sie die Lösung bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten brüten. Überprüfen Sie, ob die Radioetikettierung vollständig ist, indem Sie die Radio-Instant-Dünnschicht-Chromatographie mit 50 Millimolar EDTA pH 5.5 als mobile Phase verwenden.
Das mit Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazin beschriftete Lutetium bleibt am Ausgangswert, während das freie Lutetium-177 von der EDTA koordiniert wird und mit der Lösungsmittelfront reist. Es ist wichtig, dass die Platzierung der subkutanen Tumoren Ihre Rückhaltetechnik nicht beeinträchtigt. Ich empfehle, sie auf der Flanke zu platzieren, die ihrer zurückhaltenden Hand entgegengesetzt ist.
Da ich mich mit meiner linken Hand zurückhalte, habe ich mich entschieden, die Tumore auf der rechten Flanke zu platzieren. Sortieren Sie weibliche athymische Nacktmäuse mit Darmkrebs-Xenographen, so dass das durchschnittliche Tumorvolumen in jeder Kohorte ungefähr gleich ist. Listen Sie dazu die Tieridentifikationsnummern, das Ohrkerbmuster und das Tumorvolumen in drei separaten Spalten eines Tabellenkalkulationsprogramms auf.
Sortieren Sie die Daten vom kleinsten zum größten Tumorvolumen. Weisen Sie in einer vierten Spalte jedem Tier eine Käfignummer zu. Radeln Sie in einem schlangenartigen Muster durch die Käfige, bis allen Tieren ein Käfig zugewiesen wird.
Sobald die Käfige zugewiesen sind, sortieren Sie die Daten nach Käfignummer. Um das Immunoconjugat zu entführen, dosisdosen von 150 Mikroliter huA33-TCO-Lösung in Spritzen vorbehandelt mit 1%rinderserum albumin in PBS, und lagern Sie diese Spritzen auf Eis. Um den Radioligand zu injizieren, ziehen Sie zuerst Dosen in 150 Mikroliter 0,9% steriler Saline mit 1,1 Moläquivalenz des radioaktiv markierten Tetrazin-PEG7-DOTA im Verhältnis zur Menge der verabreichten HuA33-TCO.
Verwenden Sie Sättel, um die längste Seite des längs verlaufenden Tumors sowie die Breite zu messen, die senkrecht zur Länge ist. Wiegen Sie jede Maus auf einem Gleichgewicht, um Gewichtszunahme oder Gewichtsverlust im Laufe der Zeit zu verfolgen. Berechnen Sie schließlich das Volumen mit der Formel für das Volumen eines Ellipsoids unter der Annahme, dass die Höhe ungefähr der Breite entspricht.
Hier ist die Biodistribution eines In-vivo-Pretargetings mit huA33-TCO und Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazin bei athymischen Nacktmäusen zu sehen, die subkutane SW1222-Human-Kolorektalkanor-Tumoren tragen. Alle Injektionsintervalle führen zu hohen Aktivitätskonzentrationen im Tumorgewebe sowie zu niedrigen Aktivitätskonzentrationen in gesunden Organen. Das 24-Stunden-Injektionsintervall bietet die höchste Tumoraufnahme nach 120 Stunden nach der Injektion.
Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde für die anschließende Längstherapiestudie ein 24-Stunden-Intervall gewählt. Gezeigt wird hier eine Längstherapiestudie an fünf Gruppen von Mäusen mit subkutanen SW1222-Tumoren, die im durchschnittlichen Tumorvolumen als Funktion der Zeit dargestellt sind, und Tumorvolumen normalisiert sich auf Anfangsvolumen als Funktion der Zeit. Es gibt einen krassen Unterschied in der Reaktion der experimentellen Kohorten im Vergleich zu den Kontrollgruppen.
Während die Tumoren bei den Mäusen, die nur eine Komponente der vorgezielten Strahlenimmuntherapie-Strategie erhielten, weiterhin unkontrolliert wuchsen, hörten die Tumoren der Mäuse, die das vollständige vorgezielte Radioimmuntherapie-Regime erhielten, auf zu wachsen und schrumpften schließlich. Wichtig ist, dass keine toxischen Nebenwirkungen beobachtet wurden, und alle Tiere hielten ein Gewicht innerhalb von 20% ihrer ursprünglichen Masse. Auffallend ist, dass die Mäuse der Versuchskohorten am Ende der Untersuchung eine perfekte Überlebensbilanz hatten.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es von größter Bedeutung, die Tumore genau und reproduzierbar zu messen. Wenden Sie sich bei der Arbeit mit Radioaktivität an den Strahlensicherheitsbeauftragten Ihrer Institution, um sichere Protokolle und Einrichtungen zu entwickeln. Mit geeigneten Sicherheitskontrollen wird Ihre Exposition begrenzt und Kontamination enden.
Pretargeting bietet eine niedrigere Strahlendosis für Hintergrundorgane als herkömmliche Strahlenimmuntherapie. Durch die Weitergabe dieses Protokolls hoffen wir, dass andere in der Lage sein werden, ihre eigenen Modelle und Ideen zu testen, die zu neuen und aufregenden Fortschritten für die Patientenbehandlung führen werden.
