Unser Protokoll bietet einen praktischen Ansatz, mit dem Milz und Lymphknoten der Maus verwendet werden können, um die Dynamik der T-Zell-Antwort stärker widerzuspiegeln als eine phänotypische Momentaufnahme im stationären Zustand. Unsere Technik detektiert empfindlich antigenspezifische CD8-T-Zellen, die an einer laufenden Reaktion beteiligt sind. Proliferierende CD8-T-Zellen werden ohne die möglicherweise verwirrenden Wirkungen einer In-vivo-Medikamentbehandlung oder eines Zelltransfers gemessen.
Unsere Technik kann in verschiedenen Situationen ein Fenster in der Immundynamik bieten. Zum Beispiel in Bezug auf das Ansprechen auf Impfungen und Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebsimmuntherapie. Bereiten Sie frischen 1x Permeabilisierungswaschpuffer vor, indem Sie 10x Permeabilisierungspuffer mit destilliertem Wasser verdünnen und durch einen 0,45 Mikrometer Filter filtern, um Aggregate zu entfernen.
Verdünnter monoklonaler Antikörper Ki67 FITC in 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer, bestimmt mit einem Titrationsexperiment für ein Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Probe. 3 Milliliter des 1x Permeabilisierungs-Waschpuffers in jedes Röhrchen mit Zellen geben und bei 400 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
Fügen Sie erneut den 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie dann den Überstand. 100 Mikroliter des verdünnten monoklonalen Antikörpers Ki67 FITC in das Pellet geben, dann wirbeln und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit 4 Millilitern 1x Permeabilisierungspuffer, zentrifugieren Sie nach jeder Wäsche und verwerfen Sie den Überstand. Geben Sie 350 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die direkt am Durchflusszytometer entnommen werden sollen, und 250 Mikroliter PBS in das Zellpellet für Proben, die mit Hoechst für die DNA-Färbung inkubiert werden sollen. Hoechst- und PBS-Lösung vorbereiten und zu jeder Probe geben, so dass die Endkonzentration zwei Mikrogramm pro Milliliter beträgt.
Wirbeln und inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten im Dunkeln. Dann zentrifugieren Sie die Proben für fünf Minuten und geben Sie 350 Mikroliter PBS in das Zellpellet. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie verschiedene Gruppen, die den verschiedenen zu analysierenden Organen entsprechen, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf "Gruppe erstellen" klicken.
Öffnen Sie das geänderte Gruppenfenster durch Doppelklick auf den Gruppennamen und synchronisieren Sie die neu erstellten Gruppen, indem Sie ein Häkchen an der Funktion synchronisiert setzen. Ziehen Sie jede FCS-Datei in die entsprechende Gruppe und erstellen Sie dann eine Gating-Strategie, beginnend mit der a-LN-Gruppe. Öffnen Sie das Diagrammfenster, indem Sie auf die vollständig gebeizte Probe doppelklicken, um die für die Stichprobe erfassten ungefüllten Ereignisse in einem Punktdiagramm anzuzeigen.
Beachten Sie, dass die x- und y-Achse wie in den FCS-Dateien beschriftet sind, wie in Tabelle zwei der Durchflusszytometer-Einstellungsdatei dieses Manuskripts angegeben. Überprüfen Sie, ob eine ausreichende Anzahl von Ereignissen angezeigt wird, um eine geeignete Visualisierung zu ermöglichen. Öffnen Sie ggf. die Voreinstellungen, indem Sie auf das Herzsymbol im Arbeitsbereichsmenüband klicken, "Diagramme" und dann "Punktdiagramm" als Diagrammtyp auswählen und überprüfen Sie, ob die Anzahl der im entsprechenden Feld gezeichneten Punkte korrekt ist, oder ändern Sie sie.
Zeigen Sie die uneinheitlichen Ereignisse im Diagrammfenster in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und DNA-W auf der y-Achse an. Verwenden Sie lineare Skalierung für beide Achsen. Ändern Sie bei Bedarf die Skalierung von logarithmisch zu linear, indem Sie auf das mit einem T gekennzeichnete Kästchen in der Nähe jeder Achse im Diagrammfenster klicken.
Wählen Sie eine einzelne Zellpopulation aus, indem Sie im Gating-Werkzeugabschnitt auf rechteck klicken und dann in die Mitte des rechteckigen Tors doppelklicken, um einzelne Zellen in einem Punktdiagramm mit FSC-A-Parameter auf der x-Achse und totem Zellchip auf der y-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf das Polygon, um die lebende Zellpopulation auszuwählen, die negativ für den Totzellabster ist. Doppelklicken Sie in die Mitte des Polygongaters, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit dem Parameter FSC-A auf der x-Achse und dem Parameter SSC-A auf der y-Achse anzuzeigen.
