This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).

1. Extraktion von Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) von L. clavatum Spores Hinweis: Der Extraktionsprozess SEC beinhaltet ein entflammbares Pulver (L. clavatum), heiße ätzende Säuren und brennbare Lösungsmittel, also richtige persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Gesichtsmaske, Handschuhe, Kittel) genehmigte Risikobewertung auf Nutzung und Entsorgung Chemikalien von autorisiertem Laborpersonal ist von wesentlicher Bedeutung. <ol><li> Spore Entfettung <ol><li> Bereiten Sie eine Reflux - Set-up in einem Abzug durch einen Glaskühler, Wasserzirkulationssystem, und Wasserbad (Abbildung 1). </li><li> Man wiegt 100 g L. clavatum Sporen ohne Staubbildung und weg von jeder Zündquelle. Hinweis: Die hier verwendeten Sporen im Handel erhalten wurden (siehe Materialliste). </li><li> Transfer Sporen langsam zu einer 1 L Polytetrafluorethylen (PTFE) Rundkolben mit einem magnetischen Rührstab. </li><li> In 500 ml Aceton zu den Sporen in derPTFE-Kolben und schüttelt den Kolben sanft um eine homogene Suspension zu bilden. </li><li> Setzen Sie den PTFE-Kolben im Wasserbad Satz bei 50 ° C und eine Verbindung zum Rückflußkühler. </li><li> Führen Sie unter Rückfluß in Aceton für 6 Stunden mit 200 Umdrehungen pro Minute gerührt und dann lassen bei RT abkühlen. </li><li> Filtern Sie die Suspension mit Filterpapier unter Vakuum und sammeln die entfettet Sporen in großen (15 cm Durchmesser) Petrischalen aus Glas. </li><li> Trocknen der Sporen bei Raumtemperatur (fume hood) durch Abdecken mit Aluminiumfolie mit Löchern für die Lösungsmittelverdampfung. </li></ol></li><li> Acidolyse <ol><li> Bereiten Sie 85% (v / v) Phosphorsäure mit entsalztem Wasser (DI) und übertragen entfettet trockenen Sporen in einen 1 l PTFE-Kolben. </li><li> Hinzufügen 500 ml Phosphorsäure (85% v / v) zu den entfetteten Sporen. </li><li> Setzen Sie den PTFE-Kolben in einem Wasserbad Satz bei 70 ° C und eine Verbindung zum Rückflußkühler. </li><li> Führen leichtem Rückfluß (70 ° C) in Phosphorsäure für 30 h und dann lassenbei Raumtemperatur kühlen. </li><li> Verdünnen Sie die Suspension von 500 ml warmem DI Wasser und die SECs durch Vakuumfiltration mit Filterpapier sammeln. </li><li> Übertragen Sie die SECs in einen 3 L Becherglas eine Reihe von Waschungen durchzuführen. </li></ol></li><li> SEC Waschen <ol><li> Legen Sie die 3 L Becherglas enthält SECs in einem Abzug. </li><li> Hinzufügen 800 ml heißem (50 ° C) DI Wasser zu den SECs unter leichtem Rühren für 10 min. </li><li> Filtern Sie die Suspension durch mit Filterpapier und eine Vakuumfiltration Set-up. </li><li> Sammeln Sie die SECs in einem sauberen 3 L Becherglas. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1. bis 1.3.4. fünf Mal. </li><li> Hinzufügen 600 ml heißem (45 ° C) Aceton zu dem SECs unter leichtem Rühren für 10 min. </li><li> Sammeln Sie die SECs durch Filtration unter Vakuum und übertragen Sie die SECs auf eine saubere 3 L Becherglas. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. unter Verwendung von 600 ml heißem (50 ° C) 2 M Chlorwasserstoffsäure. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 600 ml hot (50 ° C) 2 M Natriumhydroxid. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1 und 1.3.4 achtmal. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. unter Verwendung von 600 ml heißem (45 ° C) Aceton. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 600 ml heißem (45 ° C) Ethanol. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.6. und 1.3.7. mit 800 ml heißem (50 ° C) DI-Wasser. </li><li> Übertragen Sie die sauber SECs bis sechs große Petrischalen aus Glas und trocken in einem Abzug bei RT für 24 Stunden alle Wassergehalt zu entfernen. </li><li> Trocknen Sie die SECs in einem Vakuumofen bei 60 ° C und 1 mbar Vakuum 10 h oder bis zur Gewichtskonstanz. </li><li> Sammeln Sie die getrockneten SECs und Transfer in eine Polypropylenflasche. </li><li> Bewahren Sie die SECs in einem trockenen Schrank. </li></ol></li></ol> 2. Charakterisierung von SECs <ol><li> Führen Sie rasterelektronenmikroskopische Analyse 41 in verschiedenen Stadien Sporen und SECs verwenden. </li><li> Führen Elementaranalyse 41 in verschiedenen Stadien Sporen und SECs verwenden. Dry alle Proben bei 60 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Elementaranalyse und Berechnung des Proteingehalts unter Verwendung Prozent Stickstoff mit einem Multiplikationsfaktor von 6,25. 11 Ergebnisse erhalten für jede Probe drei Messungen verwendet wird . </li><li> Führen Sie Micromeritic Eigenschaften Analyse ein dynamisches Bild Particle Analyzer verwendet wird . 41 </li><li> Scannen nicht verarbeiteten, verarbeitet und FITC-BSA-loaded SECs konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie. 41 </li></ol> 3. Biomakromoleküls Encapsulation von Vakuum-Loading-Technik <ol><li> Bereiten 1,2 ml 125 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung unter Verwendung von DI-Wasser und in ein 50 ml Polypropylenröhrchen. </li><li> Man wiegt 150 mg SECs und Transfer zum BSA-Lösung. </li><li> Vortexen das Röhrchen für 10 min eine homogene Lösung zu bilden. </li><li> Decken Sie die Röhrchen mit Filterpapier. </li><li> Übertragen Sie das Rohr zu einem Gefriertrockner Kolben und trocken für 4 Stunden mit Vakuum bei 1 mbar. