This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

주 :이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약 벤더 정보가 표 1에 나열되어있다 및 재료 목록. 세포와 접촉하는 모든 솔루션과 장비는 멸균해야하며, 무균 기술 규격 제품을 사용한다. 달리 명시되지 않는 한 가습 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 모든 문화 배양을 수행합니다. 이 프로토콜에서, 모든 분화가되는 hiPSCs가 시딩 6- 웰 플레이트에서 수행된다. 분화 및 정제 후, 세포를 분해 할 수 있고, 다운 스트림 사용을 위해 플레이 팅. 1. 중간 준비 <ol><li> E8 매체의 경우, 각 미디어 구성 요소에 대한 스톡 용액 (NaHCO3을, L 아스코르브 산 -2- 포스페이트, 아 셀렌 산 나트륨, 트랜스페린, 인슐린, FGF2, TGFB1)을하고 -20 ℃에서 용액을 저장한다. DMEM / F12의 병에 원액을 적당량을 추가하고 소독 필터링합니다. 솔루션 CONCENTR주식 구성 요소 및 E8 매체에 대한 ATION 반응 설정은 표 1에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 세포 외 매트릭스 솔루션의 경우, 4 ° CO / N에서 (일반적으로 10 ㎎ / ㎖에서 제공) 기저막 행렬을 해동. 인간 다 능성 줄기 세포가 알파 -6- 일 - 베타 - 인테그린 9를 사용하여이 물질에 잘 부착 할 수 있기 때문에 마트 리겔은 일반적으로 다 능성 줄기 세포 배양에 사용된다. 일단 차가운 얼음 피펫 팁 및 튜브를 사용하여 얼음에 2.25 MG (250 μL) 분취 량을 -80 ℃에서 분취 량을 저장, 해동. <ol><li> ECMS으로 판을 프리 코팅 할 때, 해동 및 얼음에 세포 외 기질 용액 (ECMS)을 나누어지는. (1)의 비율로 ECMS 빙냉 DMEM / F12 배지 믹스 : 얼음 200. 조기 ECMS 응고를 방지하기 위해 저온으로 유지하시오. </li></ol></li><li> 인슐린 매체없이 RPMI / B27를 들어, RPMI 미디어의 500 ml의에 B27 마이너스 인슐린 10 ㎖를 추가합니다. </li><li> 매체 (인슐린) RPMI / B27를 들어, insuli로 (B27 보충 10 ㎖를 추가N) 및 RPMI 매체에 500㎖의 펜 연쇄상 항생제 5 ㎖. </li><li> 낮은 포도당 매체의 경우, B27 보충 10ml의 포도당이없는 RPMI 미디어의 500 ml의에 펜 연쇄상 구균 항생제 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> : 1 비율 동결 / 동결 보존 매체의 경우,도 9에서 디메틸 설폭 시드 (DMSO)와 함께 소 태아 혈청을 혼합한다. 동결 매체는 4 ° C에서 1 개월까지 저장할 수 있습니다. 참고 : 모든 매체가 여과하고 저장 4 ° C에서와 달리 명시되지 않는 한 이주 내에서 사용되어야한다. 달리 명시하지 않는 한 아래에 사용 된 모든 시약 / 솔루션 볼륨은 6 잘 판에서 단일 잘위한 것입니다. </li></ol> 2. ECMS로 6 웰 플레이트 중고 코팅 <ol><li> 다음 6 웰 플레이트 각 웰에 갓 ECMS 2 ㎖를 적용, 200 : 1의 비율로 빙냉 DMEM / F12의 미디어 (예, 마트 리겔) 기저막 매트릭스를 혼합하여 ECMS합니다. 