Klicken Sie auf das Rechteck und erstellen Sie ein entspanntes Tor, um alle einzelnen lebenden Zellen in diesem Diagramm einzuschließen. Doppelklicken Sie in die Mitte des entspannten Tores, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit CD3 auf der x-Achse und CD8 auf der y-Achse anzuzeigen. Verwenden Sie die entsprechende Zugriffsskala für die Visualisierung im Diagrammfenster.
Ändern Sie bei Bedarf die x- und y-Skala, indem Sie auf das Kästchen klicken, das mit einem T in der Nähe jeder Achse gekennzeichnet ist, wählen Sie Zugriffsfunktion anpassen und ändern Sie bei Bedarf zusätzliche Neg-Jahrzehnte mit Basen und positiven Jahrzehnten. Markieren Sie die Zellen CD3+CD8+, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des CD3+CD8+-Gatters, um die Zellen in einem Punktplot mit Tetr-Gag auf der x-Achse und Pent-Gag auf der y-Achse anzuzeigen.
Wählen Sie die antigenspezifischen CD8 T-Zellen aus, indem Sie auf Polygon klicken. Doppelklicken Sie in die Mitte des Gag-spezifischen Tors, um die Zellen in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse anzuzeigen. Markieren Sie die Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen, indem Sie im Abschnitt "Gating-Werkzeug" des Diagrammfensters auf "Quad" klicken.
Kopieren Sie die in einem Beispiel erstellte Gating-Strategie in die entsprechende Gruppe, um die Gatter auf alle Stichproben der Gruppe anzuwenden. Kopieren Sie dann Gating-Strategien für die b-Milz- und CBM-Gruppen, wie im Textmanuskript beschrieben. Stellen Sie sicher, dass alle Gates für jede Stichprobe der drei Gruppen geeignet sind.
Bei Bedarf desynchronisieren Sie die Gruppe und ändern Sie die Gatter wie im Manuskript beschrieben. Zeigen Sie die BM-Zellen des entspannten Tores in einem Punktdiagramm mit DNA-A auf der x-Achse und Ki67 auf der y-Achse an. Visualisieren Sie die Ergebnisse, indem Sie im Menübandbereich des Arbeitsbereichs auf "Layout-Editor" klicken.
Ziehen Sie jedes Gate der Gating-Strategie im Beispielbereich in den Layout-Editor, und platzieren Sie die Plots entsprechend der Reihenfolge des Gatings. Ändern Sie bei Bedarf den Diagrammtyp, indem Sie auf das entsprechende Diagramm im Layout doppelklicken und den entsprechenden Typ im Diagrammdefinitionsfenster auswählen. Klicken Sie auf die Gruppe und iterieren Sie nach Funktionen auf dem Layoutband, um die Ergebnisse zu visualisieren, die in antigenspezifischen CD8-T-Zellen aus jedem Organ erhalten wurden, und verschiedene Proben zu vergleichen.
Visualisieren Sie die Ergebnisse von Knochenmarkzellen, die eine Positivkontrolle darstellen. Ein typisches Beispiel für die Zellzyklusanalyse von Knochenmarkzellen wird hier gezeigt. Das Protokoll ergab einen niedrigen Variationskoeffizienten von G0 bis G1 und G2 bis M DNA-Peaks, was auf eine ausgezeichnete Qualität der DNA-Färbung hinweist.
Eine fünfstufige Gating-Strategie wurde angewendet, um antigenspezifische CD8-Zellen zu identifizieren. Zwei Multimere wurden verwendet, um die Empfindlichkeit des Gag-spezifischen CD8-T-Zellnachweises bei geimpften Mäusen zu verbessern, ohne den Färbehintergrund bei unbehandelten Mäusen zu erhöhen. Gag-spezifische CD8-T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten und in der Milz enthalten einen hohen Anteil an Zellen in den S-G2/M-Phasen am dritten Tag nach dem Boost.
Darüber hinaus wiesen Gag-spezifische CD8-T-Zellen in den S-G2/M-Phasen einen hohen FSC-A und SSC-A auf, wenn sie auf die gesamten CD8-T-Zellen desselben Organs überlagert wurden. Offset-Histogramme zeigten, dass die CD62L-Expression durch Gag-spezifische CD8-T-Zellen niedrig war, wie für aktivierte T-Zellen erwartet, mit Ausnahme einiger Zellen in G0 in den Lymphknoten. Diese Methode wurde für T-Zellen entwickelt, um eine hervorragende Qualität der DNA-Färbung zusammen mit der Membran und der Ki67-Färbung zu erreichen.
Die Analyse der Durchflusszytometrie ist ein Schlüsselpunkt. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechende Steuerung für die Gate-Positionierung verwenden. Mit dieser Methode entdeckten wir T-Zellen in S-G2/M-Phasen des Zellzyklus im peripheren Blut der Maus und des Menschen.
Diese Technik war nützlich bei Immunüberwachungsstudien bei Typ-1-Diabetes, infektiöser Mononukleose und COVID-19.
