This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.

1. SU8 Meister Fabrication <ol><li> Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen für drei Schichtherstellungs Design-Software verwenden und die Entwürfe von einem Lieferanten auf der Leiterplatte Folie gedruckt mit 10 &amp; mgr; m Auflösung. Die Details der Gerätedesign sind in einem angeschlossenen Referenz 6 und die Kanalgeometrien sind in Abbildung 1 gezeigt , gegeben. Die Schichten sollten Ausrichtungsmarken sind auf Merkmale 8 von jeder Herstellungsschicht helfen collocate. </li><li> Legen Sie eine vorgereinigte 3 Zoll Durchmesser Silizium-Wafer auf einem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 Sekunden bei 1.750 Umdrehungen pro Minute, mit einer Schichtdicke von 80 &amp; mgr; m bereitstellt. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt weitergehen. </li><li> Setzen Sie die beschichtete Wafer auf der 1. Schicht Maske unter einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung Stellen Sie den Wafer auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 sec bei 5000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 40 um liefert. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen. </li><li> Richten Sie die 2. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 4 min 30 sec, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30sec bei 1000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 100 um bereitstellt. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen. </li><li> Richten Sie die 3. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 9 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Entwickeln der Masken durch in ein gerührtes Bad aus Propylenglykolmonomethylether-acetat während 30 min eingetaucht wird. Waschen Sie die Wafer in Isopropanol und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min. Platzieren Sie den entwickelten Master in einer 100 mm Petrischale für Polydimethylsiloxan (PDMS) Formen. </li></ol> 2. PDMS Gerätefertigung <ol><li> Bereiten Sie 10: 1 PDMS von 50 g Silikonbasis kombiniert mit 5 g Mittel in einem Plastikbecher zu heilen. Mischen Sie den Inhalt mit einem Drehwerkzeug mit einem Rührstab ausgestattet. Degals Gemisch in einem Exsikkator für 30 Minuten, oder bis alle Luftblasen entfernt werden. </li><li> Gießen Sie die PDMS mit einer Dicke von 3 mm über dem Master zu geben und zurück in den Exsikkator zur weiteren Entgasung. Sobald alle Blasen entfernt werden, backen das Gerät bei 80 ° C für 80 min. </li><li> Schneiden Sie das Gerät aus der Form mit einem Skalpell und auf eine saubere Oberfläche mit der strukturierten Seite nach oben und Punsch die fluidische und -auslässe mit einer 0,75 mm Biopsie Stempel verwenden. Das Gerät ist so geschnitten werden, dass die 120 &amp; mgr; m und 220 &amp; mgr; m groß Geometrien von der Seite der Vorrichtung zugänglich sind. </li><li> Plasma behandeln Sie das Gerät, mit Feature - Seite nach oben, zusammen mit einer vorgereinigte 2 Zoll von 3 Zoll Glasträger bei 1 mbar O 2 Plasma für 20 Sekunden in einem 300 W Plasma - Reiniger. Bond, die PDMS-Gerät von der strukturierten Seite der PDMS Vorrichtung auf die plasmabehandelte Seite der Glasobjektträger platziert. Stellen Sie das Gerät in einem 80 ° C Ofen und backen Sie die zusammengebauten Vorrichtung für 40 min. </li><li> Machen Sie die Kanälehydrophob durch eine Spritze unter Verwendung der Vorrichtung mit einer fluorierten Oberflächenbehandlungsfluid zu spülen. Unmittelbar backen das Gerät bei 80 ° C für 10 min, das Lösungsmittel zu verdampfen. </li></ol> 3. Herstellung von optischen Komponenten <ol><li> Bereiten Sie die Laseranregung Faser, die durch die Isolierung von der letzten 5 mm von einer 105 &amp; mgr; m-Kern, 125 um Mantel zu entfernen, NA = 0,22 optischen Faser. </li><li> Bereiten Sie die 2. Farbe Laseranregung Faser um 3,1 für eine 2. identische Faser zu wiederholen. </li><li> Bereiten Sie die Faser zum Sammeln des Fluoreszenzsignals von 3,1 für einen 200 &amp; mgr; m-Kern, 225 &amp; mgr; m Mantel wiederholen, NA = 0,39 optische Faser. </li><li> Überprüfen Sie die Spitzen aller Fasern - wenn die Spitzen in einer flachen Oberfläche nicht zu Ende, wieder spalten die Enden mit einem Faserschreiber. </li><li> Bringen Sie einen Laser-Faserkoppler mit einem 50 mW, 405 nm Laser und befestigen Sie eine der 105 &amp; mgr; m Kernfasern an den Laser. Richten Sie das abisolierte Ende am Sensor