잘 6 웰 플레이트의 각은 약 90 mg의 ECMS를 받게됩니다. </li><li> ECM을 품어S는 37 ° C에서 1 시간 동안 코팅 된 플레이트. 각 웰에서, 흡인하는 DMEM / F12 솔루션 세포를 도금 직전. 플레이트를 세포를 수신 할 준비가 될 것이다. </li></ol> 3. 해동 냉동 hiPSCs 참고 : 최적의 배양 및 동결 / 해동주기 다음 hiPSC-의 CM에 hiPSCs의 다운 스트림 분화 등의 원인이 밀접하게이 절차를 수행합니다. <ol><li> 6- 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 hiPSCs 바이알을 해동. 각각의 병에 대한 ROCK 저해제 (10 μM) 감기 E8 매체의 9 ml로 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. ROCK 저해제는 냉동 보존 (10)를 다음과 hiPSCs의 생존을 향상시킵니다. 약 5mm 직경의 얼음 결정이 남아 때까지 세포를 해동 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 유지합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 튜브의 외부를 스프레이. 멸균 층류 후드로 이동하기 전에 휴지와 병을 닦습니다. </li><li> 준비된 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. t을 씻어그는 E8 배지 500 μL 회 유리 병 같은 원추형 튜브에 세포를 해동 함유하는 배지를 옮긴다. 200 x g에서 4 분간 실온에서 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후 상층 액을 기음 부드럽게 ROCK 저해제 (10 μM)와 E8 매체의 2 ml의 세포 펠렛을 resuspend. 6 웰 플레이트 ECMS로 사전 코팅 잘 하나에 재현 탁 세포를 전송합니다. </li><li> 배양 24 시간 후 ROCK 저해제없이 E8 매체와 매체를 교체합니다. 세포는이 시간 준수해야합니다. </li></ol> hiPSCs 4.과 Passaging <ol><li> 일반적으로 6 웰 플레이트에서 75 % -80 %의 포화 상태에 도달 한 후 통과 hiPSCs. 문화 매체를 대기음. 신속하게 멸균 1 ㎖, RT PBS로 우물을 씻어. 대기음 PBS. <ol><li> 500 0.5 mM의 EDTA ㎕의 또는 1X 세포 분리 솔루션 (예를 들어, Accutase)를 첨가하고, 실온에서 1-7 분 동안 품어. EDTA 배양을위한 적절한 시간은 hiPSC 라인에 따라 달라집니다. 눈에 보이는 컬링 O를 볼 것을 예상가장자리 주위 식민지의 R 비후이 그 EDTA 또는 세포 분리 솔루션을 나타냅니다으로 제거 할 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> EDTA 또는 셀 분리 솔루션을 기음. 10 μM의 ROCK 저해제로 보충 E8 매체의 1 ML을 추가합니다. 반복적으로 피펫 팅과 아래 P1000 피펫으로 식민지를 분사하여 잘에 hiPSC 식민지를 대체. 식민지 완료 후 5 ~ 10 세포 덩어리로 분리해야합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관에 ROCK 억제제 E8 매체의 1에 현탁 된 식민지를 전송합니다. </li><li> E8 매체에서 작은 덩어​​리로 큰 세포 덩어리를 방해. 세포를 희석하여 세포 현탁액 억제제 E8 매체의 적절한 볼륨. 희석 추가 매체 볼륨이 세포 밀도에 따라 우물의 수는 시드 할. 