We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

In vivo wird in pathogenfreien Einrichtungen unter Verwendung von Protokollen von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Utah bestätigt Bildgebung durchgeführt. ANMERKUNG: Diese Bildgebungsprotokoll für Reportermäusen, bei denen retinale Mikroglia und infiltrierenden Monozyten / Makrophagen exprimieren grün fluoreszierenden Protein (GFP) unter der Kontrolle des Fractalkin Rezeptor Locus (CX3CR1) verwendet. 1. In Vivo Imaging von Retinal GFP + Mikroglia durch konfokale Scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO) <ol><li> Schalten Sie den Wassergesteuerten Heizsystem, eingestellt, während Verfahren stabilisieren Maus Temperatur zwischen 35-37 ° C, und verbinden zwei Heizkissen. <ol><li> Starten des konfokalen Laser-Scanning-Ophthalmoskop (cSLO) System (2A). Öffnen Sie die cSLO Programm, geben Sie die Informationen, die die einzelnen Maus identifizieren und legen Sie einen Hornhautkrümmung von 2 mm (Patientendaten-Menü). </li></ol></li><li> Bereiten Sie sich auf imaging. Sicher passen einen sauberen 55º Weitfeld-Objektivlinse auf dem Sockel. Bereiten Sie den Augenspiegel Imaging-Plattform durch die Sicherung ein Heizkissen mit sauberem Papier bedeckt. Verwenden Sie Clips, um das Kissen und Papier glätten und sie davon abzuhalten, Blockieren der Bewegung der Objektivlinse. </li><li> Betäuben die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1,3% 2,2,2-Tribromethanol und 0,8% tert.-Amylalkohol (250 mg / kg Körpergewicht; 0,5 ml / 25 g Körpergewicht) mit Hilfe eines 30½ G-Nadel in eine 1-ml-Einweg ausgestattet Spritze. Rückgabe Maus in seinen Käfig, hielt über einem Heizkissen. HINWEIS: Die Lieferung der Betäubung durch Injektion gegen Einatmen erleichtert das Positionieren der Maus für die Bildgebung und ungehinderten Zugang zu den Augen, frei von Nasenkegel und Schläuche. </li><li> Sobald das Tier nicht mehr bewegt und ist nicht mehr auf Schwanz kneifen, induziert Pupillenerweiterung mit Tropicamide und Phenylephrin (jeweils 0,5%), indem Sie den Tieranfällig und für beide Augen mit den Tropfen für 7 min. </li><li> Nach 5 min pschnüren Sie die Maus anfällig auf die Mitte des Augenspiegels Plattform und fit Kontaktlinsen über den Augen, die Anwendung minimalem Druck. HINWEIS: Kontaktlinsen sind klein und zerbrechlich, aber kann man vorsichtig mit den Fingern gehandhabt werden, obwohl Pinzette kann stattdessen 40 verwendet werden. Die Verwendung von Kontaktlinsen ist optional, aber empfohlen, da es minimiert Augentrockenheit und bewahrt Hornhauttransparenz während der Bildgebung. </li><li> Nach 7 min, richten die Maus mit dem rechten Auge gegenüber der Objektivlinse und der Bahn parallel zu der Objektivlinse, wobei das Tier in der Nähe der Kante der Plattform (2B) ungehemmt. Um Bilder vergleichbarer Sättigung und Orientierung zu sammeln, konstant zu halten den Abstand vom Auge zum Objektivlinse sowie die Ausrichtung des Auges zu dem Lichtweg gesamten Imaging-Sitzungen. Clip lange Schnurrhaare stören Beobachtung des Auges. HINWEIS: Für die nächsten 8-10 min, wird die Maus nicht bewegen oder blinken, und wird Luft unter leichtem Zuggen, die von der cSLO Eye Tracking ART (automatische Echtzeit) Modus, der den Scan-Kopf-Platzierung gemäß Fundus Sehenswürdigkeiten mit hohem Kontrast passt verfolgt werden. Vergangenheit dieser Zeit Mäusen beginnen keuchend und blinkt, so dass Abbildungs ​​unpraktisch. </li><li> Wenn Bildgebung wird ohne Verwendung von Kontaktlinsen durchgeführt wird, gelten PBS Tropfen in beide Augen alle 2-3 min, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Sammeln