Funding for this work was provided by: AG007218 and NIH F32 AG031606.
Images were generated in the Core Optical Imaging Facility, which is supported by UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC at UTHSCSA) and NIH-NIA P01AG19316.

Hinweis: Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt und wurden im Einklang mit den Leitlinien ANKOMMEN. 1. Anästhesie für Cortical Vorbereitung <ol><li> Platzieren Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 2-3% Isofluran mit Sauerstoff gemischt, um Anästhesie zu induzieren. Beachten Sie die Atemfrequenz ab, wenn die Maus induziert. Klemmen Sie die Pfote der Maus, um festzustellen, ob die Maus ist bereit, an den Nasenkegel bewegen. Hinweis: Anesthesia Ebene ist ein entscheidender Schritt in einer in vivo-Erstellung und darauf zu achten, nicht auf ein Niveau, das globale Ischämie verursachen induzieren. </li><li> Sobald die Maus ausreichend betäubt, übertragen Sie die Tier der Operation / Imaging-Plattform und legen Sie mit der Maus die Nase in der Nasenkegel und gelten 1-1,2% Isofluran, einen betäubten Zustand zu halten. Sicherzustellen, dass die Maus auf eine Temperatur co liegendenntrolled Heizkissen um die Körpertemperatur (37 ° C +/- 0,5 ° C) während der restlichen Verfahren, aufrechtzuerhalten. Zeigen vet Salbe über die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Überwachen Sie die Physiologie der Maus mit einer Pulsoximetrie-System mit dem Schwanz oder Fuß-Clip mit dem System zur Verfügung gestellt. Überprüfen Sie, ob die Atemfrequenz zwischen 50-65 Atemzüge / min gehalten. Überprüfen Sie, ob die Herzfrequenz bleibt zwischen 300 bis 450 bpm und Sauerstoffsättigung wird zwischen 97-98% gehalten, um langfristige Überleben des Tieres zu gewährleisten. </li><li> Wenn die Maus ausreichend betäubt, rasieren die Haare über der Schädeldecke mit elektrischen Haarschneider, entfernen Sie restlichen Haare und sauber und mit Betadin, gefolgt von einer Ethanol-Tupfer. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, um eine sterile OP-Umgebung zu gewährleisten. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren <ol><li> Mit der Kopfhaut vollständig gereinigt und rasiert, einen 5 mm Einschnitt in die Kopfhaut der Maus, um die Schädel fissu zeigenres und Bregma finden. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen der über dem parietalen Kortex mit den stereotaktischen Koordinaten Bregma: -1 bis -3 mm und Quer: 2-4 mm. Hinweis: Der Leim bindet normalerweise innerhalb von 2 min nach dem Aufsetzen des Ringes auf den Knochen. </li><li> Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern. </li><li> Unter einem chirurgischer Qualität Binokular, langsam bohren Sie ein 1-2 mm Abschnitt in der Schädeldecke mit einem drehzahlgeregelten dremel artiges Werkzeug (Meisinger 3,9 mm Bohrer) und achten Sie auf den Bereich zu halten, wie es gebohrt wird. Erreichen dies unter Verwendung eines Zick-Zack-Muster. Um Hitze zu vermeiden aufzubauen, setzen Sie den Bohrer Geschwindigkeit niedrig und machen Sie regelmäßig Pausen. </li><li> Wenn der Hirnschädel wird shinny in Erscheinung, auch weiterhin die Ausdünnungdes Schädels mit einer Skalpellklinge unter Verwendung der gleichen Zickzack-Muster, um den ausgedünnten Oberflächen Niveau zu halten, um glatte Entfernung von dünnen Schichten der Hirnschädel zu erleichtern. Mit der Spitze der Skalpellklinge machen kleine lineare Hübe mit leichtem Druck, um dünne Schichten von Knochen zu einer Zeit, zu entfernen. Fahren Sie diese bis zum Gefäßsystem ist eindeutig durch das Binokular sichtbar. </li><li> Wenn