Najie Zhu und Liqun Bai trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch den Sonderfonds für Forstwirtschaft Wissenschaftliche Forschung in der öffentlichen Wohlfahrt (201204501) und der National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688 und 31570638) unterstützt. Wir danken Dr. Holighaus Gerrit und Dr. Danielle Hickford für ihre hilfreichen Anregungen auf Englisch schreiben.

1. Erwerb von Virgin Adult Nematoden <ol><li> Pinewood Nematoden - Isolat und Kulturbedingungen Hinweis: Um die B. xylophilus isolieren Nxy61 ursprünglich von einem erkrankten Pinus massoniana im Ningbo Gebiet der Provinz Zhejiang in China extrahiert wurde. <ol><li> Bereiten Sie Kartoffel - Dextrose - Agar (PDA, siehe Tabelle der Materialien) Platten für den Anbau von Botrytis cinerea. </li><li> Zur Inokulation ein Stück Pilz-Matte mit einem Durchmesser von 10 mm aus einem B. cinerea Matte Punsch und es in der Mitte eines neuen PDA - Platte setzen. Kultur der B. cinerea für 5 d bei 25 ° C im Dunkeln. </li><li> Kultur die pinewood Nematoden in die vorbereitete Petrischale mit B. cinerea bei 25 ° C im Dunkeln. </li></ol></li><li> Erwerb von B. xylophilus Eier <ol><li> Legen Sie eine geklemmt Gummischlauch unter einen Trichter und halten Sie die vorbereiteten Trichter in einem Rack die zusammenBaermann Trichtervorrichtung. Platzieren zwei Schichten von Filterpapier anstelle von Gaze in den Mund des Trichters. </li><li> Übertragen Sie die Pilzkulturen auf den Trichter Setup und Wasser hinzufügen, bis die Pilzmatte eingetaucht ist. Warten Sie 2 h, und Nematoden aus der Pilzkultur herauskommen wird, kreuzen Sie das Filterpapier, und sich in den untersten Teil des Baermann-Trichter nach unten. </li><li> Sammeln Sie die ersten paar Tropfen Wasser aus dem Boden des Röhrchens in ein 15 ml-Röhrchen und sammeln Nematoden langsam auf dem Rohr die Klemme freigegeben wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die oben Sammlungen bei 3000 × g für 2 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die obere Schicht aus Wasser mit einer Pipette und resuspendieren es mit 1 ml sterilem doppelt destilliertem (dd) H 2 O. </li><li> Mit einer Pipette die oben Aufwirbelung auf ein neues Glas-Petrischale (6 cm Durchmesser). 3 ml steriler dd H 2 O in die Petrischale , um sicherzustellen , dass die Nematoden frei schwimmen können. </li><li> Halten Sie die Nematoden im Glass Petri bei 25 ° C im Dunkeln für 10 min Schale. Eier werden von schwangeren Frauen gelegt werden. Aufgrund ihrer Glykoprotein Oberfläche, klebt die Eier an der Unterseite der Glaspetrischale. </li><li> Entfernen Sie das Wasser und Würmer vorsichtig, ohne die Eier zu stören. 3 ml steriler dd H 2 O auf die Glaspetrischale unmittelbar um die Eier zu verhindern , vor dem Austrocknen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2.8 3x zu entfernen Sie alle Larven und Erwachsene, und erhalten die reinen Eier. Fügen Sie eine zusätzliche 2 ml (5 ml insgesamt) steriler dd H 2 O zu der Petrischale. </li></ol></li><li> Der Erwerb der vierten Stufe Jugendlichen (J4 Larven) <ol><li> Hatch die gesammelten Eier für 24 h im Dunkeln bei 25 ° C J2 Larven zu erhalten. </li><li> Übertragen Sie die J2-Larven mit einer Pipette in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 3000 × g für 2 min, und entfernen Sie die obere Wasserschicht. </li><li> Resuspendieren J2 - Larven mit 200 ul steriler dd H 2 O, und dann übertragen zudie PDA - Platte B. cinerea enthält. </li><li> Kultur