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.1bis 3,5. für drei unabhängige Chargen. </li><li> Sammeln Sie die BSA-beladenen SECs und entfernen Sie die Agglomerate mit einem Mörser und Stößel. </li><li> Übertragen Sie die BSA-loaded SECs auf eine 50-ml-Röhrchen und 2 ml DI-Wasser, um den Rest BSA zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie die SECs durch Zentrifugation bei 4704 × g für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche mit VE-Wasser einmal. </li><li> Decken Sie die Röhrchen mit BSA-beladenen SECs mit Filterpapier. </li><li> Übertragen Sie die SECs zu einem Gefrierschrank (-20 ° C) und einfrieren für 1 Stunde. </li><li> Frieren Sie trocknen die SECs für 24 Stunden und Speicher in einem Gefrierschrank bis zur weiteren Charakterisierung. </li><li> Bereiten Sie die Placebo SECs ohne BSA dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 3.1 verwenden. bis 3.13. </li><li> Bereiten Sie die FITC-BSA loaded SECs 3.1 das gleiche Verfahren wie in Schritten. bis 3.13. </li></ol> 4. Bestimmung der Umhüllungs-Effektivität <ol><li> Wiegen 5 mg BSA-loaded SECs in 2 ml Polypropylenröhrchen. </li><li> In 1,4 ml Phosphate gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) und Vortex für 5 min. </li><li> Sonde beschallen die Suspension bei 40% Amplitude für 3 Zyklen von 10 sec. </li><li> Filtern Sie die Lösung mit einem 0,45 um-Polyethersulfon (PES) Filter. </li><li> Führen die gleiche Prozedur wie in den Schritten 4.1. bis 4.4. mit Placebo SECs. </li><li> Messen Sie die Absorption bei 280 nm mit Placebo als Rohling. </li><li> Quantifizierung der Menge an BSA verkapselt eine BSA - Standardkurve unter Verwendung von (200 bis 1.000 &amp; mgr; g / ml) in PBS. 42 </li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , 182 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Arbeit wird eine systematische Analyse der SEC - Extraktion aus L. clavatum Sporen präsentiert und dieser Bericht zeigt , dass es möglich ist , eine höhere Qualität Kapseln zu produzieren , während auch eine deutliche Straffung der vorbestehenden häufigsten verwendete Protokoll zu erreichen. 11 Im Gegensatz zu dem bestehenden Protokoll eine hohe Prozesstemperatur erforderlich ist (180 ° C) und eine lange Prozessdauer (7 Tage), 11 die aktuelle Optimierungs wurde SEC - Extraktionsverarbeitung in erster Linie auf die Verringerung der Temperatur und die Dauer der Acidolyse Schritt konzentriert. Die Entfettung und Alkalibehandlungen bieten minimale Entfernung von sporoplasmic Material von Sporen. Allerdings Acidolyse von 5 h bis 120 h die maximale Menge des sporoplasmic Material entfernt. Die Ergebnisse zeigten , dass die Gesamtbearbeitungsdauer und Temperaturen könnten drastisch von herkömmlichen Techniken reduziert werden, 11 und , dass nur 30 Stunden in mäßiger Temperatur (70° C) zur Verfügung gestellt Phosphorsäure die optimale Qualität Kapseln. Auch über 30 h Acidolyse, wurde gefunden, daß die SECs begann zu brechen und eine signifikante Erhöhung der Partikelfragmente beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die gesamte Charge von SECs kann eine Verringerung der gesamten strukturellen Integrität ausstellen. Außerdem sollte beachtet werden , daß L. clavatum wird als vergleichsweise robust Sporopollenin umfassen, 2 und daß die spezifischen Verfahrensbedingungen in diesem Protokoll beteiligt sind , wie Säurekonzentration, der Temperatur und / oder Hydrolyse Dauer benötigen kann für andere Arten Pollen angepasst werden. Es wurde , dass die Produktion von SECs gezeigt durch Acidolyse-nur unter Verwendung von Phosphorsäure (85% v / v) für 30 h Ausbeuten sauber und intakt SECs. 41 Die Daten bestätigen , dass Acidolyse der entscheidende Schritt in SEC - Produktion ist. Schließlich wurden die säure nur SECs zur Verkapselung von BSA und ein hoher Beladungsgrad verwendet wurde beobachtet. Die Beladung wwie bei der Anwendung eines Vakuums erreicht, wobei der Innendruck SEC Hohlraums verändert wird, um zwangsweise die BSA-Lösung in die leeren Kapseln zeichnen. Nanokanäle (dia . 15 - 20 nm), die in den Wänden der exine L. zuvor identifiziert wurden , clavatum, 7 lassen Sie die Lösung in den großen inneren Hohlraum zu gelangen. Nach dem Beladen wurden die Kapseln gewaschen und in einem Gefriertrockner getrocknet, um ein freifließendes Pulver zu ergeben. Größeneinheitlichkeit und morphologischen Eigenschaften sind wichtige Faktoren für die Beurteilung der Qualität eines erfolgreichen Verkapselungsmaterial. Die beobachtete einheitliche Größe und intakte Morphologie von BSA belasteten SECs bestätigt das Potenzial Nutzung von Acidolyse-only verarbeitet SECs für Mikroverkapselung Anwendungen. Diese Ergebnisse sind wichtig für die großtechnische Produktion von SECs und zum Stimulieren größeres Interesse an der möglichen Anwendungen der SECs in die Mikroverkapselung von Arzneistoffen,Proteine, Peptide, Nahrungsergänzungsmittel, Nutraceuticals und Kosmetik.

