This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

HINWEIS: Lieferanteninformationen für alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien ist in Tabelle 1 aufgeführt und Materialliste. Alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen, müssen steril sein, und aseptisches Verfahren entsprechend verwendet werden. Führen alle Kultur Inkubationen in einer befeuchteten 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator, sofern nicht anders angegeben. In diesem Protokoll werden alle Unterscheidungen in 6-Well-Platten durchgeführt, bei dem die hiPSCs ausgesät. Nach Differenzierung und Reinigung können Zellen dissoziiert und zur späteren Verwendung erneut plattiert werden. 1. Mittelvorbereitung <ol><li> Für die E8 Medium, stellen eine Stammlösung für jedes Medium Komponente (NaHCO 3, L-Ascorbinsäure-2-phosphat, Natrium-Selenit, Transferrin, Insulin, FGF2, TGFB1) und die Lösungen bei -20 ° C lagern. Fügen Sie entsprechende Menge an Stammlösungen in die Flasche DMEM / F12 und filtern, um zu sterilisieren. Die Lösung Konzentration und Reaktionsansatz für die Aktienkomponenten und E8 Medium kann in Tabelle 1 zu finden. </li><li> Für die extrazelluläre Matrix-Lösung, auftauen Basalmembranmatrix (allgemein bei 10 mg / ml enthalten) bei 4 ° CO / N. Matrigel ist allgemein für pluripotente Stammzellkultur verwendet werden, weil die menschliche pluripotente Stammzellen können auch auf dieses Material unter Verwendung des alpha-6-beta-1 Integrin 9 haften. Einmal aufgetaut, machen 2,25 mg (250 ul) Aliquots auf Eis mit eiskaltem Pipettenspitzen und Schläuche und die Aliquots bei -80 ° C. <ol><li> Wenn Vorbeschichtung Platten mit ECMS, auftauen und aliquotieren die extrazelluläre Matrix-Lösung (ECMS) auf Eis. Mischen Sie das ECMS und eiskalten DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200 auf Eis. Keep cool, um vorzeitige ECMS Erstarrung zu verhindern. </li></ol></li><li> Für die RPMI / B27 ohne Insulin Medium, 10 ml B27 Minus Insulin in 500 ml RPMI-Medium. </li><li> Für die RPMI / B27 (mit Insulin) Medium, 10 ml B27 Supplement (mit insulin) und 5 ml Pen-Strep-Antibiotikum in 500 ml RPMI-Medium. </li><li> Für den niedrigen Glucose-Medium, 10 ml B27 Supplement und 5 ml Pen-Strep Antibiotikum in 500 ml Glukose-freiem RPMI-Medien. </li><li> Das Einfrieren / Kryokonservierungsmedium mischen fötalem Rinderserum mit Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Verhältnis 9: 1. Das Einfriermedium kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden. Hinweis: alle Medien sollten gefiltert und gespeichert werden in 4 ° C und innerhalb von 2 Wochen verwendet werden, wenn nicht anders angegeben. Alle Reagenz / Lösungsvolumina unter Verwendung eines einzigen gut in einer 6-Well-Platte bestimmt, sofern nicht anders angegeben. </li></ol> 2. Pre-Beschichtung 6-Well-Platten mit ECMS <ol><li> Make ECMS durch Mischen Basalmembranmatrix (zB Matrigel) mit eiskaltem DMEM / F12-Medium in einem Verhältnis von 1: 200, dann gelten 2 ml frisch hergestellter ECMS in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Jedes der gut in einer 6-Well-Platte wird ca. 90 mg ECMS erhalten. </li><li> Inkubieren Sie die ECMS-beschichteten Platten für 1 h bei 37 ° C. Unmittelbar vor dem Beschichten Zellen, absaugen DMEM / F12-Lösung aus jeder Vertiefung. Die Platten werden dann bereit sind, Zellen zu empfangen. </li></ol> 3. Auftauen der Tiefkühl hiPSCs HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten hiPSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus führen. <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen hiPSCs für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml kaltem E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 &amp; mgr; M) für jedes Fläschchen. ROCK-Hemmer verbessert hiPSCs Überlebensrate nach Kryokonservierung 10. Die Durchstechflaschen im 37 ° C Wasserbad, um die Zellen, bis eine ca. 5 mm Durchmesser Eis Kristall überlassen auftauen. </li><li> Besprühen Sie die Außenseite der Fläschchen mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Fläschchen mit Seidenpapier, bevor er sie an den sterilen laminaren Haube. </li><li> Übertragen Sie die Zellen, in die vorbereitete konischen Rohr. Spülen ter einmal mit 500 ul E8 Medium Fläschchen und übertragen Sie das Medium, das die aufgetauten Zellen auf den gleichen konischen Rohr. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g. </li><li> Saugen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und sanft Zellpellet mit 2 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor (10 uM). Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit ECMS vorbeschichtet. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer nach 24 Stunden der Kultivierung. Die Zellen sollten bis zu diesem Zeitpunkt eingehalten haben. </li></ol> 4. Passagieren von hiPSCs <ol><li> Typischerweise Gang hiPSCs nach Erreichen 75% bis 80% Konfluenz in einer 6-Well-Platte. Saugen Sie das Kulturmedium. Waschen schnell Vertiefungen mit 1 ml sterilem, RT PBS. Absaugen PBS. <ol><li> Fügen Sie 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung (zB Accutase) und Inkubation für 1-7 min bei RT. Gegebener Zeit für EDTA Inkubation variiert mit der hiPSC Linie. Erwarten Sie, um zu sehen Curling o sehenr Verdickung Kolonien an den Rändern, da dieses anzeigt, daß EDTA oder Zellentfernungslösung bereit, entfernt werden. </li></ol></li><li> Saugen Sie das EDTA oder die Zellablösung Lösung. 1 ml der E8-Medium mit 10 &amp; mgr; ROCK-Hemmer ergänzt. Verdrängen hiPSC Kolonien in der auch durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollte in 5-10 Zellklumpen nach Abschluss gebrochen werden. </li><li> Übertragen Sie die Kolonien, die in 1 ml Medium mit E8 ROCK-Inhibitor in einen 15 ml konischen Röhrchen suspendiert sind. </li><li> Stören die große Zellklumpen in kleine Klumpen in der E8 Medium. Fügen Sie einen entsprechenden Volumen von E8 Medien mit Inhibitor der Zellsuspension, um die Zellen zu verdünnen. Das Medienvolumen, um die Verdünnung hinzuzufügen, hängt von der Zelldichte und die Zahl der Brunnen ausgesät werden. Im Idealfall sollte eine einzige, 80% konfluent auch von hiPSCs 01.12 verdünnt werden. <ol><li> Fügen Sie 11 ml Medium mit E8 ROCK-Hemmer zu den bestehenden 1 ml cell-Lösung in den oben erwähnten 15 ml konischen Röhrchen, um eine Verdünnung zu erhalten 01.12. </li></ol></li><li> Weitere verreiben die Zellklumpen in kleine Zellfragmente (etwa 50 bis 200 Zellen in jedem Fragment am besten). Vermeiden Sie zu Verreiben da dadurch das Überleben der Zelle. </li><li> Saugen Sie ECMS von den Pre-beschichteten Platten und 2 ml resuspendierten Zellen in jede Vertiefung. Etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ist ideal. Ziel ist es, die Zellen gleichmäßig um den gut verzichten zu Clusterbildung von Zellen, die in der Mitte der Vertiefung zu vermeiden. </li><li> Nach 24 Stunden der Kultivierung, ersetzen Sie das Medium mit E8 Medium ohne ROCK-Hemmer. Ändern Sie das Kulturmedium alle 24 Stunden, bis die Zellen zu 80% konfluent. Dann werden die Zellen wieder bereit, Durchgang. Es dauert normalerweise 3-6 Tage zwischen den Kanälen zu 80% konfluent. </li></ol> 5. Einfrieren hiPSCs HINWEIS: Eng an diese Vorgehensweise, wie sie können, um eine optimale Kultivierung und Differenzierung von nachgeschalteten Hüfte führenSCs in hiPSC-CMs nach dem Frost / Tau-Zyklus. <ol><li> Beschriften Sie Kryoröhrchen