Sie ein Fundusbild des retinalen Gefäßsystems und Papille, das sich auf die inneren Netzhaut. <ol><li> Wählen Sie den Infrarot-Modus (IR) und passen Sie die Einstellungen bis 820 nm Anregung, 100% Laserleistung, 40-60% Sensitivität (2C). </li><li> Arbeiten im Hochgeschwindigkeitsmodus (12,6 Bilder / s), suchen Sie das Auge mit dem Joystick, um den Augenspiegel fahren. Bei geringer Vergrößerung, überprüfen Sie die Hornhaut und Linse für Verletzungen oder Deckkraft, und verstehen sich inklusive der Studie Augen mit Defekten oder Verletzungen, die beeinflussen, die Abbildung der Netzhaut (3A). </li><li> Suchen Sie den Papillenfläche (die Oberflächeder Sehnervenkopf, ONH), indem das Ziel näher zum Auge, dann die Bildmitte auf sie und sperren Sie diese Position durch Schrauben Sie den Joystick. Diese Ausrichtung des Auges auf dem Augen ist der Schlüssel zu erhalten, selbst konzentrieren und Emission über das Bild. </li><li> Visualisieren Sie die inneren Ebenen der Netzhaut sowie der ONH, unter Verwendung der großen Blutgefäße auf der Glaskörper Oberfläche der Netzhaut als Referenzbrennebene (59 und 60 D) oder tiefer (55 D) liegt in den Augen, die ausgegraben Optik Discs. Die optimale Schwerpunkt sollte lösen zirkulierenden Blutzellen in großen Blutgefäßen, mit ihrem Lumen und Wände deutlich verschieden. </li><li> Optimieren Sie die Bildsättigung durch Anpassung der Regler an der Touchscreen-Bedienfeld, bis ein weißes Halo der gleichmäßigen Ausleuchtung reicht in den meisten der 55º Fundus Feld um die Papille (mit leichten Überbelichtung). Next, senken Sie die Sättigung, um den Kontrast zu optimieren, bis Blutzellen, die sich entlang der großen Gefäße eindeutig geklärt werden. Wenn SchwerdunkelBereiche bestehen bleiben, nicht wegen Netzhautschäden, richten Sie den Blick auf die Kamera, bis ein gleichmäßig helles Bild erhalten wird. Diese Anpassung ist von grundlegender Bedeutung, um reproduzierbare Sätze von Bildern in Lage und Qualität zu erfassen. </li><li> Sammeln eines hochauflösenden Infrarotbild der zentralen Netzhaut (1,4-1,7 mm im Durchmesser, in Abhängigkeit von Alter), im Durchschnitt von 30 Bildern in Echtzeit (4,7 B / s; normalisiert), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern (2D ). </li></ol></li><li> Sofort erwerben ein Fluoreszenzbild von GFP + Mikroglia und / oder der Infiltrations Monozyten an der inneren Ebene der Netzhaut und dem Sehnervenkopf lokalisiert. HINWEIS: Die Optimierung des IR Fundusbild der Netzhaut bestimmt die Auflösung der Fluoreszenzbild von GFP + Zellen sowie das Ausmaß der inneren Netzhaut überspannt. Die Nichtbeachtung der inneren Ebenen der Netzhaut, die durch schlechte Auflösung des Gefäßsystems detektiert werden kann konzentrieren, werden in gedimmten GFP + Zellen Blick (3B) zur Folge haben. Nicht IR satu einstellenration ordnungsgemäß und einheitlich wirkt sich auf die Fluoreszenzbild (FA), die Einführung artifactual Variationen in GFP + Zellen Intensität und Größe (3C). <ol><li> Swich auf Bildgebungsmodus (FA) in der Touchscreen-Panel Fluoreszenz, mit blau, 488 nm Laseranregung (460 bis 490 nm-Sperrfilter-Set) und Übernahme-Einstellungen (100% Laserleistung und 100-125% Sensitivität), die gehalten werden, konstant für alle Mäuse (2E). </li><li> Sammeln Sie ein einzelnes xy-Punkt zweidimensionalen Fluoreszenzbild der Netzhaut und ein Fundusbild sofort erfassen zu identischen Position (100x Scandurchschnitt; 55º Scanwinkel für beide Bilder, 2F). </li><li> Nehmen Sie ein Multibild durch Auswahl von &quot;Verbundwerkstoff&quot; in der Systemsteuerung (2G) und Bewegen der Augenspiegel