der LaserleistungMeter, und die Feinjustierung des Lasers Koppler verwenden, um die Laserleistung zu maximieren. </li><li> Wiederholen 3.5 für eine 50 mW, 473 nm-Laser. </li><li> Montieren Sie einen 446/510/581/703 nm Quad-Bandpassfilter auf der PMT Linse Röhren mit Laserlicht zu blockieren und emittiert Fluoreszenz übertragen. Bringen Sie Faserkoppler, so dass Licht den Filter durchläuft, bevor die PMT zu schlagen. </li><li> Bringen Sie die Faser von 3,3 auf der montierten Einheit in 3.7. </li></ol> 4. Offline-Mischemulsion-Generation <ol><li> Besorgen Sie sich einen Strömungs Fokus Mikrofluidik dropmaker Gerät mit einem 60 &amp; mgr; m × 60 &amp; mgr; m Öffnung. </li><li> Füllen Sie eine 1 - ml - Spritze mit HFE 7500 Ölen mit 2% ionisches Fluortensid 9. </li><li> Füllen einer Reihe von 1 ml Spritzen mit den folgenden Kombinationen von Fluorescein (FITC) und Dextran-konjugiertes blaue Farbstoffe (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB und 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Montieren Sie die dropmaker Gerät auf der Bühne eines invertierten Microsbewältigen und die wässrigen und Öl Spritzen auf Spritzenpumpen. Paar die Spritzen an die Geräte PE-2 Schläuche verwenden. </li><li> Laufspritzenpumpen bei 500 &amp; mgr; l / h für die Öl- und 250 &amp; mgr; l / h für die wässrigen Lösungen, erstellen einer Mischung aus 80 &amp; mgr; m-Tröpfchen, die Lösungen von 4,3 enthält. Für jede Art von wässrigen Probe, mit einem frischen dropmaker Gerät eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Sammeln Sie ~ 200 &amp; mgr; l Emulsion aus jeder Farbstoffkombination in eine leere Spritze. </li><li> Nachdem die vier Tröpfchen Typen haben in einer einzigen Sammlung Spritze, mischen die Emulsion durch mehrmaliges Drehen der Spritze gesammelt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,6 mit wässrigen Lösungen, die 0,1, 1, 10 und 100 nM FITC in PBS. </li></ol> 5. Optical Fiber Insertion <ol><li> Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip hergestellt in Schritt 2 auf der Stufe eines inversen Mikroskops gekoppelt mit einer digitalen Kamera in der Lage von &lt;100 &amp; mgr; s Verschlusszeiten. </li><li> Arbeiten sorgfältig von der Seite, insert die Faser mit dem 473-nm-Laser in die am weitesten vorgelagerten 120 &amp; mgr; m Kanal gekoppelt, dabei nicht bis zur Hauptströmungskanal zu durchstechen. </li><li> Legen Sie die Faser mit dem 405-nm-Laser in die am weitesten stromabwärts 120 &amp; mgr; m hohen Seitenkanal und bietet Faserabstand von 300 &amp; mgr; m. </li><li> Legen Sie die PMT-gekoppelten Faser in den 220 &amp; mgr; m groß Kanal senkrecht zu den beiden Laseranregungsfasern. </li></ol> 6. Fluoreszenzdetektion von gemischten Emulsionen <ol><li> Halterung eine 5 ml Spritze mit HFE 7500 mit 2% ionisches Fluortensid mit dem Spacer Öleinlaß der Detektionseinrichtung mit PE-2 Schlauch gefüllt. </li><li> Montieren Sie die Spritze mit dem gemischten FITC / CB-Emulsion auf einem vertikal ausgerichteten Spritzenpumpe und koppeln an das Gerät des Tröpfchens reinjection Einlass mit PE-2 Schläuche enthalten. Schließen Sie eine Länge von PE-2 Schlauch aus dem Gerät Ausgang in einen Abfallbehälter. </li><li> Prime das Gerät von jeder der Pumpen bei 1000 &amp; mgr; l / h, bis beide LaufÖl und Tröpfchen werden zu sehen regelmäßig in dem Gerät und fließt stromabwärts kombiniert werden. </li><li> Stellen Sie die Durchflussraten, so dass das Abstands Öl läuft bei 6.000 &amp; mgr; l / h und die Tröpfchen bei 100 &amp; mgr; l / h und bietet erhebliche Abstand zwischen den Tröpfchen durch den Detektionsbereich reisen. </li><li> Schalten Sie den Laser, das Datenerfassungsprogramm zu starten, und stellen Sie die PMT-Verstärkung um Signale zu liefern, die mehr sind als das Grundrauschen Boden 100x. Stellen Sie die Laserleistung so, dass alle der Dublett Peaks auf einem einzelnen, linear skaliert Timetrace deutlich sichtbar sind. </li><li> Erwerben Sie 60 Sekunden der PMT-Spannung Timetrace bei mindestens 20 kHz. Importieren Sie die Daten in Rechenprogramm wie Matlab und messen die Höhen der Spitzen der aufgenommenen Dubletten das benutzerdefinierte Berechnungsprogramm Skript. Hinweis: Dies wird als zusätzliche Information zur Verfügung gestellt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,2-6,7 die FITC-nur gemischte Emulsion in 4.7 erstellt wurden, mit der 405-nm-Laser ausgeschaltet. </li></ol>