mit der Zelllinie Name, Zelltyp, Durchgang Nummer und Einfrieren Tag. Als allgemeine Richtlinie, verwenden Sie eine Flasche für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Vorbereiten einer 15 ml konischen Röhrchen mit 9 ml E8 Medium mit ROCK-Inhibitor (10 &amp; mgr; M) befüllt. Bereiten Gefriermedium mit 90% FBS und 10% DMSO, und halten Sie das Medium bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Saugen Sie das Kulturmedien, 500 ul 0,5 mM EDTA oder 1x Zellablösung Lösung und Inkubation für 2-7 min bei RT. Die Dauer der EDTA oder Zellentfernungslösung Belichtung variiert von Zelllinie zu Zelllinie. </li><li> Saugen Sie EDTA oder Zellablösung Lösung. 1 ml der E8 Medium. </li><li> Verdrängen hiPSC Kolonien in der gut durch Auf-und Abpipettieren und Spritz Kolonien mit einem P1000 Pipette. Kolonien sollten nicht in weniger als 100 Zellklumpen zerlegt werden. Übertragen Sie die suspendierten Zellen auf die vorbereitete konische Röhrchen mit E8. Zentrifuge bei RT für 4 min bei 200 x g. </li><li> Saugen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul kaltem Einfriermedium zu dem Pellet. Das Pellet pipettiert ein- bis zweimal. Das Überleben der Zellen ist, indem sie Zellen in großen Klumpen verbessert. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein beschriftetes kryogenen Rohr. Bewegen sich schnell die Fläschchen in einen Gefrierbehälter, Isopropanol, die allmähliche Abkühlung ermöglicht. Das Behältnis mit Zellen bei -80 ° C für 24 Stunden, dann übertragen die Zellen in flüssigen Stickstoff für die langfristige Lagerung. </li></ol> 6. Herz Differenzierung von humanen iPS HINWEIS: Alle Medien sollten mindestens bei Raumtemperatur, wenn hinzugefügt. <ol><li> Nach Dissoziation mit EDTA oder 1x Zellablösung Lösung, Samen rund 100.000 menschlichen iPS-Zellen auf ECMS beschichtete 6-Well-Kulturplatten zur Differenzierung (dieselben Schritte wie Zell Passagieren Verfahren). Wenn die Zellen bis 85% Konfluenz, ändern Sie die mittel- bis RPMI / B27 ohne Insulin-Medium mit 6uM GSK3-beta-Hemmer CHIR99021 (CHIR) und halten für 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden, ersetzen Sie den CHIR haltigen Kulturmedium mit RPMI / B27 ohne Insulin Medium und in Ruhe zu lassen für 24 Stunden (bis zum Tag 3). </li><li> Am Tag 3, ändern Sie die Medien, um RPMI / B27 ohne Insulin mit 5 uM Wnt-Inhibitor IWR1 und halten für 48 Stunden (bis zum Tag 5). HINWEIS: Wnt Hemmung kann auch unter Verwendung anderer Verbindungen mit kleinen Molekülen versucht werden, wie in früheren Studien 11 beschrieben. IWR1 wurde über andere kleine Molekül Wnt Inhibitoren wegen der erhöhten Bereich, in dem es sich gezeigt hat, bei der Hemmung der Wnt signal 11 werden ausgewählt. </li><li> Am Tag 5, ändern Sie das Medium wieder in RPMI / B27 ohne Insulin Medium und lassen für 48 Stunden (bis zum Tag 7). </li><li> Am Tag 7, ersetzen Sie das Medium mit RPMI / B27 Medium (mit Insulin) und ersetzen Medium alle 3 Tage danach mit dem gleichen Medium. Spontane Schlagen Kardiomyozyten zunächst sichtbar bei ca. 8. Tag zu Tag10. </li></ol> 7. Reinigung von humanen Kardiomyozyten durch Glucose Starvation <ol><li> Am Tag 10 nach der Differenzierung, ändern Sie das Medium in jeder Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen bis 2 ml niedrigen Glucose-Medium und Aufrechterhaltung der Zellen in diesem Medium für 3 Tage (bis zum Tag 13). </li><li> Am Tag 13, zurück Zellen RPMI / B27 Medium (mit Insulin). </li><li> Optional Ausstrich Kardiomyozyten vor der zweiten Runde der Glukose Hunger zu helfen, lösen nicht-Kardiomyozyten von der Kulturplatte, die ein einfacheres, Dissoziation von nicht-Kardiomyozyten während Glukose Hunger. <ol><li> Am Tag 