der Experimentator durchsticht oder brechen durch den Schädel in der Ausdünnungsverfahren, das Tier einschläfern aufgrund wahrscheinlich Beschädigung des darunterliegenden Kortex. Die Maus-Schädel ist etwa 300 um dick und besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen (eine äußere und eine innere Schicht) und eine Schicht aus Spongiosa zwischen den zwei Schichten aus kompaktem Knochen besteht, sandwichartig angeordnet. Die äußere Schicht kompakten Knochens und die meisten der Spongiosa innerhalb des 5 mm Bohrbereich was zu einer ungefähr 50 &amp; mgr; m-Schicht kompakten Knochens verbleibenden entfernt (siehe 2B). Visualization des Gefäßsystems wird sichergestellt, dass die endgültige verdünnte intakten Schädel ist etwa 50 &amp; mgr; m in der Dicke. Der Schädel ist also noch vorhanden ist, wenn diese Dicke ausgedünnt. </li></ol> 3. Mikroskop Set-up <ol><li> Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop-System (konventionelle konfokale oder Zwei-Photonen-Systeme), die eine Objektivwechselrichter. Anmerkung: Es ist auch möglich, einen Standard aufrechten Mikroskop zu verwenden. Der begrenzende Faktor wird der Raum zwischen der Stufe und den Zielen. Modifikationen an der Bühne kann notwendig sein, um diese Einstellung durchzuführen. </li><li> Sichern Sie die chirurgische / Imaging-Plattform, um eine maßgeschneiderte Bühne, die abgesehen von der Basis des Mikroskops befindet. Anmerkung: Die Plattform ist mit einer Laborbuchse eine Vertikalbewegung des chirurgischen / Imaging Plattform unter dem Ziel ermöglichen gemacht. Die Laborhebebühne ist mit einer Platte, um vier zylindrische Stangen befestigt montiert. (Siehe Abbildung 2). </li><li> Positionieren Sie den Ziel-Wechselrichter, die eine 20-fachZiel im Laufe des Schädelfenster. Verwenden Sie eine externe Lichtquelle, um die Schädelfenster, indem Sie durch die Okulare des Mikroskops zu finden und positionieren Sie das Ziel in der Imaging-Bereich. Hinweis: Der Abbildungsbereich wird durch die Anwesenheit des Gefäßsystems bezeichnet werden. </li><li> Für wasserbasierende Ziele künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH 2 PO 4, 200 mM NaHCO 3, 30 mM HEPES und 100 mM Glucose) als das Medium durch Potential Leckage in die Schädelhöhle während der Abbildung (Abbildung 3). </li></ol> 4. Rose Bengal Dye Vorbereitung, Verwaltung und Induktion von Stroke <ol><li> Eine frische 20 mg / ml Lösung von Rose Bengal in künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF); zu filtern und zu sterilisieren vor der Verabreichung. Nicht wiederverwenden oder lagern Sie das Rose Bengal, sobald sie gemischt hat. Machen Sie eine frische Lösung für jedes Experiment. </li><li> Geben Sie eine 0,1 ml Schwanzveneninjektion von Rose Bengal sKonserven die Schädelfenster mit einem 561-nm-Laser, um eine ausreichende Injektion der Lösung zu gewährleisten. Anmerkung: Bengalrosa wird innerhalb von 5 Sekunden nach Injektion in das Gefäßsystem des Gehirns sichtbar gemacht werden. Der gesamte Behälter sollten mit Rose Bengal gefüllt werden. </li><li> Nach ausreichender Injektion von Rose Bengal-Farbstoff wählen einen geeigneten Behälter für Thrombose basierend auf Gefäßdurchmesser (40-80 um), um die Reproduzierbarkeit einer bestimmten Läsion Volumen zu gewährleisten. Differenzieren zwischen Arterien und Venen, indem man die Richtung des Blutflusses: Arterien von größerem Durchmesser zu kleinerem Durchmesser Schiffe bewegen, bewegen Adern auf einen größeren Durchmesser Gefäße. Dies wird einfach durch Visualisierung bewerkstelligt einmal Rose Bengal eingespritzt