der J2-Larven für 52 h bei 25 ° C im Dunkeln. Zu diesem Zeitpunkt werden die meisten J2-Larven in der frühen Phase der J4 Larven entwickelt. </li></ol></li><li> Erwerb von nativem erwachsenen Nematoden <ol><li> Bereiten Sie eine Nadel für Nematoden Aufnehmen durch eine Glaskapillare zeichnen, nachdem sie über einen Spiritusbrenner erhitzt wird. HINWEIS: Die Spitze dieses Kapillarnadel benötigt normalerweise 50 &amp; mgr; m im Durchmesser sein, etwa der Körperbreite eines erwachsenen Nematoden, so daß sie als Werkzeug zum Aufnehmen eines einzelnen Nematoden verwendet werden kann. </li><li> Bauen Sie eine Baermann-Trichter und extrahieren Nematoden aus den Pilzkulturen für 2 h, wie 1.2.1 in den Schritten - 1.2.3. </li><li> Übertragen Sie die J4 mit Wasser in eine saubere Petrischale. </li><li> Beachten Sie die Nematoden unter einem Stereomikroskop und zu unterscheiden zwischen Männern und Frauen von Genitalmorphologie, wie von Mamiya und Kiyohara 8 (Abbildung 1 </strong&gt;). Pick-up eine Nematode des gewünschten Geschlechts mit der vorbereiteten Kapillarnadel und übertragen sie an den entsprechenden Pilz-Kulturplatte für Männer oder Frauen. HINWEIS: Es gibt mehr Frauen als Männer, wobei der Anteil der Frauen bei 60 bis 70%. Die weibliche Vulva ist offensichtlich von dem männlichen spicule. Im Vergleich zu den Erwachsenen ist die spicule oder Vulva in der Frühphase J4 kleiner, aber sie können immer noch leicht zu erkennen und zu unterscheiden. Die Nematoden bewegt sich immer im Wasser, die manchmal die Schwierigkeit erhöht sich bei Männern und Frauen unterscheiden. </li><li> Kultur der J4 Larven für weitere 24 h bei 25 ° C im Dunkeln. Hinweis: Alle Nematoden zu Erwachsenen entwickeln sollte, aber da sie nicht zusammengefügten sind, werden sie als Jungfrau Erwachsene angesehen. </li><li> Montieren Sie zwei Baermann-Trichter und extrahieren Sie die jungfräuliche Erwachsene aus den Pilzkulturen für 2 h, wie in den Schritten 1.2.1 - 1.2.3, und übertragen Sie die Jungfrau erwachsenen Männern und Frauen in zwei getrennte, saubere Petrischalen. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Beobachtung und Videoaufzeichnung von Paarungsverhalten <ol><li> Bereiten Sie mehrere konkave Dias und mit 200 &amp; mgr; l sterilem dd H 2 O zu jedem ihrer Brunnen. </li><li> Pick-up die vorbereitete Jungfrau erwachsenen männlichen oder weiblichen und mit einer Kapillare Nadel und stellen nur eine Nematode in das Wasser jedes konkaven Folie. </li><li> Halten Sie die Jungfrau Erwachsene im Inneren des gut 1 h, damit sie auf die neue wässrige Umgebung anzupassen. </li><li> Paar eine Jungfrau männlich und weiblich von einem von ihnen von einer Vertiefung zur anderen zu übertragen mit einer Pipette. </li><li> Beobachten Sie das Paarungsverhalten der 1♀ + 1♂ Kombination in der konkaven Objektträger unter einem Stereomikroskop. </li><li> Um die Paarungseffizienz von nativem Erwachsene analysieren, berechnen ihre Paarungserfolgsrate (R) und vergleichen Sie es mit dem von zufällig ausgewählten Erwachsenen-Paare. Berechnen R als der Prozentsatz von Replikaten in denen Kopulation beobachtet wurde, verglichen mit der Gesamtzahl der untersuchten Replikaten. </li><li1♀ + 3♂ und 3♀ + 1♂:&gt; Um Paarung Wahl und intra Wettbewerb, Gruppen- und beobachten virgin Nematoden von zwei verschiedenen Kombinationen untersuchen. </li><li> Um Daten für die qualitative und quantitative Analyse zu sammeln, zu filmen das Paarungsverhalten