rechts und links, Schwenken der Netzhaut über den Nasen-Zeitachse (Abbildung 2 H). HINWEIS: Nach dem Scannen eines einzelnen Bildes xy-Punkt (100x skann Durchschnitt), die Software automatisch Durchschnittswerte neue Scans der gleichen und neue Bereiche (mit einem grünen Kreis umschrieben während optimale Scan oder rot, wenn der Scan nicht durchführbar ist) und Stiche alle xy-Positionen in Echtzeit. Das resultierende zusammengesetzte Bild umfasst 1,5-1,7 mm auf der horizontalen Achse x 3-4 mm in der vertikalen Achse (55º x 120-124º Scanwinkel). </li></ol></li><li> Vollständige Abbildung von jeder Maus innerhalb von 15 Minuten nach Narkoseeinleitung, vor Blinken und Bewegung neu gestartet. </li><li> Kontaktlinsen entfernen, Hydrat Augen mit PBS und zurück das Tier in das erwärmte Käfig, Kontrolle Verhalten bis zur vollständigen Wiederherstellung der Beweglichkeit. </li><li> Für Langzeitstudien mit intermittierender cSLO-Imaging-Sitzungen in der gleichen einzelnen Maus, wiederholen Imaging nicht weniger als 3 Tage auseinander, um die kumulative Toxizität der Anästhesie sowie Hornhautreizungen zu vermeiden. </li></ol> 2. Live-Bildverarbeitung und -analyse <ol><li> Sequential Bildausrichtung: <ol><li> Ausrichtendie Fundusbilder für eine Zeitreihe von dem gleichen Auge mit dem Gefäßsystem und Sehnervenkopf als Wahrzeichen. Öffnen Sie alle Bilder in einem kommerziellen Diashow integriert Programm, indem jedes Bild über die vorhergehende, bis ihre Papillen ausrichten auf der xy-Ebene (die obere Bild erscheint semi-transparent, während sie gezogen), und drehen Sie das obere Bild, bis sein Hauptblutgefäße überschneiden sich mit dem Gefäßsystem an das Bild unten (Fokus auf Schiffen am weitesten von der Papille). Nehmen Sie den Drehwinkel für jedes Bild, und speichern Sie diese Zeitreihe für die Zukunft, die Verfolgung der Maus und Augen Identität. </li><li> Ausrichten der entsprechenden Reihe von einzelnen xy-Punkt-Fluoreszenzbilder durch Anwenden der aufgezeichneten Winkel zur XY Drehung zu jedem Zeitpunkt zu korrigieren, unter Verwendung eines Rastergrafikeditorprogramm. Darüber hinaus passen Auflösung auf 300 dpi (ohne Skalierung) und Hintergrund (im RGB-Modus, wählen Sie Levels und probieren Sie die Lumen eines Blutgefäßes als schwarz). Speichern Sie diese Bilderals TIF-Dateien, Hinzufügen &quot;ausgerichtet&quot;, ihren Namen. </li></ol></li><li> Mikrogliazellen Segmentierung: <ol><li> Um GFP + Zellen zu identifizieren in der zentralen Netzhaut, in FluoRender öffnen Sie die &quot;ausgerichtet&quot; TIF-Datei, die der frühesten Zeitpunkt / age. Vergrößern Sie das Bild auf den Bildschirm passen, dann definieren Sie die Render-Ansicht (Composite, orthogonale, interpoliert) und seine Eigenschaften (0,58 Gamma, Sättigung 255, 255 Leuchtdichte, 195 Alpha und 1.00 Shading), die Auswahl sowohl die RG-Kanäle sichtbar (ausblenden B-Kanal durch einen Doppelklick auf das im Arbeitsbereich-Rahmen; 4A). </li><li> Um einzelne Zellen, Schwellen den roten Kanal wählen (müssen auf dem Arbeitsbereich Rahmen markiert), durch die Erhöhung der niedrigen Schwelle, bis die Mehrzahl der Zellen maskiert (weiß) mit Mindestüberlappung und Zellprozesse (cyan), während die hohe Schwelle konstant (255). Der niedrige Schwellwert variiert zwischen 100 und 170, abhängig von der Fluoreszenzintensität (4B &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Speichern Sie diese Ansicht mit den roten Kanal sichtbar (Capture-Befehl) als neue TIF-Datei, Hinzufügen &quot;cellsegm&quot; in seinen ursprünglichen Namen (4C). Mit einem generischen Rastergrafik-Editor-Software, invertieren