<ol>
	<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics.">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li><li>Hindson, B. J., Ness, K. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+droplet-based,+optofluidic+device+for+high-throughput,+quantitative+bioanalysis.">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li><li>. Lithography Available from: <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015)</li><li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis:+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants.">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li><li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution.">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops.">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li><li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer.">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li><li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis.">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li><li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides.">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li><li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching.">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

LWL-Erkennung erfordert die Ausrichtung der optischen Fasern in Bezug auf Fluidkanäle. Da unser Gerät Führungskanäle hergestellt mit mehrschichtigen Photolithographie verwendet, die Platzierung von Masken in Bezug zueinander ist von großer Bedeutung. Wenn die Faserleitkanäle zu nahe an der Fluidkanal sind, gibt es ein Potential für eine Fluidleckage; wenn die Führungskanäle zu weit entfernt oder falsch ausgerichtet angeordnet sind, kann das Fluoreszenzsignal von der Detektionsfaser gesammelt werden deutlich ver...

Tröpfchen Mikrofluidik eine Plattform für einen hohen Durchsatz biology von 1 in einem Trägeröl suspendiert Experimente in einer Vielzahl von wässrigen Tröpfchen Kompartimentierung. Droplets sind für Anwendungen als Einzelzellanalyse 2, digitale Polymerase - Kettenreaktion (PCR) 3, wie variiert verwendet worden und Enzym Evolution 4. Fluoreszierende Assays sind die Standard-Erfassungsmodus für Tröpfchen Mikrofluidik, als ihre helle Signale und schnelle Zeitverhalten kompatibel sind mit Sub-Nanoliter Tropfenvolumen bei Kilohertz Raten zu erfassen. Viele Anwendungen erfordern Fluoreszenzdetektion, um gleichzeitig mindestens zwei Farben. Zum Beispiel unserem Labor führt häufig Tröpfchensortierexperimente-PCR aktiviert , die ein Detektionskanal für das Ergebnis eines Assays zu verwenden, und verwendet eine Sekundärhintergrundfarbstoff Assay negative Tröpfchen zählbaren 5 zu machen. Typische Nachweisstationen für Tröpfchen Mikrofluidik sind based auf Epifluoreszenz- Mikroskope und erfordern Licht Manipulationen Systeme kompliziert Anregungslicht von freien Raum Laser in Mikroskop eingeführt werden, die Probe fokussiert werden. Nach Fluoreszenz von einem Tröpfchen abgegeben wird, wird das emittierte fluoreszierte Licht gefiltert, so daß jeder Detektionskanal eine Photovervielfacherröhre (PMT) auf einem Wellenlängenband zentriert verwendet. Epifluoreszenzmikroskop basierte optische Detektionssysteme bieten eine Zutrittsschranke aufgrund ihrer Kosten, die Komplexität und die erforderliche Wartung. Optische Fasern liefern die Mittel eine vereinfachte und robuste Detektionsschema zu konstruieren, da Fasern manuell in mikrofluidischen Vorrichtungen eingesetzt werden, wodurch die Notwendigkeit für spiegelbasierte Lichtführung zu entfernen und so dass Lichtwege unter Verwendung von Lichtwellenleiterverbindern angeschlossen zu werden. In diesem Dokument beschreiben wir die Montage und Validierung eines kompakten und modularen Schema Mehrfarbenfluoreszenzdetektion durchzuführen, indem eine Anordnung von optischen Fasern eine Verwendungda einzelne Photodetektor 6. Lichtleitfasern sind mit individuellen Lasern und eingesetzt sind senkrecht zu einer L-förmigen Strömungskanal in regelmäßigen räumlichen Offsets. Ein Fluoreszenzsammelfaser wird an die Anregungsbereiche parallel orientiert und an einem einzigen PMT verbunden. Weil ein Tröpfchen zu