Es gibt großes Interesse an natürlichen Pflanzenbasis Kapseln aus Pflanzensporen und Pollen für die Verwendung in der Mikroverkapselung Anwendungen erhalten. 1-15 In der Natur, Sporen und Pollen Schutz für empfindliche genetische Materialien gegen raue Umgebungsbedingungen. Die Grundstruktur der Pflanzensporen und Pollen umfasst typischerweise eine äußere Hüllschicht (exine), eine innere Mantelschicht (intine) und die interne zytoplasmatische Material. Die exine besteht aus einem chemisch robust Biopolymer 1,9,10,13,16 bezeichnet als Sporopollenin und die intine besteht hauptsächlich aus cellulosischen Materialien besteht. 16-18 leeren Kapseln kann nach verschiedenen Verfahren zur Entfernung von 7,9 cytoplasmatische Material isoliert werden , Proteine und die intine Schicht. 2,12,16 Diese Sporopollenin exine Kapseln (SECs) eine überzeugende Alternative zu synthetischen Vergussmassen bieten aufgrund ihrer engen Größenverteilung und eine einheitliche Morphologie. 7,9,13,19,20 dieEntwicklung von standardisierten Prozessen SECs aus verschiedenen Pflanzenarten, wie Lycopodium clavatum zu erhalten, öffnet sich das Potential für eine breite Palette von Mikroverkapselung Anwendungen auf den Gebieten der Arzneimittelabgabe, Nahrungsmittel und Kosmetika. 6,10-13,21 Um SECs zu erhalten, zytoplasmatische Inhalte zu entfernen , Sporen und Pollen mit organischen Lösungsmitteln und unter Rückfluß erhitzt in alkalischen Lösungen behandelt Forscher zuerst. 22-25 jedoch wurde die verbleibende Kapselstruktur des Cellulose intine Schicht enthalten noch bestimmt. Um diese zu entfernen, erkundeten die Forscher die Verwendung von längeren saure Hydrolyse Verarbeitung Salzsäure, heißer Schwefelsäure oder heiße Phosphorsäure über mehrere Tage mit, 22-25 mit Phosphorsäure die bevorzugte Methode der SEC intine Entfernung zu werden. 2 jedoch laufend Forschung in den letzten Jahren hat gezeigt, dass verschiedene Sporen und Pollen haben unterschiedliche Grade der Widerstandsfähigkeit gegenüber der harten Verarbeitung michthoden verwendet. 26,27 Einige Sporen und Pollen vollständig abgebaut sind und alle strukturelle Integrität in stark alkalischen Lösungen zu verlieren, oder stark in stark sauren Lösungen beschädigt werden. 16 Die Variabilität in SEC als Reaktion auf die Behandlungsbedingungen ist aufgrund subtile Variationen in der chemischen Struktur und Morphologie des exine Sporopollenin exine Material zwischen den Arten. 28 Aufgrund der Variabilität in der Robustheit Sporopollenin exine Kapseln (Sekunden), ist es notwendig , die Verarbeitungsbedingungen für die einzelnen Arten von sporen und Pollen zu optimieren. Pflanzensporen aus der Spezies L. clavatum haben die am häufigsten untersuchten einzelne Quelle von SECs werden. Es wird vorgeschlagen , dass dies in erster Linie wegen seiner breiten Verfügbarkeit ist, niedrige Kosten, Monodispersität und chemische Robustheit 9,29 Die Sporen leicht geerntet werden können und enthalten sporoplasmic Inhalte in Form von Gruppen von 1 -. 2 um Zellorganellen und biomolecules. 11 L. clavatum Sporen wurden als natürliches Pulverschmiermittel, 30,31 Basis für Kosmetika, 30 und in der Kräutermedizin 32-36 für eine breite Palette von therapeutischen Anwendungen eingesetzt. Die SECs von L. erhalten clavatum wurden zur Verkapselung gezeigt werden , widerstandsfähiger Verarbeitung als SECs aus anderen Arten von Sporen und Pollen. 2 Nach der Bearbeitung wurden die resultierenden SECs worden ihre komplizierten microridge Strukturen und hohe morphologische Homogenität gezeigt zu halten , während eine große innere Hohlraum bereitstellt. 7 Studien zeigen , dass L. clavatum SECs kann zur Verkapselung von Arzneimitteln, Impfstoffen 10,13, 11 - Proteine, 7,14 Zellen, 8 Öle, 5-7,9 und Nahrungsergänzungsmittel. 5,15 Beobachteter SEC Ladewirkungsgrade sind relativ hoch im Vergleich zu herkömmlichen verwendet werden , Verkapselungsmaterialien. 7 Es gibt auch eine Reihe von Vorteilen berichtetDas am häufigsten verwendete SEC Extraktionsverfahren für L. SEC Einkapselung wie die Fähigkeit , Geschmack zu maskieren, 6,10 und einen gewissen Grad an natürlicher Schutz gegen Oxidation zu sorgen. 12 in den vorliegenden Studien, clavatum basiert auf vier Hauptschritte. Schritt eins ist Lösungsmittel Rückflußkochen in Aceton bis zu 12 Stunden bei 50 ° C , um die Sporen zu entfetten. 11 Schritt zwei alkalisch Rückfluß in 6% Kaliumhydroxid für bis zu 12 h bei 120 ° C zytoplasmatischen und proteinöse Materialien zu entfernen. 11 Stufe drei ist Säure Rückfluss in 85% iger Phosphorsäure für bis zu 7 Tage bei 180 ° C , um die Cellulose - intine Material zu entfernen. 11 Schritt vier ist ein umfassendes Waschvorgang Wasser, Lösungsmittel, Säuren und Basen alle verbleibenden nicht exine Material zu entfernen und chemische Rückstände. Die Hauptziele der SEC-Extraktion in Bezug auf Verkapselungsanwendungen sind Kapseln zu produzieren, die leeren zytoplasmatischer Material, frei from potenziell allergene Proteine und morphologisch intakt. 