ihre Graustufen und passen Auflösung auf 300 dpi, wie oben, und wieder speichern als RGB (4D). Hinweis: Der Ordner (Projekte) automatisch von FluoRender erstellt Löschen, und speichern Sie die Anwendung Schwelle für die Zukunft. </li></ol></li><li> Mikroglia soma Segmentierung und Morphometrie: <ol><li> Um GFP + Zellen somata für Bereich Quantifizierung zu identifizieren, verwenden Sie Bildanalyse-Software mit automatischer Intensitätsmessungen und Schwellen Fähigkeiten sowie Schwellenbasierten Objektzählung und Messung. Öffnen Sie die &quot;cellsegm&quot; TIF-Datei, und wählen Sie die Skalierung Verfahren (Spline) und den roten Kanal (klicken Sie auf Registerkarte rot in RGB). Verbessern Sie die Visualisierung durch Abwahl &quot;view-Kanal in der Farbe&quot; (Rechtsklick auf das rote RGB tab), und wählen Sie &quot;ergänzen Farben&quot; (Bild / Anpassen Image), um die Graustufen umzukehren und sich die Zellen in grau / schwarz auf weißem Hintergrund (4E). </li><li> Kalibrieren Sie das Bild, um 1,4 bis 1,7 mm, je nach Alter, durch Ziehen einer horizontalen Linie über das gesamte Bild (Kalibrierung, Schnellkalibrierung). </li><li> Segment Einzelzelle somata indem Intensitätsschwellenwertbildung (4B). Dazu Arbeit auf dem roten RGB-Kanal und öffnen Sie die Schwellenintensität Funktion (Object Count; Auswählen &quot;count Update&quot; -Befehl), um zweidimensionale Parameter für jeden Schwellenwert Region of Interest (ROI) zu verfolgen, die einzelne somata. </li><li> Definieren die Intensitätsschwelle in dem Intensitätshistogramm durch Auswahl der niedrigsten 50-60% der 255 Ebenen und die Endversion Schwellenwert durch visuelle Beurteilung der Überlappung zwischen dem Schwellenwert Farbmaske (blau) und Zellsoma Perimeter (grau) in Einzelzellen (FBBILDUNG 4E). </li><li> Schätzen Sie die Genauigkeit der Zelle soma Masken, um die Somal Dimensionen durch Messen der Fläche vor und nach der Segmentierung in 10 Zellen stellen und die ausgewählte Schwellenbereich an, wenn die Messwerte für weniger als 10% (mit dem Binary Toolbar und kommentierte Messungen). </li><li> Manuell identifizieren Somal ROIs, die mehrere Zellen schließen und trennen diese Elemente (Beseitigung oder separaten ROIs mit den Binary Toolbar Kontrollen oder Objektkatalog), während das Umschalten Ein / Aus den binären, um die Zellen (4F) direkt visualisieren. </li><li> Klassifizieren Mikroglia als ROIs mit somal Bereiche größer und kleiner als 50-60 &amp; mgr; m 2 zu Zelle unterscheiden somata entsprechend aktivierte Mikroglia und deaktiviert Mikroglia jeweils mithilfe Raumeinschränkung. HINWEIS: Jede Zelle Somal Teilmenge mit einem anderen pseudocolored binären Schicht identifiziert, und kann weiter für andere morphologische Parameter charakterisiert werden (PERIMEter, Kreisförmigkeit, etc.), als auch in diskreten retinalen Sektoren (Figur 4G) quantifiziert. Speichern Sie das Bild analysiert als ND2 Datei. </li><li> Stellen Sie sicher, den Prozess und die Komplexität Verzweigung in Einzel aktivierten Mikrogliazellen, durch Überlagerung der Somal Maske und die einzelnen xy -Punkt Bild (Kontrast erhöht 50%; 4H). Manuelles zählen die direkt aus der Zelle soma Verlängerung Prozesse oder messen Sie den Durchmesser des Polygons umfasst die Laube (verwenden Sie die Binary Toolbar und kommentierte Messungen). HINWEIS: Aktivierte Zellen fehlt Prozesse oder tragen wenigen (&lt;4) und kurz (&lt;2x somal Durchmesser) diejenigen, im Gegensatz zu nicht-aktivierten Zellprozesse, die eine verzweigte und umfangreiche Dorn umfassen (&gt; 3-10x somal Durchmesser) rund um ihre relativ kleine soma. </li><li> Manuell identifizieren Zellen mit somata kleiner als &lt;20 &amp; mgr; m 2 und / oder der GFP-Expression unter der Nachweisgrenze, die daher durch in unerkannt sindIntensitätsschwellen. Verwenden Sie den Befehl Taxonomy in Annotations manuell identifizierten Elemente zu zählen. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Echtzeitüberwachung von Mikroglia-Zellzahl und Morphologie Aktivierung während einer neurodegenerativen Erkrankung ist die Verwendung von nicht-invasive Bildgebungsverfahren, das die detaillierte Darstellung von Zellfunktionen ermöglichen. Nach der Bilderzeugung muss Mikroglia-Zellen isoliert werden (segmentiert) für morphometrische Analyse durch Verwendung von mehreren Schwellen Schritte Somal Größe und / oder Prozesskomplexität als Positionsanzeigen für Mikroglia-Aktivierung zu bewerten. In diesem Protokoll be...

Mikroglia Neuroimmun-Zellen, die ausschließlich in dem Zentralnervensystem (ZNS) gespeichert sein, da die frühe embryonale Entwicklung und im Erwachsenenalter. Ausgestattet mit einem komplexen Repertoire von Rezeptoren sind Mikroglia-Aktivität und regionale Heterogenität ihrer bidirektionalen Wechselspiel mit dem benachbarten Neuronen, Glia, Bluthirnschranke und Infiltrieren neuroinflammatory Zellen 1,2 geregelt. Basal Mikroglia-Funktionen tragen zur physiologischen Wartung und Reparatur, da sie probieren ihr Gebiet für Störungen in Homöostase 3,4. Während CNS Verletzungen oder Erkrankungen, sind Mikroglia die Ersthelfer zu neuronalen Signale, die dann ausgelöst werden den Übergang zu einer reaktiven Phänotyp, als &quot;aktivierte Mikroglia 2,5-7. Mikroglia-Aktivierung beinhaltet einen komplizierten Zyklus von Gen- und Proteinexpression, die Zelle soma und Prozessgrößenänderung und Umbau 6-9 gekoppelt sind. Mikroglia-Aktivierung sowie Zellverteilung undClustering kann die lokale Erhöhung der gesamten Anzahl der Zellen (bezeichnet als Mikrogliose) begleitet werden. Dies kann von Zellproliferation und Selbsterneuerung, mit oder ohne Einstellung von Blut abgeleiteten Monozyten 3,4,7,10-14 führen. In einer breiten Palette von altersabhängig, chronische Erkrankungen des ZNS, anhalt Mikrogliose und Mikroglia-Aktivierung parallel zur Krankheitsprogression 15-19. Wie Mikroglia Auswirkungen Neurodegeneration, bleibt unklar, vor allem weil sie sowohl neuroprotektive und schädlichen Rollen, die vielfältigen Beiträge zur Krankheitsbeginn und Verlauf haben können, zu spielen. Live-Imaging-Studien zu verstehen, chronische ZNS-Erkrankung ausgerichtet haben Mikroglia-Verhalten in der geschädigten ZNS von Tiermodellen und Menschen überwacht und nachgewiesen, dass Mikroglia Veränderungen nachweisbar sind zu Beginn in einem frühen Krankheitsstadien 15-17,19,20. Daher ist es entscheidend, Ansätze zu erkennen und zu überwachen Mikroglia-Aktivierung in vivo zu entwickeln. Nicht-invasive detection regionaler Veränderungen in der Hirn Mikroglia-Aktivierung wurde als ein wichtiger Indikator für die in vivo neurodegenerative Krankheitsprogression festgelegt, mit der molekularen Bildgebung oder Biolumineszenz und Positronenemissionstomographie oder Magnetresonanztomographie 18,21,22. Diese hoch quantitative und nicht-invasive molekulare und nukleare bildgebende Verfahren zu erkennen Gliose mit regionalen Auflösung. Alternativ hat Zwei-Photonen-konfokale Bildgebung in CX3CR1 GFP / + Mäusen, die Beobachtung der Gehirn Mikroglia mit zellulärer Auflösung 3,4,9,20,23-28 erlaubt. , Begrenzt jedoch dieser Ansatz langfristige und wiederholte Beobachtung von chronischen Mikro Änderungen angesichts der potenziellen Gefahr von ihr Verhalten sogar