unterschiedlichen Zeiten den Laserstrahlen durchläuft, durch den PMT aufgezeichneten Daten zeigt einen zeitlichen Versatz, dass der Benutzer zwischen der emittierten Fluoreszenz zu unterscheiden erlaubt, nachdem die Tröpfchen durch jede einzelne Laserstrahl angeregt wird. Diese zeitliche Verschiebung eliminiert die Notwendigkeit emittierte Licht zu trennen PMTs zu trennen, um eine Reihe von dichroitische Spiegel und Bandpassfilter verwendet wird. Um die Wirksamkeit des Detektors zu validieren, zu quantifizieren wir Fluoreszenz in Tröpfchenpopulationen Farbstoffe unterschiedlicher Farbe und Konzentration einkapselt. Die Empfindlichkeit des Systems wird für einfarbige Fluorescein Detektion untersucht und zeigt die Fähigkeit Tröpfchen mit Konzentrationen zu detektieren bis zu 0,1 nm, eine 200x Empfindlichkeit improvement im Vergleich zu bisherigen Vorgehensweisen auf Faserbasis 7 in der Literatur berichtet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photomasks</td>
			<td>CadArt Servcies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#34; silicon wafers, P type, virgin test grade</td>
			<td>University Wafers</td>
			<td>447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3035</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y311074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y111072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Krayden</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 gaugue needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE 2 polyethylene tubing</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc.</td>
			<td>B31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>98-0212-2928-5</td>
			<td>Commonly knowns as HFE 7500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionic Krytox Surfactant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis instructions in ref #10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran- conjugated cascade blue dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-1976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-446/510/581/703-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PMM02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber port</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PAFA-X-4-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch cable with 200 um core / 225 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch cable with 105 um core / 125 um cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 um fiber stripping tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T08S13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>225 um fiber stripping tool</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>T10S13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser fiber adapter</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>FC/PC Adapter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm CW laser at 50 mW</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>MDL-III-405</td>
			<td>Distributor for CNI lasers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473 nm CW laser at 50 mW</td>
			<td>OptoEngine</td>
			<td>MLL-FN-473-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicolor fluorescence detection for droplet microfluidics using optical fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Herstellung eines PDMS - Gerät , das für das Einsetzen von optischen Fasern ermöglicht , erfordert ein mehrstufiges photolithographischen Verfahren zu schaffen Kanäle unterschiedlicher Höhe (Abbildung 1). Zuerst wird eine 80 um hohe Schicht aus SU-8 wird auf einen Siliziumwafer versponnen und strukturiert, um eine Maske mit dem Fluidhandhabungs Geometrie zu schaffen. Als nächstes wird eine weitere 40 &amp; mgr; m Schicht aus SU-8 auf den Wafer gesponnen und struktu...

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Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Aufrufe.  University of California, San Francisco. Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Serie: Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Forschung

Biotechnik

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...