Videomikroskopie. Normalerweise, wenn die ganze Paarungsprozess, von der Zeit, die Nematoden in der Vertiefung des konkaven Schlitten auf den Moment gestellt werden, wenn sie weg nach der Kopulation bewegen, wird innerhalb von 2 h abgeschlossen. Daher nehmen Sie das passende Verfahren kontinuierlich für mindestens 2 h als eine Replikation. Komplette mindestens 30 Wiederholungen insgesamt für jede Kombination. HINWEIS: In steriler dd H 2 O ( in der Regel 50 &amp; mgr; l) alle 0,5 h auf die gut für die Verdampfung während des Aufzeichnungsprozesses zu kompensieren. </li></ol> 3. Datenerfassung <ol><li> Alle Videos sorgfältig auf einem Computer-Bildschirm und zeichnen die Unter Verhaltensweisen qualitativ. </li><li> Messen Sie die Dauer der Paarung mit the Frame-by-Frame-Funktion des Videorecorders. Manuell subtrahieren von dem Endpunkt der Startzeit. </li><li> Für die 1♀ + 1♂ Kombination, analysieren jede Videoaufzeichnung und messen die Dauer der folgenden Ereignisse: <ol><li> Messen Sie die Dauer der Suche (dh die Zeit aus , wenn die weiblichen und männlichen sind in den Brunnen des konkaven Schlitten eingeführt zu dem Moment , sie begegnen und einander berühren). </li><li> Messen der Dauer des In- Kontakt (dh die Zeit vom ersten Kontakt bis zu dem Moment , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist zum ersten Kopulation). </li><li> Messen der Dauer der Kopulation (dh die Zeit von , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist , bis er aus dem weiblichen Körper nach der Ejakulation gleitet nach unten). Hinweis: Einige Nematoden mehrmals in 2 h kopulieren können. In solchen Fällen messen die Dauer der Kopulation von der ersten Kopulation bis zum Ende des last ein, einschließlich der Zeit dazwischen. </li><li> Messen Sie die Dauer des Verweilens (dh die Zeit nach der Kopulation , bis die männlichen und weiblichen Bad voneinander entfernt und sind durch einen Abstand von mehr als der Nematoden Körperlänge ( in der Regel 1 mm) getrennt). </li></ol></li><li> Zählen Sie die Kopulation Häufigkeit und Dauer jeder Kopulation und die durchschnittliche Dauer aller Paarungen in 2 h für jede der verschiedenen Kombinationen (dh 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂). </li><li> Berechne den Paarungserfolgsrate für den ersten Kontakt (P) für die verschiedenen Kombinationen als die Erfolgsrate der Paarung nach dem ersten Kontakt, der unmittelbar und ohne Unterbrechung durchgeführt wird. In der Kontaktphase kann mehrere Kontakte vor der eigentlichen Kopulation beobachtet werden. <ol><li> Wenn der Abstand zwischen zwei Individuen mehr als die Körperlänge ist, sollten einen Kontakt über sein. Für ein Replikat, Rekord P als 100%, wenn der Kopulation is beobachtet unmittelbar nach dem ersten Kontakt, ohne Pause, oder 0,00%, wenn keine Kopulation beobachtet wurde oder wenn es Kopulation aber nach zwei oder mehrere Kontakte. HINWEIS: Es wurden 30 Wiederholungen für jede Kombination hier beschrieben. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Verhaltenstests sind ein grundlegender Aspekt der chemischen Ökologie, Neurobiologie, Molekularbiologie und Genetik. Nematoden und insbesondere C. elegans, sind für ein Studium in diesen Bereichen intensiv genutzt. Das Paarungsverhalten von C. elegans wurde zuvor 10-11 untersucht. Allerdings ist B. xylophilus gonochoristic und unterscheidet sich von den Zwitter C. elegans und seine Paarung hat verschiedene Verhaltensmerkmale 9. Vor kurzem wurde das Paarungsverh...