13, absaugen Medium einmal mit PBS waschen und distanzieren die Zellen in einzelne Zellen unter Verwendung von 500 ul Zell Disassoziierung Enzyms für 5 min bei 37 ° C. Insbesondere wird nach 5 min der Enzymbehandlung, mit einem 1000 ul-Pipette Kardiomyozyten aus der 6-Well-Platte manuell dissoziieren durch wiederholtes Ziehen des Zell Disassoziierung Enzym und Sprühen gegen die cardiomyocyte Monolage. Bis zu 30 Pipettieren Wiederholungen erforderlich sein, um die Herzmuskelzellen in einzelne Zellen distanzieren werden. </li><li> Nachdem die Zellen dissoziiert und in Einzelzellform, sammeln sämtliche Zellen in einer 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin gefüllt, um für 4 min bei 200 x g verdünnt das Zell Disassoziierung Enzym und zentrifugiert. Absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit 2 ml RPMI / B27 Medium und der Platte auf einen neuen ECMS beschichteten 6-Well-Platte. Typischerweise höherer Konfluenz von Kardiomyozyten hilft bei der Zellüberleben bei Neubelegung. Ziel ist es, zwei Millionen Zellen pro neue 6-Well-Platte für optimale Überleben während Neubelegung Ausstrich. </li></ol></li><li> Am Tag 14, ändern Sie das Medium wieder in 2 ml niedrigen Glucose-Medium für eine zweite Glukoseentzug-Zyklus. Kultur die Zellen in diesem niedrigen Glukose Zustand für 3 Tage. Die meisten der nicht-Kardiomyozyten in diesem niedrigem Glucosekulturbedingungen sterben. </li><li> Am Tag 17, ändern Sie das Medium bis 2 ml RPMI / B27 Medium mit Insulin. Die verbleibenden Zellen werden hoch gereinigte Kardiomyozyten sein. Diese Kardiomyozyten zur Genexpressionsanalyse, Arzneimittel-Screening, metabolische Analyse und verschiedene andere Downstream-Assays verwendet werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

Erhalten einer großen Menge von hochgereinigtem hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten ist kritisch für die Grundherzforschung sowie klinische und translationale Anwendungen. Cardiac Differenzierungsprotokolle haben enorme Verbesserungen in den letzten Jahren, um Kleinmoleküle moduliert und Monolayer-basierte Methoden 5 unterzogen, den Übergang von Embryoidkörper-basierte Verfahren, die einen kardiogenen Wachstumsfaktoren 2, um Sandwichverfahren 12 Matrix und schließlich. Der vorstehend ...

Primäre humane Kardiomyozyten sind aufgrund der Erfordernis invasiver Herzbiopsien, Schwierigkeiten bei der Dissoziation einzelner Zellen und wegen der schlechten langfristige Überleben der Zellen in Kultur schwierig zu erhalten. Angesichts dieses Mangels an primären humanen Kardiomyozyten, patientenspezifischen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) Technologie als leistungsfähige Alternative Kardiomyozyten Quelle für die Grundlagenforschung als auch klinische und translationale Anwendungen wie Krankheit Modellierung und Droge angesehen Entdeckung ein. Frühe Bemühungen bei der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu Herzmuskelzellen verwendet Differenzierungsprotokollen mit Embryoidkörper (EB), aber dieses Verfahren ist nicht effizient bei der Herstellung von Herzmuskelzellen, da oft weniger als 25% der Zellen in einem EB schlagen Kardiomyozyten 2,3. Vergleichsweise, eine Monobasis Differenzierungsprotokoll unter Verwendung der Zytokine Aktivin A und BMP4 angezeigt einen höheren Wirkungsgrad als EBs, aberDieses Protokoll ist immer noch relativ ineffizient und erfordert eine teure Wachstumsfaktoren und funktioniert nur in einer begrenzten Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien 4. Vor kurzem wurde eine hocheffiziente, hiPSC Monolayer-basierte Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll durch Modulation Wnt / β-Catenin-Signalweg 5 entwickelt. Diese