Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health gewähren 1K22AI097291-01 und von der Nationalen Zentrum für die Förderung der Translational Sciences der National Institutes of Health unter Preis Anzahl UL1TR000433. Wir erkennen auch Prof. Darrell Irvine am MIT und Prof. Matthias Stephan am Fred Hutchinson Cancer Center für ihren Beitrag auf der ersten Arbeiten auf den Impfstoff Nanopartikeln und OT-I / Luc transgenen Mäusen.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden von der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren (UCUCA) an der Universität von Michigan nach den Verhaltensregeln und Richtlinien genehmigt und durchgeführt. Mit Protein-Antigen und Adjuvans Molecules 1. Synthese und Charakterisierung von ICMVs CO bela <ol><li> Mix 1: 1-Molverhältnis von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p maleimidophenyl) butyramido] (MPB) in Chloroform, wobei die Gesamtlipidmenge bei 1,26 umol pro Charge (das heißt, 500 &amp; mgr; g von DOPC und 630 ug MPB) in einem 20 ml Glasröhrchen (Durchmesser = 28 mm und Höhe = 61 mm). </li><li> Hinzuzufügen lipophile Arzneimittel, wie Monophosphoryl-Lipid A (MPLA) oder lipophilen Farbstoffen (zB DID), um die Lipidlösung in gewünschte Konzentration. Gründlich zu entfernen des organischen Lösungsmittels durch Spülen mit extra dry nitrogen Gas- und indem die Proben unter Vakuum O / N. </li><li> Hydratisieren des Lipidfilms durch Zugabe von 200 ul 10 mM Bis-Tris-Propan (BTP, pH 7,0), enthaltend wasserlösliche Medikamente (zB Protein-Antigene). Vortex für 10 Sekunden alle 10 Minuten für 1 Stunde bei RT. </li><li> Übertragen Sie den Inhalt aus dem Glasfläschchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Ort Proben in einem Eis-Wasser-Bad und beschallen kontinuierlich für 5 min mit der Intensität von 40% Einstellung auf einem 125 W / 20 kHz-Sonde-Spitze Ultraschallgerät. </li><li> In 4 ul 150 mM Dithiothreitol (DTT) zu jeder Charge (Arbeitskonzentration 2,4 mM), Wirbel, und kurz Zentrifuge unter Verwendung eines Tischmikrozentrifuge. </li><li> In 40 ul 200 mM CaCl 2 und mit der Pipette (Arbeitskonzentration 33 mM) zu mischen. Proben bei 37 ° C für 1 Stunde zur Vernetzung des MPB-enthaltende Lipidschichten mit DTT zu ermöglichen. </li><li> Centrifuge Proben bei 20.000 · g für 15 Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 200 ul ddiH 2 O. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,7 und Zentrifuge wieder nach dem zweiten ddiH 2 O zu waschen, um CaCl 2, nicht umgesetzten DTT und nicht verkapselten Fracht Materialien aus dem Überstand zu entfernen. </li><li> Herstellung von 10 mg / ml 2 kDa Polyethylenglycol-thiol (PEG-SH) in ddiH 2 O. Resuspendieren jedes ICMV Probe in 100 ul PEG-SH-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Führen Sie zwei ddiH 2 O Wäschen (Schritt 1.7) und resuspendieren die endgültige ICMV Pellet in PBS und bei 4 ° C. Vor dem Gebrauch mischen ICMV Suspension, als Partikel auf den Boden nach längerer Lagerung zu begleichen. </li><li> Zur Charakterisierung der Partikel, Entnahme einer kleinen Aliquot (~ 10%) der ICMVs aus jeder Charge und einzeln in einem Gesamtvolumen von 1 ml ddiH 2 O verdünnen Platzieren einer einzigen Probe in einem Zetasizer Zelle und Messung Teilchengröße Polydispersitätsindex und Zeta-Potential der Proben unter Verwendung eines DLS und Zetapotential-Messsystem (nach dem Protokoll des Herstellers). </li></ol> 2. Prüfung der Lymphknotens von Fluoreszenz-markierten ICMVs mit konfokale Mikroskopie <ol><li> Vorbereitung der ICMVs mit Fluorophor-markierten Antigen und lipophilen Fluoreszenzfarbstoff beladen <ol><li> Vorbereitung Fluorophor-markierten Protein, wie Ovalbumin mit Alexa Fluor 555-succinimidylester umgesetzt, entsprechend der Anleitung des Herstellers. </li><li> Um ICMVs mit Fluorophor in der Lipidhülle versehen vorzubereiten, fügen lipophilen Fluoreszenzfarbstoff (zB 1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) während der Herstellung der Lipidfilm (Schritt 1.2) mit 0,05% molaren Lipidmenge. Für Lipidfilm Flüssigkeitszufuhr (Schritt 1.3), Verwendung Puffer, der Fluorophor-markierten Antigen und komplette ICMV Synthese wie in Schritten von 1,4 bis 1,11 dargestellt. </li></ol></li><li> Die subkutane Verabreichung von Nanopartikeln an Schwanzbasis <ol><li> Betäuben Maus mit einem kontrollierten Fluss Verdampfer mit einer Induktionskammer u ausgestattettilizing 3% Isofluran und 1,5 l / min Sauerstoff Strom gemäß einer IACUC genehmigt Tier-Protokoll. Sobald die Maus bewusstlos ist, führen Sie folgende Schritte schnell vor der Narkose nachlässt, um optimalen Zugang zu der Stelle der Injektion zu ermöglichen und zu minimieren Beschwerden an das Tier. Alternativ können Sie einen gut passenden Nasenkegel auf die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Wenn Mäuse länger als 5 min narkotisiert, gelten Augenschmier notwendig, Reizung nach dem Eingriff zu minimieren. </li><li> Sprühen Sie die Basis des Schwanzes mit 70% Ethanol zu desinfizieren und nass das Pelzteil das nasse Haar, ein kleines Stück Haut sichtbar, die verwendet werden kann, um die Nadel unter die Haut sichtbar zu schützen. </li><li> Vorbereitung Partikelinjektionssuspension enthaltend gewünschte Menge an Antigen und Adjuvans pro 100 ul Impfdosis in PBS (beispielsweise 10 &amp; mgr; g OVA und 0,3 &amp; mgr; g MPLA pro 100 ul Injektionsdosis wurde in der Vergangenheit 6,9 verwendet wurde). </li><li> Zeichnen Sie die Partikelsuspension intoa Spritze mit einer 27-29 G Nadel und führen Sie die Nadel an der Basis des Schwanzes (~ 5 mm vom Haaransatz) mit der Fase nach oben ein und injizieren 50 ul der Partikelsuspension 22. </li><li> Warten Sie einige Sekunden für Druckausgleich, um übermäßige Rückströmung zu verhindern, und ziehen Sie die Nadel heraus. Ist die Einspritzung auf der anderen Seite der Schwanzbasis auf beiden Ablaßleisten LNs zielen. </li></ol></li><li> Vorbereitung von Lymphknotengefrierschnitten und Prüfung mit der konfokalen Mikroskopie. <ol><li> Euthanize die Maus mit CO 2 Ersticken, gefolgt von induzierten Pneumothorax nach ein IACUC genehmigten Tier Protokoll. Auszug Leisten LNs nach Protokoll in Bedoya 23 gezeigt und waschen das Blut, indem das Gewebe in 1 ml 4 ° C PBS. </li><li> Absorbieren die PBS aus dem Gewebe mit Gewebe und legen Gewebe in Gewebe cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) an die Spitze vorgefüllt mit Oktober Einfriermedium 24. Snap einfrieren tisverklagen Block in flüssigem Stickstoff für 30 Sekunden. Alternativ legen Gewebeblock auf Trockeneis für 30 min. Speichern gefrorenen Gewebe in -80 ° C Tiefkühltruhe. </li><li> Schneiden Gewebeschnitte 5-10 um dick in einem Kryostat bei -20 ° C 24 gesetzt. </li><li> Falls erforderlich, Immunfluoreszenz Etikettierung, und untersuchen das Gewebe mit der konfokalen Mikroskopie, wie zuvor gezeigt 24. </li></ol></li></ol> 3. Überwachung Expansion von Antigen-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen nach der Nanopartikel-Impfung mit ganzen Tier Imaging <ol><li> Isolierung des OVA 257-264-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen von OT-I / Luc transgenen Mäusen <ol><li> Euthanize eine OT-I / Luc transgene Maus mit CO 2 Ersticken und induzieren ein Pneumothorax nach einem IACUC genehmigten Tier Protokoll. Ernten der Milz steril durch Zugriff auf die Bauchhöhle und sorgfältig Ablösen der Gewebe aus dem Pankreas 23 undin 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS für die Übertragung auf Gewebekultur Kapuze. </li><li> Platzieren der Milz auf einem 70 &amp; mgr; m Nylon-Sieb über ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen (bis zu 3 Milz zu einem Zeitpunkt). Verwendung eines Kolbens von einer 3-ml-Spritze, mahlen die Zellen durch das Sieb. </li><li> Waschen Sie den Kolben und das Sieb mit PBS + 2% FBS und entsorgen. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 10 ml / Milz in der 50 ml Tube, nehmen Sie eine kleine Probe der Zellsuspension mit einem Hämocytometer zählen, und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g. </li><li> Mit einem handelsüblichen Magnet negative Selektion Kit, isolieren die CD8 + T-Zell-Population, indem Sie den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nach Waschen der Zellen mit PBS, zählen die Anzahl der isolierten CD8 + T-Zellen. Die Reinheit der isolierten CD8 + T-Zellen zu bewerten, inkubieren ~ 20.000-30.000 Zellen in 20 ul Maus CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) für 10 min, anschließend werden 20 ul αCD8-APC-Antikörper (0,005 mg / ml) und Inkubation für 30 min. Perform alle Inkubationen bei 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Zuführen Durchflusszytometrieanalyse 25. </li></ol></li><li> Der adoptive Transfer von isolierten CD8 + T-Zellen und Visualisierung ihrer Expansion nach der Impfung <ol><li> Zuführen adoptiven Transfer von isolierten OT-I / Luc CD8 + T-Zellen in naiven C57BL / 6-Mäusen durch Verabreichung 1-10 x 10 5 Zellen in einem 200 &amp; mgr; l Volumen von PBS durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene 22 (Tag -1). In Anbetracht, dass Pelz und schwarze Flecken auf der Haut in C57BL / 6-Mäuse können mit dem Biolumineszenz-Signal stören, sind rasiert Albino C57BL / 6-Mäuse ideal für diese Studien. </li><li> Nach einem Tag (Tag 0), zur Verwaltung der Impfstoff wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.2). </li><li> Verwalten 150 mg Luciferin pro kg Körpergewicht der Maus intraperitoneal in einem 300 &amp; mgr; l Volumen von PBS. Nach 10 min zu betäuben die Mäuse mit Isofluran (wie in Schritt 2.2.1) und zu visualisieren OT-I / Luc CD8 + T-Zellen durch den Erwerb der Biolumineszenz-Signal für 5-10 min wit einem ganzen Tier Abbildungssystem (IVIS, siehe Wilson 26 für detaillierte Anleitung). Wiederholen Sie dies für Langzeitstudien wie nötig. </li></ol></li></ol> 4. Peptid-MHC-Tetramer-Färbung von PBMCs für die Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen Anmerkung: Die folgenden Protokollprozedur kann entweder C57BL / 6-Mäuse adoptiv mit OT-I / Luc CD8 + T-Zellen oder C57BL / 6-Mäusen ohne die adoptive Übertragung übertragen geführt werden. <ol><li> Bei einem gewünschten Zeitpunkt nach der Impfung, sammeln etwa 100 ul Blut (4-6 Tropfen) von Mäusen über submandibular Blutungstechnik 27 in ein Rohr mit K 2 EDTA beschichteten und invertieren mehrere Male, um die Gerinnung zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie 100 ul Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 1 ml Lysepuffer, und Inkubation für 2 bis 3 min, um die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zu entfernen. Centrifuge Proben für 5 min bei 1.500 xg und entfernen Sie den Überstand. Wenn das Pellet noch einppears rot (zeigt unvollständige Entfernung der roten Blutkörperchen), wiederholen Sie die Lyse mit einer kurzen Inkubationszeit (&lt;1 min) Lysepuffer. </li><li> Waschen der verbleibenden PBMCs mit 1 ml FACS-Puffer (PBS + 1% w / v BSA) und Zentrifugieren bei 1500 × g für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Probe in 20 ul Maus-CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) zu unspezifisch und FcR-vermittelte Antikörper blockieren die Bindung. Inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Übertragen Zellen von Mikrozentrifugenröhrchen in 4 ml-Rund FACS-Röhrchen. Mit 20 ul H-2K b OVA Tetramer-SIINFEKL-PE-Lösung nach den Angaben des Herstellers zu jeder Probe und inkubiere für 30 min auf Eis. </li><li> Bereiten Sie die Antikörper-Cocktail (zB αCD8-APC, αCD44-FITC und αCD62L-PECy7 Antikörper (0,005, 0,005 und 0,002 mg / ml-Konzentration, respectively)). In 20 ul zu jeder experimentellen Probe und Inkubation für 20 min auf Eis. Bereiten einzigen Fluorophor Kontrollen labeling Zellen mit jeder Fluorophor-markierten Tetramer oder Antikörper in der oben angegebenen Konzentration. </li><li> Mit FACS-Puffer waschen 2mal und resuspendieren Endpellet in FACS-Puffer, enthaltend 2 ug / ml DAPI. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie-Analyse (Details und Beispiele können in Scheffold 25 zu finden). </li></ol>

Perkin Elmer, sofern die Produktionskosten bei der Veröffentlichung dieses Artikels entstehen.

Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines neuen lipidbasierte Nanopartikel System bezeichnet ICMVs und liefert das Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit der Nanopartikel-Impfstoffformulierungen zu Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten induzieren. ICMV Synthese in allen wässrigen Zustand, was ein großer Vorteil ist, verglichen mit anderen gemeinhin verwendeten polymeren Nanopartikelsysteme (zB Poly (lactid-co-glycolid) Säurepartikel), die typi...

Traditionelle Impfstoffentwicklung hat überwiegend beschäftigt die empirischen Ansatz von Versuch und Irrtum. Jedoch mit der jüngsten Entwicklung einer breiten Palette von Biomaterialien und Entdeckung von molekularen Determinanten Aktivierung des Immunsystems ist es nun möglich, rationell Vakzinformulierungen mit biophysikalische und biochemische Hinweise von Pathogenen 1,2 abgeleitet. Insbesondere wurden verschiedene partikulären Drug-Delivery-Plattformen als Impfstoffträger, da sie mit Untereinheiten-Antigenen und immunstimulierende Mittel gemeinsam geladen werden untersucht, Impfstoffkomponenten Schutz vor Abbau, verbessern und ihre Co-Lieferung an präsentierenden Zellen Antigen (APCs) mit Wohnsitz in der Lymphe Knoten (LNS), damit die Maximierung Immunstimulation und Aktivierung 3-5. In diesem Bericht beschreiben wir die Synthese eines &quot;pathogen-imitiert&quot; Nanopartikel-System, genannt interbilayer netzten multilamellare Vesikel (ICMVs), die zuvor als ein potenter Impfstoff platfor demonstriert wordenm für die Auslösung robust zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und humorale Immunreaktionen sowohl systemische und Schleimhautgewebe Fächer 6-9. Insbesondere erzielte Impfung mit ICMVs wesentlichen Serum-IgG-Ebenen verstärkt gegen eine Malaria-Antigen, gegenüber der Impfung mit üblichen Hilfsmitteln (zB Alaun und Montanide) 7 und auch ausgelöste starke CTL-Antworten gegen Tumorzellen und virale Herausforderung Modellen in Mäusen 9. Hier mit ICMVs als Modell-Impfstoff Nanopartikelsystem beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung von Nano-Impfstoff-Formulierungen, einschließlich Partikelgröße und Zetapotentialmessungen und Verfolgung von Menschenhandel zu Partikel Ablassen LNs (DLNs) nutzen konfokale Bildgebung von Gewebe gefriergeschnitten 7. Zusätzlich stellen wir eine Ganztier-Bildgebung basierte Verfahren zum Analysieren Expansion von CTL-Antworten in Mäusen nach dem adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierende Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen 9,10. Schließlich definieren wirRitz Tetramerfärbung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu Längs Quantifizierung der endogenen T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit Nanopartikeln 6,9 geimpft. ICMVs eine lipidbasierte Nanopartikel-Formulierung durch kontrollierte Fusion von Liposomen einfach synthetisiert in multilamellaren Strukturen, die dann chemisch durch Vernetzung Maleimid-funktionalisierten Phospholipid-Kopfgruppen in Lipidschichten mit Dithiol Vernetzer 6 stabilisiert werden. Sobald ICMVs synthetisiert werden, kann ein kleiner Anteil von Nanopartikeln verwendet werden, um Teilchengröße und Zeta-Potential (das heißt, die Oberflächenladung der Teilchen) mit einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) System und ein Zeta-Potential-Analysegerät ermitteln. DLS misst Änderungen der Lichtstreuung in Partikelsuspensionen, was die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten und die hydrodynamische Größe von Partikeln 11. Konsistente Teilchengröße von Charge zu Charge Synthese kritischDa Teilchengröße gehört zu den wichtigsten Faktoren, die Lymphdrainage Impfstoffpartikel DLNs und anschließende zelluläre Aufnahme durch APCs 12,13. Zusätzlich kann Zetapotential durch Messen der Partikelgeschwindigkeit, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, die Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Partikeln und Partikeloberflächenladung 11 können erhalten werden. Konsistente Werte Zeta-Potential von Teilchen ist wichtig, da Oberflächenladung der Teilchen bestimmt, kolloidale Stabilität, die direkten Einfluss auf die Dispersion während der Lagerung und nach der Verabreichung in vivo 14,15 hat. Um die Partikellokalisierungs zu DLNs verfolgen, können ICMVs mit gewünschten Fluorophore einschließlich lipophilen Farbstoffen und kovalent-markierten Antigene