wird. </li><li> Ändern Sie den Mikroskop-Einstellung wie folgt: <ol><li> Erhöhen Sie die Verweildauer. Anmerkung: Diese wird in Abhängigkeit von der Mikroskopsystems ausgenutzt variieren. </li><li> Erhöhung der Laserleistung auf 100%. </li><li> Sammeln zeitliche Abfolge Bilder auf 1 Bild / s unter Verwendung dermaximale Scangeschwindigkeit. </li></ol></li><li> Scannen der Maus, bis eine stabile Gerinnsel innerhalb des Behälters gebildet wird. Hinweis: Diese Regel wird innerhalb von 5 min der kontinuierliche Abtastung erreicht (siehe Abbildung 4). </li><li> Im Anschluss an die Induktion der Gerinnselbildung unter Verwendung von Bengalrosa, entfernen Sie die Maus von der Bildfläche zurück in die Binokular. Die Edelstahlring vorsichtig aus der Hirnschädel zu entfernen. Untersuchen Sie die Schädelfenster für jede Blutung. Wenn die Blutung auftritt, beenden das Experiment. </li><li> Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial, um den Einschnitt über den Schädel zu schließen. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie. </li><li> Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen. </li><li> Gibt die Maus auf eine saubere Käfig für weitere Untersuchungen zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol> 5. Längs Imaging an den folgenden Tagen <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Methoden, um eine Längs Bildgebung bei zukünftigen Tage nach photothrombosis durchzuführen. <ol><li> Betäuben die Maus, wie in Abschnitt 1 der Methoden beschrieben. </li><li> Auf ausreichende Betäubung wieder zu öffnen, die Kopfhaut durch Entfernen alle restlichen Nähte, um die Haut über dem zuvor gebohrten Abbildungsfeld erneut zu öffnen. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Baumwoll-Applikator, um alle verbleibenden Faszie über dem Schädel zu entfernen. </li><li> Kleben Sie eine maßgeschneiderte Edelstahlring (Abbildung 1) mit Gewebekleber auf den Knochen, die über der früheren Bildfeld. </li><li> Das Anbringen der Ring zu einer stereotaktischen Halter (2), um die Maus zu stabilisieren und um eine Bewegung während der Bilderzeugung zu verhindern. </li><li> Suchen Sie das Gefäßsystem des zuvor ausgedünnten Schädel zugrunde. Verwenden Schwanzveneninjektion von FITC-Dextran, das Vorhandensein der vorher induzierten Gerinnsel verifizieren. </li><li> Verwenden Sie 6,0 Monofilamentnahtmaterial die in zu schließenscheidung über den Schädel. Zeigen antibiotische Salbe entlang der Nahtlinie, um eine Infektion zu verhindern. Injizieren Buprenex (0,05 mg / kg) subkutan alle 12 Stunden für drei Tage für die Schmerztherapie. </li><li> Gibt die Maus auf eine Wiedergewinnungskammer nach der Entfernung aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen und frei bewegen. </li></ol></li></ol> 6. Prüfung von Stroke Induction (Post-mortem) <ol><li> Am Ende der Studie, überprüfen Schlagvolumen mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung wie in Abbildung 5 dargestellt. Die vollständige Methode kann in 12 gefunden werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Fähigkeit, experimentellem Schlaganfall Pathophysiologie vom Tier zum Menschen Anwendung übersetzen mit Ausfall geplagt. Jedoch ist die Verwendung von Tiermodellen, wie dem photothrombosis Modell ermöglicht ein besseres Verständnis der Pathophysiologie und der Hub der Erforschung neuer Therapieansätze für die Neuroprotektion bereitzustellen nach einem Schlaganfall. Kleine Schlaganfällen und kortikaler Mikroinfarkten durch die photothrombotic Modell produziert werden, sind klinisch relevant subklinischer oder ...