2,37 jedoch von einem industriellen Fertigungs Sicht ist es auch wichtig ist , weitere wirtschaftliche und ökologische Faktoren wie Energieeffizienz, Produktionsdauer, Sicherheit, und die daraus resultierenden Abfall zu betrachten. Im Hinblick auf die Energieeffizienz, sowohl bei hohen Temperaturen und lange Bearbeitungszeiten beeinflussen die Produktionskosten sowie Umweltbelastung. Produktionsdauer und Laufzeit sind wichtige Faktoren, die die Verarbeitung der Rentabilität. Besonders besorgniserregend ist , dass Hochtemperatur - Sicherheitsfragen Phosphorsäure Verarbeitung erhöht und wird in korrosiven Skalierung führen bekannt , die in die Instandhaltung der Infrastruktur und Verzögerungen bei der Batch - Laufzeiten zu einem signifikanten Anstieg führt. 38-40 Wo es möglich ist , die Minimierung der Anzahl der erforderlichen Schritte führen kann deutlich den produzierten Abfall zu reduzieren. Jedoch verwendet das allgemein vierstufigen Prozess von L. clavatum SEC Extraktion hat einfach evolved aus Jahrzehnten der Forschung und hat wenig tatsächlichen Prozessoptimierung hatte. Vor kurzem Mundargi et al., Machte 41 einen wesentlichen Beitrag zu den laufenden Arbeiten in diesem Bereich durch die systematische Auswertung und eines der am häufigsten berichteten SEC Extraktionstechniken zu optimieren. Im ersten Abschnitt dieser Studie: Sporen Entfettung wird 6 h bei 50 ° C unter Verwendung von Aceton-Verarbeitung gezeigt; sporoplasm und intine Abschiebungsverfahren demonstriert für 30 Stunden bei 70 ° C 85% ige Phosphorsäure Verarbeitung verwendet wird; ausgiebiges Waschen mit Wasser, Lösemittel, Säure und Base wird verwendet, um die Entfernung von restlichem sporoplasmic Inhalte zu zeigen; und SEC Trocknung wird gezeigt, unter Verwendung von Konvektion Trocknen und Vakuumofentrocknung. Im dritten Abschnitt wird SEC Vakuumlade Vakuum Laden eines Modellproteins demonstrierte Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA), gefolgt von BSA-geladen-SEC Waschen und Lyophilisieren. Im vierten Abschnitt wird die determination des Wirkungsgrades BSA Verkapselung Zentrifugation demonstrierte Verwendung Sondenbeschallung und UV / Vis-Spektrometrie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="894">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Lycopodium clavatum spores (s-type)</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">19108-500G-F</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">FITC-conjugated BSA</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">A9771-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phosphoric acid (85 % w/v)</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">438081-2.5L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">V800202&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">S5881-1KG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Acetone</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">V800022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ethanol</td>
			<td style="width:235px;">AcME&#160;</td>
			<td style="width:171px;">C000356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Deionized water</td>
			<td style="width:235px;">Millipore purified water&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)</td>
			<td style="width:235px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Polystyrene microspheres (50 &#177; 1 &#181;m)&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Thermoscientific (CA, USA)</td>
			<td style="width:171px;">4250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Vectashield&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Vector labs (CA, USA)</td>
			<td style="width:171px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:319px;">Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 &#956;m, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide</td>
			<td style="width:235px;">Ibidi GmbH (Munich, Germany)</td>
			<td style="width:171px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Commercial Lycopodium SECs (L-type)</td>
			<td style="width:235px;">Polysciences, Inc. (PA, USA)</td>
			<td style="width:171px;">16867-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Heating plates</td>
			<td style="width:235px;">IKA, Germany</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Scanning electron microscope</td>
			<td style="width:235px;">Jeol, Japan</td>
			<td style="width:171px;">&#160;JFC-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Elemental analyzer&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Elementar, Germany</td>
			<td style="width:171px;">VarioEL III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">FlowCam: The benchtop system</td>
			<td style="width:235px;">Fluid Imaging Technologies, USA</td>
			<td>FlowCamVS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:235px;">Carl Zeiss, Germany</td>
			<td style="width:171px;">LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Freeze dryer</td>
			<td>Labconco, USA&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">UV Spectrometer</td>
			<td>Boeco, Germany</td>
			<td style="width:171px;">S220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of plant-based capsules for microencapsulation applications