bezeichnet werden. Nach der Immunisierung können Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten getötet werden, DLNs reseziert gefriergeschnitten und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von lymphatischen draining sowohl der Nanopartikel Impfstoffträger und Antigen DLNs. Die Gewebeschnitte können zusätzlich mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und verwendet, um weitere Informationen zu erhalten, wie die Typen von Zellen mit dem Antigen, und die Bildung von Keimzentren assoziiert gefärbt, wie wir vorher 7 gezeigt werden. Sobald die Partikelsynthese optimiert und Handels den DLNs bestätigt wird, ist es wichtig, Auslösung in vivo CTL-Expansion zu validieren. Um Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + -T-Zellen als Reaktion auf die Impfung Nanopartikel zu analysieren, haben wir eine Modellantigen, Ovalbumin (OVA) verwendet, die mit OVA 257-264-Peptid (SIINFEKL) immun CD8 + T-Zell-Epitop, das detaillierte immunologischen Analysen ermöglicht von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten für die anfängliche Entwicklung von Impfstoffen 16,17. Insbesondere, um die Dynamik der Expansion und Migration von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen zu befragen, erzeugten wir haben eindoppelt transgenen Mausmodell durch Kreuzung Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden transgenen Mäusen (Luc) mit OT-I-transgenen Mäusen, die CD8 + T-Zellen mit T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für SIINFEKL (in Verbindung mit H-2K b) besitzen. Aus diesen OT-I / Luc Mäusen, Luciferase-exprimierenden kann OT-I CD8 + -T-Zellen isoliert und zur adoptiven Transfer in naiven C57BL / 6-Mäusen hergestellt werden. Sobald ausgesät werden erfolgreiche Immunisierung mit OVA haltigen Nanopartikeln in Expansion der übertragenen T-Zellen, die durch die Überwachung des Biolumineszenz-Signals mit einem ganzen Tier Abbildungssystems 9,10 verfolgt werden können führen. Diese nicht-invasive Ganzkörper-Bildgebung Technik hat mit anderen viralen oder Tumorantigene, die in der Vergangenheit 18-20 angewandt, sodass Prozesse in T-Zell-Expansion in Lymphgewebe und Verbreitung in die peripheren Gewebe in Längs Weise beteiligt. Komplementär zur Analyse adoptiv transferierte Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen, endogenous T-Zell-Reaktionen nach der Impfung mit dem Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Tetramer-Assay 21, bei dem ein Peptid-MHC-Tetramer-Komplex, bestehend aus vier Fluorophor-markierten MHC-Klasse I-Moleküle mit Peptid beladen Epitope untersucht werden, wird verwendet, TCR und Etiketten CD8 + T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu binden. Der Peptid-MHC-Tetramer-Assay kann entweder im Terminal Nekropsie Studien zur Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in lymphoiden und peripheren Gewebe zu identifizieren oder in Langzeitstudien mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von der seriellen Blutabnahmen durchgeführt werden, erhalten. Nach Färbung Lymphozyten mit Peptid-MHC-Tetramer, Durchflusszytometrie Analyse wird für detailliertere Analysen auf den Phänotyp von CTLs oder Quantifizierung ihrer Häufigkeit bei CD8 + T-Zellen durchgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Die bei der Synthese von ICMVs beteiligten Schritte sind in Figur 1 6 gezeigt. Kurz gesagt wird ein Lipidfilm keine lipophilen Arzneimitteln oder Fluoreszenzfarbstoffe enthält in Gegenwart von hydrophilen Arzneimitteln hydratisiert. Zweiwertige Kationen, wie Ca 2+, werden zugegeben, um die Fusion von anionischen Liposomen in multilamellaren Vesikeln zu fahren. Dithiol-Vernetzer, wie beispielsweise DTT, auf apposing Lipidschichten und schließlich verbleibenden externen Maleimidgru...

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Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Aufrufe.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Serie: Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Gleichzeitige Quantifizierung von Anti-Vektor- und Anti-Transgen-spezifische CD8+ T Zellen über MHC Tetramer Färbung nach der Impfung mit viralen Vektoren

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

Ein DNA/Ki67-basierter Durchflusszytometrie-Assay zur Zellzyklusanalyse von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen bei geimpften Mäusen

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...