이상적으로, hiPSCs의 단일, 80 %의 합류가 잘 1:12 희석해야한다. <ol><li> CE의 기존 1 ml의 ROCK 저해제와 11 ml의 E8 매체를 추가전술 한 15ml의 원뿔형 튜브 LL 용액 1:12 희석액을 얻었다. </li></ol></li><li> 또한 (각 조각에 50-200 세포가 최선의 주위에) 작은 세포 조각에 세포 덩어리를 씹다. 이 세포 생존을 감소시키기 때문에 피 오버 분쇄하여. </li><li> 기음 미리 코팅 된 플레이트에서 ECMS 각 우물에 재현 탁 세포 2 ㎖를 추가합니다. 6 웰 플레이트의 웰 당 약 10 만 세포가 이상적입니다. 웰의 중앙에 세포의 클러스터링을 피하기 위해 잘 해결 고르게 분배하는 세포를 목표로한다. </li><li> 배양 24 시간 후, ROCK 저해제없이 E8 매체와 매체를 교체합니다. 세포가 80 % 합류가 될 때까지 배양 배지마다 24 시간을 변경합니다. 이어서, 세포를 다시 통과 할 준비가되었다. 그것은 일반적으로 80 % 포화 상태에 도달하는 통로 사이 3-6일 걸립니다. </li></ol> 5. 어는 hiPSCs 참고 : 최적의 배양과 엉덩이의 다운 스트림 분화 등의 원인이 밀접하게 다음 절차를 수행hiPSC-CM이에 SCS는 동결 / 해동 사이클을 다음과 같습니다. <ol><li> 세포주 이름, 셀 타입, 통로 번호 및 날짜와 함께 동결 극저온 튜브 레이블. 일반적인 지침으로, 6 웰 플레이트의 각 웰에 대해 하나의 유리 병을 사용합니다. ROCK 저해제 (10 μM)와 E8 매체의 9 ml로 가득 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 90 % FBS 10 % DMSO와 매체를 동결 준비 및 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 매체를 유지합니다. </li><li> , 문화 미디어를 대기음 500 0.5 mM의 EDTA ㎕의 또는 1X 세포 분리 솔루션을 추가하고 실온에서 2-7 분 동안 품어. EDTA 또는 세포 분리 용액 노출 기간은 세포주로 세포주 다르다. </li><li> 기음 EDTA 또는 세포 분리 솔루션입니다. E8 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 피펫 팅과 아래 P1000 피펫으로 식민지를 분사하여 잘 hiPSC 식민지를 대체. 식민지는 100보다 작은 세포 덩어리로 분리 할 수​​ 없습니다. E8을 함유하는 원뿔형 튜브에 제조 된 현탁 세포 이동. R 원심 분리기T 200 x g에서 4 분. </li><li> 뜨는을 기음과 펠렛에 차가운 동결 매체의 500 μl를 추가합니다. 1-2 회 피펫 팅하여 펠릿을 재현 탁. 세포 생존은 큰 덩어리에서 세포를 유지하여 개선된다. </li><li> 레이블이 극저온 튜브에 재현 탁 세포를 전송합니다. 신속 점진적 냉각을 위해 수 냉동 컨테이너 포함 이소프로판올로 튜브를 이동합니다. 후 장기간 저장을 위해 액체 질소로 셀을 전송, 24 시간 동안 -80 ° C에서 셀 용기를 보관. </li></ol> 인간의 IPSC 6. 심장 차별화 참고 : 추가 할 때 모든 미디어가 RT 적어도해야한다. <ol><li> EDTA 또는 1 배 세포 분리 솔루션을 분리 한 후, 약 10 만 차별화를위한 ECMS 코팅 6 웰 배양 접시에 인간의 iPSCs (세포 계대 절차와 동일한 절차를) 씨입니다. 