CD8+T-Zellen tragen unterschiedliche Merkmale in verschiedenen Geweben, als kritisches Beispiel für nicht-mukoseses und nicht-lymphoides Gewebe. Es ist wichtig, nierenresidente Zellen direkt zu charakterisieren, um die T-Zellbiologie vollständig zu verstehen. Hier zeigen wir unsere praktische Methode, um nierenresidente CD8+T-Zellen zu isolieren, die eine nachfolgende Durchflusszytometrieanalyse aufnehmen.
Diese Methode könnte Einblick in die Studien von Effektor und Speicher CD8 + T-Zellen nach Infektionen sowie Autoimmunreaktionen erzeugt geben. Das Verfahren wird von Dr.Chaoyu Ma, einem Forscher für mein Labor, durchgeführt. Beginnen Sie mit der Verdünnung von Biotin anti CD8 Alpha Antikörper auf 15 Mikrogramm pro Milliliter in PBS, stellen Sie sicher, dass es genug, um 200 Mikroliter zu jeder Maus zu verabreichen.
Vor der Injektion die Schwanzvene der Maus mit einer Wärmelampe über Dementhon fünf bis zehn Minuten erhitzen, um sie zu verdünnen. Ziehen Sie 200 Mikroliter des vorverdünnten Antikörpers in eine 28-Spur-Insulinspritze und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie den Kolben nach oben und unten bewegen. Biegen Sie die Nadel, um einen 150-Grad-Winkel zwischen der Nadel und der Spritze zu schaffen, abschrägen, so dass die Nadel parallel zur Schwanzvene ist.
Halten Sie die Maus mit einem Nagetier-Restrainer zurück und sprühen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol, um die Vene deutlich sichtbar zu machen. Halten Sie den Schwanz am distalen Ende mit dem Daumen und Mittelfinger der nicht-dominanten Hand, dann legen Sie den Zeigefinger unter die Injektionsstelle. Mit der dominanten Hand die Nadel parallel in die Herzrichtung einstecken und langsam 200 Mikroliter des Antikörpers injizieren.
Entfernen Sie die Nadel und komprimieren Sie die Injektionsstelle, bis die Blutung aufhört. Nach der Einschläferung der Maus die Niere mit einer Schere sezieren und in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Lassen Sie die Proben bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis.
Bereiten Sie sechs-Well-Platten mit drei Milliliter Nat-Der-Faullösung in jedem Brunnen, mit einem Brunnen pro Maus, und lagern Sie sie auf Eis. Fügen Sie 300 Mikroliter Verdauungslösung in jedes Probenröhrchen und Hacken der Nierenproben mit einer geraden Federschere. Übertragen Sie die gehackten Nierenproben mit der Verdauungslösung auf die Sechs-Brunnen-Platten.
Die Proben bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schaukeln 45 Minuten lang inkubieren, dann mit dem Kolbenflansch einer Drei-Milliliter-Spritze homogenisieren und in 15-Milliliter-Konusröhren übertragen. Drehen Sie die Proben bei 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten nach unten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in drei Milliliter n.R.O. mit 10%FCS wieder auf.
Drehen Sie die Probe bei 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten, entfernen Sie dann den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern 44%Dichte Gradienten Medium und RPMI-Mix wieder auf. Legen Sie die Spitze einer Drei-Milliliter-Pipette mit drei Millilitern 67%Dichte Gradientenmedium und PBS direkt an den Boden jedes Rohres und lösen Sie die Lösung langsam los, so dass die schwere Lösung eine deutliche Schicht am Boden bildet. Drehen Sie die Proben mit 900 mal g für 20 Minuten mit reduzierten Gaspedal- und Bremseinstellungen, dann entfernen Sie vorsichtig die Rohre aus der Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören.
Entfernen Sie die obere Schicht mit einer Transferpipette, ohne die Lymphozytenschicht zu berühren, und übertragen Sie die Lymphozytenschicht in ein neues 15-Milliliter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit PBS und 5%FCS, dann mischen, indem Sie langsam invertieren das Rohr vier bis sechs Mal. Nach der Zentrifugierung der Proben bei 500 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 500 Mikroliter nkomplettem RPMI-Medium wieder auf.
Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometriefärbung. Selbst nach der Dichtezentrifugations-vermittelten Lymphozytenanreicherung war es sehr häufig, einen großen Teil der Nichtlymphozyten im Endprodukt zu sehen. Nach dem Gewinn an lebenden Lymphozyten waren CD8+T-Lymphozyten jedoch leicht zu identifizieren.
Wie erwartet, nur extra-vaskuläre CD8 +T-Zellen effizient erfasst Gewebe Resident Memory T-Zell-Phänotypen, wie Upregulation von CD69 und Downregulation von Ly6C. Im Gegensatz zu den infizierten Mäusen wurden die überwiegende Mehrheit der CD8+T-Zellen, die von jungen naiven Mäusen isoliert wurden, die in der SPF-Anlage untergebracht waren, mit CD8-Alpha-Antikörpern gekennzeichnet und gehörten daher zum intravaskulären Fach. Diese Technik hat die Untersuchung von geweberesidenten Immunzellen in dicht vaskularisierten Organen stark beschleunigt.