Die beschriebene Technik ermöglicht die Visualisierung der in vivo zellulären Reaktionen unmittelbar nach der Induktion von Rose Bengal photothrombosis in einer intakten Maus. Rose Bengal (4,5,6,7-Tetrachlor-2 &#39;, 4&#39;, 5 &#39;, 7&#39;-tetraiodofluorescein) ist eine lichtempfindliche Farbstoff verwendet werden, um einen ischämischen Schlaganfall bei Tiermodellen (Maus und Ratte) induzieren. Nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließender Bestrahlung durch einen ausgedünnten Schädel mit einem 564 nm-Laserlicht wird ein Thrombus induzierte verursacht eine physiologische Takt 1. Das Verfahren wurde ursprünglich von Rosenblum und El-Sabban 1977 beschrieben ist, und wurde später von Watson in der Mitte der 1980er Jahre 1,2 angepasst. Kurz gesagt wird Rose Bengal mit grünen Anregungslicht (561 nm-Laser in unserem Fall), welche die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die anschließend aktiviert Gewebefaktor, einen Initiator der Gerinnungskaskade generiert bestrahlt. Die Induktion der Koagulationskaskade erzeugt eine ischämische lesIonen, die pathologisch relevanten klinischen Schlaganfall 3 ist. Hub hat eine komplexe Pathophysiologie aufgrund des Zusammenspiels von vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Endothel und das Immunsystem. Die Auswahl der besten Technik zu studieren, ein bestimmter zellulärer Prozess erfordert mehrere Überlegungen. Experimentelle Techniken fallen grob in eine von drei Kategorien: in vitro, in vivo und in silico mit mit jeweils Vor- und Nachteile In-vitro-Studien haben den Hauptnachteil Entfernung von Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung und daher nicht Effekte in einer intakten gesehen reproduzieren. lebenden Tier. In-vivo-Techniken für eine verbesserte experimentelle Replikation von Krankheitszuständen mit erhöhter Translations Bedeutung. In silico bezieht sich allgemein auf Computermodellierung von einer Erkrankung oder eines zellulären Prozess, und während zunehmend genutzt, um potenzielle Wechselwirkungen für die Prüfung lernenweise alle Informationen zusammengetragen sind immer noch in lebenden Zellen oder Gewebe getestet werden. Das ideale Modell für Schlaganfall in der Laborumgebung sollte ähnlich pathologischen Merkmale mit den in der menschlichen Bevölkerung gesehen zeigen. Zwar gibt es gemeinsame physiologische Eigenschaften von Schlaganfall in der menschlichen Bevölkerung, gibt es auch viele Unterschiede in Abhängigkeit von der Art der Verletzung erfahren. Stroke in der menschlichen Bevölkerung tritt als kleine oder große Gefäßverschlüssen, hämorrhagische Läsionen und Arterie zu Arterie oder Herz-Kreislauf-Embolien, die in vielfältigen Infarktvolumen als auch Unterschiede in Mechanismen, um jede Pathologie führen. Der Vorteil der Verwendung von Tiermodellen Schlaganfall ist die Erzeugung von reproduzierbaren Infarkten, die Eigenschaften des menschlichen Schlaganfall zu imitieren. Die häufigsten Tiertaktmodelle umfassen Arterienverschluss mit: A. cerebri media Okklusion (Embolie oder endovaskuläre Filament-Verfahren), welche Modelle distalen MCAO und die photothrombosis Modell. Die Vorteile einerd Nachteile der einzelnen Modelle wurden an anderer Stelle (siehe 4 und 5). Globale ischämischen Modellen (MCAO), während relativ einfach durchzuführen sind weniger relevant für die menschliche Schlaganfall sind als Brenntaktmodelle. Darüber hinaus sind diese Verfahren sehr variabel zu induzieren reproduzierbare Hirninfarkt Läsionen. Die photothrombosis Modell ist sehr gut reproduzierbar, solange der Experimentator steuert ihre Experimente gut und bietet einen klaren Vorteil gegenüber MCAO-Modelle. Aufgrund Mikrovaskulatur Beleidigung das Modell ist beschrieben worden, um eine minimale ischämischen Penumbra, das Gebiet, in dem Zellen dachte salvageable 6,7 zu sein anzuzeigen. Zusätzlich kann ein vasogenes Ödem und zytotoxische Ödembildung auch nach einer Bestrahlung der Bildfläche induziert werden. Trotz dieser Einschränkungen ist die Technik neue Einblicke in vielen physiologischen Prozessen nach Schlaganfall 8, 9, 10, 11 vorgesehen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>330000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>088-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF&#160;</td>
			<td>126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>500-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors 14 cm</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>12-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont High Tech #5 style, straight</td>
			<td>Bioindustrial Products</td>
			<td>TWZ-301.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabJack 132X80</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>123-6670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platform for Labjack 8X 8</td>
			<td>Optosigma Co</td>
			<td>145-1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ear bar holder from stereotaxic setup</td>
			<td>Stoelting/Cyborg</td>
			<td>51654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>15001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tech IV Isoflurane vaporizer</td>
			<td>DRE, Inc.</td>
			<td>34001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F Air Canister</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>80120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bain circuit breathing tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>86111B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent adapter for bain tube</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>891000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 regulator for oxygen tanks</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>CE001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent induction chamber</td>
			<td>DRE, Inc</td>
			<td>15004C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle</td>
			<td>Suture Express</td>
			<td>1639G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective inverter Optical Adapter</td>
			<td>LSM technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foredom drill Dual voltage 110/120</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>134.53</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rose bengal photothrombosis by confocal optical imaging in vivo: a model of single vessel stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Das Ziel dieses Verfahrens war es, ein Schlaganfall in Tiermodellen (Maus und Ratte) nach einer Bolus-Injektion von RB durch die Schwanzvene und anschließende Beleuchtung einer dünnt Schädel mit einem 561 nm Laserlicht zu induzieren. Die Bilder in Figur 4 zeigen den Verlauf der Gerinnselbildung in einem einzigen Gefäß nach Bestrahlung des Bereichs auf 0, 1, 1,5 und 2 min. Vor der Gerinnselbildung der gesamte Behälter ist weiß aufgrund fließt Rose Bengal zu befreien. Nach der Induktion der Bestra...

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Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengal Photothrombosis von konfokalen optischen Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Ein Modell des Einzelfahrzeug Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

14.9K Aufrufe.  The University of Texas Health Science Center San Antonio. Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection. 

Serie: Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Non-invasive optische Messung des zerebralen Metabolismus und Hämodynamik bei Säuglingen

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Forschung

Medizin

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

Einem Mausmodell der Subarachnoidalblutung

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapie-induzierte vaskuläre Toxizität - Echtzeit-<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Photothrombosis induzierte fokale Ischämie als ein Modell der Rückenmarksverletzungen in Mäusen

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

Der 4-Gefäß-Stichprobenansatz für integrative Studien der menschlichen Plazenta-Physiologie<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...