Mikrokapseln, die aus pflanzlicher Basis Sporen oder Pollen bieten eine robuste Plattform für ein breites Spektrum von Mikroverkapselung Anwendungen. Sporopollenin exine Kapseln (SECs) erhält, wenn Sporen und Pollen verarbeitet werden, um die interne sporoplasmic Inhalte zu entfernen. Die resultierenden hohlen Mikrokapseln mit einem hohen Grad an Micromeritic Einheitlichkeit aufweisen und komplizierte mikrostrukturellen Eigenschaften auf die besonderen Pflanzenarten im Zusammenhang behalten. Hier zeigen wir einen optimierten Prozess für die Herstellung von SECs von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs. Die aktuelle SEC Isolierungsverfahren wurde in SEC Isolations kürzlich optimiert, um signifikant die Verarbeitungsanforderungen zu reduzieren, die konventionell verwendet werden, und die Produktion von intakten Mikrokapseln zu gewährleisten. Natürliche L. clavatum Sporen werden mit Aceton entfettet, mit Phosphorsäure behandelt und extensiv sporoplasmi zu entfernen gewaschenc Inhalt. Nach Aceton Entfettung, alle sporoplasmic einen einzigen Schritt Verarbeitung 85% unter Verwendung von Phosphorsäure gezeigt Inhalte zu entfernen ist. Durch die Begrenzung der Säurebearbeitungszeit auf 30 Stunden, ist es möglich, saubere SECs zu isolieren und SEC Fracturing vermeiden, die gezeigt worden ist, mit einer verlängerten Verarbeitungszeit auftreten. Ausgiebiges Waschen mit Wasser, verdünnte Säuren, verdünnte Basen und Lösungsmittel sichergestellt, dass alle sporoplasmic Material und chemische Rückstände ausreichend entfernt werden. Die Vakuumbeladungstechnik wird verwendet, um ein Modellprotein (Rinderserumalbumin) als repräsentative hydrophile Verbindung zu laden. Vakuumbelastung stellt eine einfache Technik verschiedene Verbindungen ohne die Notwendigkeit einer scharfen Lösungsmittel oder unerwünschte Chemikalien zu laden, die oft in anderen Mikroverkapselung Protokolle erforderlich sind. Auf der Grundlage dieser Isolation und Belastungsprotokollen bieten SECs ein vielversprechendes Material für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Mikroverkapselung-Anwendungen, wie Therapeutika, Lebensmittel, Kosmetika und Körperpflege proddukten.