minimal-invasiven bildgebenden Verfahren 29 zu stören. Alternativ kann die Netzhaut bietet optimale Voraussetzungen für direkte, in vivo Visualisierung und wiederholte Überwachung von Mikroglia in ihrer intakten ZNS Nische ganz Alterung, nach einer akuten Verletzung, undmöglicherweise bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen. So haben neuere Studien die Machbarkeit der hochauflösenden Abbildung von Netzhaut Mikroglia, die GFP durch Anpassung der konfokalen Scanning Laser Ophthalmoskopie (cSLO) an image Live CX3CR1 GFP / + Mäusen nachgewiesen. Dies wurde verwendet, um Veränderungen in wöchentlichen GFP + Zellzahlen in einzelnen Mäusen für bis zu 10 Wochen Spurfolge akut induzierten Verletzung oder Augenhypertension 30-36. Wir haben diesen Ansatz erweitert, um langfristige Bildgebung über mehrere Monate durchzuführen, und quantitativ Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung auf Basis von soma Größe unter Verwendung morphometrische Analyse verfolgen. Somal Größe wurde als nützliche Metrik der Mikroglia-Aktivierung in Live-Imaging-Studien unter Verwendung von Zwei-Photonen-konfokale Mikroskopie in Rindenscheiben in vivo Bildgebung von CX3CR1-GFP + Mikroglia 9 durchführen definiert. Diese und andere Studien zeigten auch die Korrelation zwischen Somal Größe und die Höhe der Iba1 Proteinexpression, which auch steigt mit Aktivierungs 9,37. Somit können aktivierte Mikroglia im lebenden Mäusen identifiziert werden, und deren Anzahl und Verteilung über die Zeit überwacht während CNS Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur cSLO Livebildaufnahme und Analyse auf Mikroglia-Zellzahlen, die Verteilung und morphologischen Aktivierung während der retinalen Ganglienzellen (RGC) Degeneration (Figur 1) zu überwachen. Somit verwendet diese Studie: 1) ein Mausmodell der geerbten Glaukom (DBA / 2J), die altersabhängige Sehnerv und Netzhautdegeneration und erfährt zeigt bemerkenswerte Variabilität in den Krankheitsverlauf zwischen 5 und 10 Monaten 38,39, 2) monatlich cSLO in vivo-Bildgebung für die Langzeit Visualisierung von GFP + -Zellen in der Netzhaut und des Sehnervs unmyelinated heterozygoter CX3CR1 GFP / + DBA / 2J-Mäusen im Alter von 3-5 Monaten, 3) Live-Bildanalyse durch Segmentierung und Schwellwertbildung, um die Zell somata und messen zu isolieren dieIR-Bereich. Diese Strategien angewendet werden, um die Kinetik der retinalen Mikrogliaaktivierung Zustände während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2010">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:617px;">Name</td>
			<td style="width:444px;">Company</td>
			<td style="width:208px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:741px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:617px;">DBA/2J and 
			CX3CR1-GFP/+ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td>
			<td>000671 and 00582</td>
			<td>Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe</td>
			<td>BD, East Rutherford, NJ</td>
			<td>305106 and 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:617px;">2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T48402, 152463 and P4417</td>
			<td>Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4&#186;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat therapy T/Pump</td>
			<td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td>
			<td>TP-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tropicamide 1%&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb, Rochester, NY</td>
			<td>NDC 24208-585-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center</td>
			<td>Cantor &#38; Nissel Ltd., Northamptonshire, UK</td>