hiPSC-CMs auszudrücken Troponin T und Alpha Actinin, zwei sarkomerischen Proteine, die Standard-Marker von Herzmuskelzellen 6. Das Protokoll beschreibt hier ist eine Anpassung dieser niedermolekulare, Feeder zellfreie, Mono Differenzierung Verfahren 5,7. Wir sind in der Lage zu schlagen Kardiomyozyten aus hiPSCs nach 7-10 Tagen (Abbildung 1) zu erhalten. Jedoch nach einer Kardiomyozytendifferenzierung einer 50% schlagen Zellen, Immunfärbung zeigt einheitlich das Vorliegen einer Population von Nicht-Herzmuskelzellen, die negativ für Kardiomyozyten-spezifische Marker wie Herz-spezifisches Troponin T und alpha-Actinin sind. Um fueitere reinigen Kardiomyozyten und die Beseitigung nicht-Kardiomyozyten wurden heterogene differenzierten Zellpopulationen unterzogen, um Hunger, indem sie mit einem extrem niedrigen Glukosekulturmedium für mehrere Tage (Abbildung 2) Glukose. Diese Behandlung selektiv eliminiert nicht Kardiomyozyten aufgrund der Fähigkeit von Kardiomyozyten, aber nicht nicht-Kardiomyozyten, Lactat als Primärenergiequelle, um in einer niedrigen Glucoseumgebung 8 überleben metabolisieren. Nach diesem Reinigungsschritt wird eine 40% ige Zunahme im Verhältnis von Kardiomyozyten nicht Kardiomyozyten beobachtet (Figur 3, Figur 4) und der nachgeschalteten Genexpressionsanalyse, Krankheitsmodelle und Wirkstoff-Screening-Assays können diese Zellen verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CMs) sind zu einem wichtigen Zellquelle, um den Mangel an primären Kardiomyozyten für die Grundlagenforschung und translationale Anwendungen anzugehen. Um hiPSCs in Kardiomyozyten zu differenzieren, wurden verschiedene Protokolle wie Embryoidkörper (EB) -basierte Differenzierung und Wachstumsfaktor Induktion entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle ineffizient und sehr variabel in ihrer Fähigkeit gereinigt Kardiomyozyten erzeugen. Kürzlich wurde ein kleines Molekül-basierte Protokoll Verwendung Modulation Wnt / β-Catenin-Signalisierung wurde dargestellt, um die Herzdifferenzierung mit hohem Wirkungsgrad zu fördern. Bei diesem Protokoll, größer als 50% -60% der differenzierten Zellen Troponin-positiven Kardiomyozyten wurden konsequent beobachtet. Um Kardiomyozyten Reinheit weiter zu erhöhen, wurden die differenzierten Zellen unterzogen, um Hunger Glukose gezielt beseitigen Nicht-Kardiomyozyten auf der Grundlage der Stoffwechselunterschieds zwischen Kardiomyozyten und nicht-Kardiomyozyten. Unter Verwendung dieses Selektionsstrategie, die wir durchgängig erhalten eine Erhöhung des Verhältnisses der Herzmuskelzellen nicht-Kardiomyozyten größer als 30% in einer Population differenzierter Zellen. Diese hochgereinigtes Kardiomyozyten sollte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse von In-vitro-Krankheit Modellstudien und Wirkstoff-Screeningtests menschlichen iPS-basierten verbessern.

Die morphologischen Veränderungen während hiPSC Differenzierung. Die hiPSC in Feeder-freien Platten kultiviert wuchs als flache, zweidimensionale Kolonien. Bei Erreichen etwa 85% Konfluenz wurden hiPSCs mit 6 uM CHIR zur ​​Differenzierung (1A) behandelt. Erhebliche Mengen von Zelltod, eine normale und weit verbreitetes Phänomen, wurden nach 24 Stunden von CHIR Behandlung beobachtet. Nach zwei Tagen CHIR Behandlung die hiPSCs weiter in Richtung eines m...

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Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.4K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

Serie: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Die Differenzierung der Atrial Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen Mit dem BMP-Antagonisten Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.