Schlanke Extraktionsverfahren für Sporopollenin Exine Kapseln Die L. clavatum SEC Extraktion wurde durch drei Hauptschritte erzielt: (1) Entfettung mit Aceton; (2) Acidolyse mit Phosphorsäure 85% (v / v); und (3) Umfangreiche SEC Waschen unter Verwendung von Lösungsmitteln. Die Strömung des rationalisierte SEC Extraktionsprozess in Abbildung 1 A dargestellt wird . - Ich Kurz gesagt beinhaltet das Verfahren einen Entfettungsschritt mit Aceton unter Rückfluß für 6 Stunden bei 50 ° C und die entfettet Sporen wurden dann über Nacht in einem Abzug getrocknet Rest zu entfernen Aceton. unter Verwendung von Phosphorsäure für 30 h Die entfettet Sporen wurden Acidolyse unterworfen. Während Acidolyse die Mehrzahl der sporoplasmic Materialien werden gelöst und dann während des Vakuumfiltrationsschritt entfernt. Um Rest sporoplasmic Materialien eine umfangreiche Reihe von Waschschritten unter Verwendung von Lösungsmitteln zu entfernen, Säure, Base und Wasser durchgeführt wird. Die SECs wurden zunächst für 24 h bei RT getrocknet und weiter bei 60 ° C getrocknet und 1 mbar Vakuum 10 h Restlösemittel und Feuchtigkeit zu entfernen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, alle Extraktion SEC Schritte wurden in einem Abzug mit einer Gefahr Ankündigung durchgeführt. Während SEC Extraktion wird ca. 70% Masseverlust beobachtet aufgrund der Entfernung von sporoplasmic Materialien und unsere Daten steht im Einklang mit bestehenden Berichten der Produktion von sauberen und intakten SECs. 7, 19,20,29 Die optimierten Prozess von der anfänglichen Entfettung Schritt bis zum Endprodukt wird in etwa 5 Tage und das Verfahren mit den entsprechenden Sicherheitskontrollen können einfach skaliert bis zu 1 kg Labormaßstab Charge abgeschlossen. Encapsulation Schritte SECs präsentiert in Abbildung 1 J Verwendung - M, das sind vorteilhaft , da auf einfachen Schritten ohne involving harte organische Lösungsmittel oder mechanische Scherkräfte erfordern. 7 Unsere Verkapselung Experimente beinhalten 150 mg SECs und eine Beladung ausreichend Lösungsvolumen durch die SECs für die Aufnahme. Die Beladung in diesen SECs wird durch Verbindung Löslichkeit in ausgewählten wässrigen oder organischen Lösungsmitteln beschränkt und Belastung kann durch eine der drei Lade Methoden erreicht werden: passive, Kompressions- und Vakuumbelastung. Jedoch stellt Vakuumbelastung relativ höhere Verkapselung von Verbindungen. 7, 19,20 Die physikalisch - chemischen Charakterisierungen von Sporopollenin Exine Kapseln Um die Sauberkeit der SECs erzeugt bestimmen , indem die optimierten Prozess in Abbildung 1 dargestellt verwendet, die Oberfläche und Querschnittsmorphologie, Micromeritic Eigenschaften und elementare Zusammensetzung wurden in den verschiedenen Phasen des SEC - Extraktionsverfahren untersucht. Wie gezeigt inFigur 2 zeigen die REM - Aufnahmen intakten Sporen mit einer einzigartigen Mikrostruktur, und vor der Verarbeitung im Mikrometermaßstab sporoplasmic Organellen wurden in dem Querschnittsbild beobachtet. Mit Spore Entfettung und Alkalibehandlung keine morphologischen und strukturellen Veränderungen wurden neben dem Aufreißen der sporoplasmic Organellen beobachtet. Figur 3 zeigt REM - Aufnahmen von SECs nach Acidolyse Phosphorsäure zu verschiedenen Zeitpunkten von 5 h bis 30 h unter Verwendung. Diese Ergebnisse unterstützen, die für bis zu 30 Stunden Acidolyse bietet intakt und sauber SECs ohne sporoplasmic Materialien. Um 29 Restproteinhaltiges Material, CHN - Elementaranalyse zur Bestätigung wurde durchgeführt , und die Daten werden in Abbildung 4 Diese Ergebnisse liefern einen Leitfaden für die Auswahl der besten Verarbeitungsbedingungen zu erreichen , sauber und intakt SECs präsentiert. Im Fall von entfetteten und Alkali behandelt SECs keine wesentliche proteinischenMaterialabtrag beobachtet. Jedoch mit Acidolyse unter Verwendung von Phosphorsäure, die Mehrzahl von proteinhaltigen Materialien wird in 30 Stunden entfernt, und keine weitere Reduktion wird mit zunehmender Prozesszeit bis zu 120 Stunden beobachtet. Die elementare Daten mit früheren Berichten über erweiterte Verarbeitung von SECs 7,11 und mit kommerziellen SECs konsistent. Micromeritic Eigenschaften wurden durch dynamische Bildpartikelanalyse (DIPA) analysiert und die Ergebnisse sind in Abbildung 5 Diese Ergebnisse unterstützen die einheitliche Größenverteilung von SECs nach Acidolyse präsentiert für bis zu 30 Stunden, mit einer Größe von 31,0 ± 2,2 &amp; mgr; m. Im Gegensatz dazu nimmt strukturelle Integrität SEC mit längerer Acidolyse und beginnt deutliche Fragmentierung der SECs über 30 Stunden Behandlungsdauer zu verursachen. Abbildung 6 zeigt die SEM und DIPA Daten für SECs hergestellt mit nur Acidolyse Proarbeitung für 30 Stunden unter Verwendung von Phosphorsäure. Diese Ergebnisse bestätigen, dass nach dem Entfettungsschritt, Acidolyse produziert saubere und intakte SECs mit einer einheitlichen Größenverteilung von 32,5 ± 2,7 &amp; mgr; m. Acidolyse-only SECs haben eine Restproteingehalt von nur 0,15 ± 0,0%, bestimmt in Bezug auf% Stickstoffgehalt, 11 , die mit SECs vergleichbar ist , hergestellt durch Alkali und Acidolyse Behandlung wie oben und mit früheren Berichten beschrieben hat . 7 Die Mikroverkapselung mit Sporopollenin Exine Kapseln Um die Verwendung von L. nachweisen clavatum SECs mit dem Acidolyse-only - Verfahren hergestellt, Mikroverkapselung Experimente wurden unter Verwendung von BSA als Modellprotein durchgeführt. Die Beladung in SECs wurde unter Verwendung einer Vakuumbeladungstechnik unter Verwendung von 150 mg SECs und 1,2 ml 125 mg / ml BSA erreicht. Figur 7 zeigt die CLSM imAlter SECs vor und nach der Acidolyse-only-Verarbeitung und mit FITC-BSA-Kapselung. Die Daten zeigen, dass unbehandelte SECs weisen Autofluoreszenz aufgrund des Vorhandenseins von sporoplasm Bestandteile innerhalb der Spore Höhle. Doch nach Acidolyse-only-Verarbeitung, alle sporoplasmic Inhalte ergeben sich in einem leeren inneren Hohlraum entfernt. Es fällt auf , nach der Einkapselung von FITC-BSA wird grüne Fluoreszenz im Inneren des SECs beobachtet, in SECs die Einkapselung des Modellproteins bestätigt. 