세포가 85 % 컨 플루 언시에 도달 할 때, (6) 인슐린 매체없이 RPMI / B27으로 변화 매체μM GSK3 베타 억제제 CHIR99021 (치르)과 48 시간 동안 유지한다. </li><li> 48 시간 후, 인슐린 매체없이 RPMI / B27로 치르 함유 배지를 교체하고 (3 일까지) 24 시간 동안 혼자 남겨. </li><li> 3 일에서 5 μM의 Wnt 억제제 IWR1과 인슐린없이 RPMI / B27에 미디어를 변경하고 (5 일까지) 48 시간 동안 유지한다. 주 : 이전 연구 11에 기재된 바와 같이이 Wnt 억제는 또한, 다른 저분자 화합물을 사용하여 시도 될 수있다. IWR1 인해 그것이 11의 Wnt 신호 전달 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다 증가하는 범위로 다른 소분자 저해제의 Wnt상에서 선택 하였다. </li><li> 5 일에서 인슐린 매체없이 다시 RPMI / B27에 매체를 변경하고 (7 일까지) 48 시간 동안 둡니다. </li><li> 7 일에, (인슐린) RPMI / B27 매체와 매체를 교체하고 같은 매체 매 3 일 이후 매체를 교체합니다. 심근 세포의 자발적인 박동는 첫 날에 약 8 일에서 볼 수 있어야합니다10. </li></ol> 포도당 기아을 통해 인간의 심근 세포 7. 정화 <ol><li> 10 일 후 분화에서, 6 웰 플레이트에 2 ㎖의 저혈당 배지의 각 웰에서 배지를 변경하고 (13 일까지) 3 일간이 배지에서 세포를 유지한다. </li><li> 하루에 13에서, (인슐린) RPMI / B27 매체에 세포를 반환합니다. </li><li> 선택적으로, 포도당 기아 동안 비 심근 쉽게 분리를 허용, 문화 판에서 비 심근 세포를 풀고 도움이 포도당 기아의 두 번째 라운드 이전에 심근 세포를 replate. <ol><li> 13 일째, 대기음 매체에서, PBS로 한번 세척하고, 37 ° C에서 5 분 동안 세포 해리 효소의 500 μl를 사용하여 단일 세포로 세포를 해리. 특히, 효소 처리의 5 분 후, 수동으로 반복 셀 탈퇴 효소를 위로 끌어 당기 cardiomyo에 대해 그것을 분사하여 6 웰 플레이트에서 심근 세포를 해리 1,000 μL 피펫을 사용cyte 단일 층. 30 피펫 반복 최대 단일 세포로 심근 세포를 떼어 놓다해야 할 수 있습니다. </li><li> 세포 해리 단일 셀 형태 인 후 X g (200)에서 4 분 동안 세포 해리 효소 및 원심 분리기를 희석 인슐린 RPMI / B27 배지 5 ㎖를 가득 15ml의 원뿔형 튜브에 모든 세포를 수집한다. 기음과 상층 액을 제거한다. </li><li> 새로운 ECMS 코팅 6 웰 플레이트에 2 ml의 RPMI / B27 매체 접시와 세포를 다시 일시 중지합니다. 일반적으로 심근의 높은 포화 상태가 replating 동안 세포 생존에 도움이됩니다. replating시 최적의 생존을위한 새로운 6 자 접시 당 2 백만 세포를 replate하는 것을 목표로하고 있습니다. </li></ol></li><li> 14 일에, 두 번째 포도당 박탈주기 위해 다시 낮은 포도당 배지 2 ㎖에 매체를 변경합니다. 문화 3 일 이상이 낮은 혈당 상태에서 세포. 비 심근 세포의 대부분이 낮은 포도당 배양 조건에서 죽을 것이다. </li><li> 17 일에, R의 2 ㎖의 배지를 변경인슐린 PMI / B27 매체. 나머지 세포는 고도로 정제 된 심근 될 것입니다. 이러한 심근은 유전자 발현 분석, 약물 스크리닝, 대사 분석 및 다양한 다른 하류 분석법에 사용될 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