			<td>G003709</td>
			<td>Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td>
			<td>Version 1.7.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPoint</td>
			<td>Microsoft, Redmond, WA</td>
			<td>Version 14.4.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe, San Jose, CA</td>
			<td>Version CS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoRender</td>
			<td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td>
			<td>Version 2.13</td>
			<td>Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NIS-Elements C</td>
			<td>Nikon, Melville, NY</td>
			<td>Version 4.30.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma

Mikroglia, die CNS-Resident neuroimmune Zellen sind, verwandeln ihre Morphologie und Größe in Reaktion auf ZNS-Schäden, die Umstellung auf einen aktivierten Zustand mit unterschiedlichen Funktionen und Genexpressionsprofilen. Die Rolle der Mikroglia-Aktivierung in den Bereichen Gesundheit, Verletzungen und Krankheiten bleiben unvollständig aufgrund ihrer dynamischen und komplexen Regulation in Reaktion auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu verstehen. Daher ist es entscheidend, nicht invasiv überwachen und Änderungen Mikroglia-Aktivierung über die Zeit im intakten Organismus zu untersuchen. In-vivo-Studien der Mikroglia-Aktivierung durch technische Einschränkungen, um Tracking-Mikroverhalten, ohne die Umwelt CNS verzögert. Dies hat eine besondere Herausforderung gewesen, während der chronischen Neurodegeneration, in denen langfristige Veränderungen müssen verfolgt werden. Die Netzhaut, ein CNS Orgel zu nicht-invasiven Live-Bildgebung zugänglich und bietet ein leistungsfähiges System zur Visualisierung und Charakterisierung der Dynamik der Mikroglia-Aktivierung bei chronischen Erkrankungen. in vivo-Abbildung von Netzhaut Mikroglia, mittels konfokaler Ophthalmoskopie (cSLO) und CX3CR1 GFP / + Reporter Mäusen zu Mikroglia mit zellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Außerdem beschreiben wir Methoden, um monatlich Änderungen der Zellaktivierung und Dichte in großen Zell-Untergruppen (200-300 Zellen pro Retina) zu quantifizieren. Wir bestätigen den Einsatz von Somal Bereich als nützliches Maß für Live-Tracking von Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut durch die Anwendung automatisierter Schwelle basierte morphometrische Analyse von in vivo Bilder. Wir nutzen diese Live-Bildaufnahme und analysiert Strategien, um die dynamischen Veränderungen in Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose während frühen Stadien der Netzhautdegeneration in einem Mausmodell für chronische Glaukom zu überwachen. Dieser Ansatz sollte sinnvoll, die Beiträge der Mikroglia zu neuronalen und axonalen Rückgang der chronischen ZNS-Störungen, die die Netzhaut und Sehnerv beeinträchtigen untersuchen.

Unsere bisherigen in vivo Studien verwendet diese spannungs Bildaufnahme- und Analyseverfahren, zu visualisieren und zu verfolgen, die Kinetik und Muster der ONH und retinale Mikroänderungen während der frühen Stadien der chronischen Glaukoms und ihre Beziehung zu spät Neurodegeneration 59. Hier veranschaulichen wir cSLO Bildaufnahme-Protokoll zu Mikrogliazellen in einem großen Bereich der zentralen Netzhaut in einzelnen jungen heterozygot CX3CR1-GFP DBA / 2J Retinae (Abbildung 5)</stron...

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In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

10.5K Aufrufe.  University of Utah.  Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom. 

Serie: In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...