19,20,41 Ferner wurden durchgeführt , um die morphologischen Veränderungen und Micromeritic Eigenschaften von BSA belasteten SECs, SEM und DIPA - Analyse untersucht , und die Daten in Abbildung 8 dargestellt. Die SEM - Bilder der Anwesenheit von intakten und sauber microridges nach BSA - Beladung zu bestätigen. Darüber hinaus wurden im Durchmesser, Kreisförmigkeit, und das Seitenverhältnis nach dem Laden in BSA SECs keine wesentlichen Veränderungen beobachtet. Diese Daten sind consistent mit früheren Berichten über die Verkapselung von Wirkstoffen mit SECs. 7.10 Zur Quantifizierung wurde die Menge an verkapseltem BSA, BSA 5 mg BSA-beladenen SECs extrahiert, und die Daten sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Daten zeigen , 0,170 ± 0,01 g BSA - Beladung pro Gramm SECs. Insgesamt bestätigen die REM - Aufnahme, DIPA, CLSM und Quantifizierung von BSA durch Spektralanalyse, die erfolgreiche Verkapselung von BSA in L. clavatum SECs und morphologische Stabilität SEC. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig1.jpg" /> Abbildung 1. Optimiertes Extraktionsverfahren für L. clavatum Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). (A) unbehandelte Sporen. (B) Spore Entfettung mit einem Rückfluss Set-up bei 50 ° C für 6 Stunden. (C) Lösemittelfiltration und sammeln<html> Ionen von entfetteten Sporen. (D) Trocknen des entfetteten Sporen bei Raumtemperatur. (E) Spore Acidolyse in Kolben PTFE 85% (v / v) Phosphorsäure bei 70 ° C für 30 Stunden verwendet wird . (F) Säure Filtration unter Verwendung von Vakuumfiltration set-up. (G) SEC Waschen eine Reihe von Wasser, Säure, Base und Lösungsmittel Waschschritte. (H) SEC Trocknung Vakuumofen bei 60 ° C und 1 mbar Vakuum für 10 h. (I) intakt, sauber und SECs als Endprodukt getrocknet. (J) Mischen von SECs und BSA - Lösung. (K) Homogenisieren von SECs und BSA - Lösung. (L) Vakuum - Laden von BSA in SECs. (M) BSA-loaded SECs. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 54768 / 54768fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopische Analyse von L. clavatum Spores während verschiedener Phasen der Pre-Säure - Behandlung. (A) Unbehandelte Sporen zeigt sporoplasmic Zellorganellen und Biomolekülen. (B) Aceton behandelt Sporen sporoplasmic Inhalt gestört zeigt. (C) &amp; (D) Alkali behandelt Sporen Entfernung von sporoplasmic Inhalte zeigt und faltig interne cellulosischen intine Schicht. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig3.jpg" /> Abbildung 3. Rasterelektronenmikroskopische Analyse von L. clavatum Spores während verschiedener Phasen der SäureBehandlung 5-30 hr (A - D). Beziehungsweise, 5, 10, 20 und 30 h Säure behandelt Sporen intakte externe Mikrostruktur und sauberen inneren Hohlraum zeigt. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig4.jpg" /> Abbildung 4. Proteingehalt von Sporen und Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). Der Proteingehalt nach verschiedenen Stadien der Behandlung. Daten repräsentiert ist ein Durchschnitt von Dreifachmessungen mit einer Standardabweichung (n = 3). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version o anzuzeigen</a>f dieser Figur. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig5.jpg" /> Abbildung 5. Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) von Sporen und Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) in verschiedenen Stadien der Behandlung Spalten (A - C). Sind jeweils vorgeSäureBehandlung, Säurebehandlung, und intakte SECs. Plots sind repräsentative graphische Darstellungen von SEC Durchmesser, Zirkularität, Seitenverhältnis und Kantengradient. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig6.jpg" /> Abbildung 6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) von 30 h Acidolysis-only Sporopollenin Exine Kapseln (Sekunden). (A) SECs intakte externe Mikrostruktur und sauberen inneren Hohlraum zeigt. (B) Repräsentative graphische Darstellungen von SEC Durchmesser, Kreisförmigkeit und Seitenverhältnis. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig7.jpg" /> Abbildung 7. konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) Analyse von Sporopollenin Exine Kapseln (SECs) vor und nach der Behandlung und BSA Encapsulation. Die erste Reihe zeigt unbehandelten Sporen sporoplasmic zelluläre Organell und Biomolekül Autofluoreszenz zeigt. Die zweite Reihe zeigt 30 Stunden Acidolyse-only SECs mit einem leeren inneren Hohlraum. Die dritte Reihe zeigt FITC-BSA geladenin 30 Stunden Acidolyse-only SECs. (Maßstabsbalken sind 10 &amp; mgr; m). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/54768/54768fig8.jpg" /> Abbildung 8. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Dynamic Imaging Partikelanalyse (DIPA) Charakterisierung von BSA-beladenen Sporopollenin Exine Kapseln (SECs). (A) REM - Aufnahmen von BSA-loaded SECs. (B) Repräsentative graphische Darstellungen von BSA-beladenen SEC Durchmesser, Zirkularität, Seitenverhältnis und Kantengradient. Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig8large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54768/54768fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <tablefo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Stoff </td><td> BSA - Beladung pro Charge (125 mg / ml) </td><td> BSA in 5 mg SECs (mg) </td><td> Anzahl der BSA beladen (g pro g SECs) </td></tr><tr><td> Unbehandelte Sporen </td><td> 0,6 ml </td><td> 0.654 ± 0.05 </td><td> 0.131 ± 0.01 </td></tr><tr><td> SECs </td><td> 1,2 ml </td><td> 0,831 ± 0,05 </td><td> 0.170 ± 0.01 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Verkapselung von Rinderserumalbumin (BSA) in unbehandeltem Spores und SECs. Volumen der BSA-Lösung für die Beladung pro 150 mg Charge von &quot;unbehandelte Sporen&quot; oder &quot;SECs &#39;verwendet. Daten repräsentiert ist ein Durchschnitt von dreifachen Chargen mit Standardabweichung (n = 3). Angepasst von 41 und mit freundlicher Genehmigung von wissenschaftlichen Berichten.