고순도 hiPSC 유래 심근 세포를 다량 획득하는 기본 심장 연구뿐 아니라 임상 및 병진 애플리케이션에 중요하다. 심장 분화 프로토콜은 작은 분자 변조 및 단층 기반의 방법 (5)에 마지막으로 심인성 성장을 이용하여 배아 몸 기반 방식에서 전환, 최근 몇 년 동안 엄청난 개선을 시행 샌드위치 방법 (12) - 매트릭스, 2 인자하고있다. 전술 한 프로토콜, 여기에서 설명한 프로토?...

차 인간 심근 인해 침습 심장 생검 및 배양 때문에 열악 장기 세포 생존의 단일 셀에 대한 해리 곤란한 요구 사항으로 얻는 것이 곤란하다. 차 인간의 심근 세포, 환자 맞춤형 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 부족을 감안할 때 (hiPSC-CM) 기술은 기초 연구에 대한 강력한 대안 심근 소스뿐만 아니라 질병 모델링 및 약물 임상 및 번역 응용 프로그램으로 간주되었습니다 발견 한. 심근 세포로 다 능성 줄기 세포를 분화 이른 노력 배양체 EBS ()을 사용하여 분화 프로토콜을 채용하지만, EB의 셀 종종으로 25 % 이상이 심근 2,3- 치기 때문에이 방법은 제조 심장 근세포에서 비효율적이다. 비교적, 및 BMP4를 티빈 사이토 카인을 사용하여 단층 계 분화 프로토콜 EB를보다 높은 효율을 표시하지만이 프로토콜은, 여전히 상대적으로 비효율적이다 인간 다 능성 줄기 세포 (4)의 제한된 수의 비싼 성장 인자, 및 전용 기능을 필요로한다. 최근 고효율 hiPSC 단층 계 심근 분화 프로토콜의 Wnt / β 카테닌 5 변조 신호에 의해 개발되었다. 이러한 hiPSC-CMS는 심장 트로포 닌 T와 알파 티닌, 심근 6의 표준 마커 두 sarcomeric 단백질을 표현한다. 프로토콜은 여기에 설명이 저분자 계, 피더 무 세포 단일 층 분화 방법 5,7의 적응이다. 우리는 7-10일 (그림 1) 이후 hiPSCs에서 심근 세포를 구타 얻을 수 있습니다. 그러나 50 %는 세포를 치고 그 결과 심근 세포의 분화에 따라 지속적으로 면역 염색하는 등 심장 관련 트로포 닌 T와 알파 - 티닌과 같은 심근 특정 마커에 대한 부정적 비 심근 세포의 인구의 존재를 보여줍니다. 푸에rther가 심근 세포를 정제 및 비 심근 제거 이기종 분화 된 세포 집단은 일 대 다수의 매우 낮은 글루코스 배지 (도 2)로 처리하여 기아 글루코스 행 하였다. 이러한 처리는 선택적으로 낮은 글루코스 8 환경에서 생존하기 위해 주 에너지 원으로 락트산을 대사하는 심근 세포의 능력으로 인해 비 심근 아니지만 비 심근 세포를 제거한다. 이 정제 단계 이후에, 비 심장 근세포로 심근 세포의 비율이 40 % 증가 (도 3,도 4)이 관측되고, 이러한 셀 하류 유전자 발현 분석, 질병 모델링, 및 약물 스크리닝 분석에 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS)은 기초 연구와 번역 애플리케이션에 사용할 수 차 심근 세포의 부족을 해결하기위한 중요한 셀 소스되고있다. 심근에 hiPSCs 차별화, 배아 체 (EB) 기반 분화 및 성장 인자 유도를 포함하는 다양한 프로토콜들이 개발되었다. 그러나, 이들 프로토콜은 비효율적 정제 심근 세포를 생성하는 능력에서 매우 다양하다. 최근의 Wnt / β-catenin의 신호의 작은 분자 기반 프로토콜을 사용하는 변조는 높은 효율로 심장 분화를 촉진 것으로 나타났다. 이 프로토콜로, 분화 된 세포의 50 % 초과 -60 % 심장 트로포 닌 양성 심근 세포가 지속적으로 관찰했다. 또 심근 순도를 증가시키기 위해, 구체적으로는 분화 세포 대사 차이에 기초하여 비 - 심근 세포를 제거하는 기아 글루코스 행 하였다심근 세포와 비 심근 세포 사이의. 이 선택 전략을 사용하여, 우리는 지속적으로 분화 된 세포의 집단에서 비 심근에 심근의 비율보다 30 % 증가를 획득. 이러한 고순도 심근 질환 체외 모델링 연구 및 약물 스크리닝 분석법 인간 IPSC 기반 결과의 신뢰성을 향상한다.

hiPSC 차별화 동안 형태 학적 변화. 공급 장치가없는 접시에서 배양 hiPSC는 평면의 2 차원 식민지 증가했다. 약 85 %의 포화 상태에 도달하면, hiPSCs는 분화 (그림 1A) 6 μM 치르 처리 하였다. 세포 죽음, 정상 및 일반적인 현상은 상당량 치르 처리 24 시간 후에 관찰 하였다. 치르 처리 이틀 후, hiPSCs는 중배엽 운명 향해 분화하는 것을 계속했다. hiPSC 식민지?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose S

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.5K 조회수.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

비디오: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

연구

발생학

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...