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Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Dieses Protokoll / Manuskript beschreibt einen optimierten Prozess für die Herstellung von Sporopollenin exine Kapseln (SECs) von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs.

Extraktion von Pflanzenbasis Kapseln für Mikroverkapselung Anwendungen

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K Aufrufe.  Nanyang Technological University.  Dieses Protokoll / Manuskript beschreibt einen optimierten Prozess für die Herstellung von Sporopollenin exine Kapseln (SECs) von Keulen-Bärlapp - Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs. 

Serie: Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Forschung

Biotechnik

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Optical Detector von Ultraschall für medizinische Imaging-Anwendungen

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Gestaltung Silk-Seidenprotein-Legierungen für biomedizinische Anwendungen

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

In situ TEM der biologischen Baugruppen in Flüssig

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunktionalisierten Prussian Blue Nanopartikel für Molekulare Bildgebung Multimodale Anwendungen

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest regarding the use of bioinspired nanoscale hydroxyapatite (nHA). However, biological apatite is known to be calcium-deficient and carbonate-substituted with a nanoscale platelet-like morphology. Bioinspired nHA has the potential to stimulate optimal bone tissue regeneration due to its similarity to bone and tooth enamel mineral. Many of the methods currently used to fabricate nHA both in the laboratory and commercially, involve lengthy processes and complex equipment. Therefore, the aim of this study was to develop a rapid and reliable method to prepare high quality bioinspired nHA. The rapid mixing method developed was based upon an acid-base reaction involving calcium hydroxide and phosphoric acid. Briefly, a phosphoric acid solution was poured into a calcium hydroxide solution followed by stirring, washing and drying stages. Part of the batch was sintered at 1,000 &#176;C for 2 h in order to investigate the products&#39; high temperature stability. X-ray diffraction analysis showed the successful formation of HA, which showed thermal decomposition to &#946;-tricalcium phosphate after high temperature processing, which is typical for calcium-deficient HA. Fourier transform infrared spectroscopy showed the presence of carbonate groups in the precipitated product. The nHA particles had a low aspect ratio with approximate dimensions of 50 x 30 nm, close to the dimensions of biological apatite. The material was also calcium deficient with a Ca:P molar ratio of 1.63, which like biological apatite is lower than the stoichiometric HA ratio of 1.67. This new method is therefore a reliable and far more convenient process for the manufacture of bioinspired nHA, overcoming the need for lengthy titrations and complex equipment. The resulting bioinspired HA product is suitable for use in a wide variety of medical and consumer health applications.

This paper describes a novel method for the rapid manufacture of high quality bioinspired nanoscale hydroxyapatite. This biomaterial is of great significance in the manufacture of a wide range of innovative medical devices for clinical applications in orthopedics, craniofacial surgery and dentistry.

Rapid-Mix Herstellung von Bioinspirierte Nanoskalige Hydroxyapatit für biomedizinische Anwendungen

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...