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity. 
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:233px;">B. xylophilus isolate Nxy61</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:463px;">Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Grey mold strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Forestry Academy of China</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Baermann funnels</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">falcon tubes</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipette</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sterile dd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilized by high pressure of steam at 121&#176;C for 30 min.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDA medium</td>
			<td>Huankai Bio.</td>
			<td>021050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">incubator</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminar flow</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass capillary</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED5000 RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">inverted stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">concave slides</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

Ein Verfahren zur Beobachtung und das Paarungsverhalten des Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus Quantifizierung wurde unter einem Stereomikroskop etabliert. Um die Paarungseffizienz von B. Xylophilus verbessern und die Chancen der Paarung Beobachtung zu erhöhen, waren virgin Erwachsene kultiviert und verwendet für die Untersuchung. Die Eier wurden, indem sie die Nematoden in Wasser erhalten und damit die Weibchen für 10 min Eier zu legen. Die zweite Stufe Jugendliche (J2) wurden im Dunkeln, und die frühe J4 erhalten wurden bei 25 ° C für 24 h durch Inkubation der Eier synchronisiert durch die J2 Kultivierung mit Grauschimmel Botrytis cinerea, für eine weitere 52 h. Zu diesem Zeitpunkt konnten die meisten J4 Nematoden klar unterschieden werden als männlich oder weiblich ist, ihre Genital Morphologie verwendet wird. Die männlichen und weiblichen J4 wurden gesammelt und kultiviert getrennt in zwei verschiedenen Petrischalen für 24 h virgin erwachsenen Nematoden zu bekommen. Eine Jungfrau männliche und eine jungfräuliche Weibchen wurden in einem Tropfen wat gepaarter in die Vertiefung einer konkaven Folie. Das Paarungsverhalten wurde mit einem Videorecorder unter einem Stereomikroskop gefilmt. Die ganze Periode des Paarungsprozesses war 82,8 ± 3,91 min (Mittelwert ± SE) und konnte in 4 verschiedene Phasen unterteilt werden: die Suche, Kontaktaufnahme, Kopulation und lang anhaltend. Die mittleren Minuten Dauer waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 und 7,2 ± 0,5. Elf Unter Verhaltensweisen wurden beschrieben: kreuzen, nähern, begegnen, berühren, hooping, Ortung, Befestigung, ejakulieren, trennen, quiescence und Roaming. Interessanterweise offensichtlich intra sexuellen Wettbewerb wurde beobachtet, wenn ein Weibchen mit 3 Männchen oder ein Männchen mit drei Frauen gruppiert wurde. Dieses Protokoll ist nützlich und wertvoll, nicht nur das Paarungsverhalten von B. xylophilus bei der Untersuchung, sondern auch als Referenz für ethologischer Studien anderer Nematoden in wirken.

Die Paarungserfolgsrate (R) von nativem Erwachsenen war 86,67% im Durchschnitt, was die deutlich höher war als der zufällig ausgewählten Erwachsenen: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Abbildung 2). Dieser Befund legt nahe , dass es einfacher ist , das Paarungsverhalten von B. xylophilus mit nativem Erwachsenen als bei zufällig ausgewählten Erwachsenen zu beobachten. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

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Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

9.3K Aufrufe.  Zhejiang Agricultural & Forestry University. A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Serie: Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Forschung

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With a growing global population and limited arable land, controlling PPN infestation is critical for food production. Compounding the challenge of maximizing crop yields are the mounting restrictions on effective pesticides because of a lack of nematode selectivity. Hence, developing new and safe chemical nematicides is vital to food security. In this protocol, the culture and collection of the PPN species Ditylenchus dipsaci are demonstrated. D. dipsaci is both economically damaging and relatively resistant to most modern nematicides. The current work also explains how to use these nematodes in screens for novel small molecule nematicides and reports on data collection and analysis methodologies. The demonstrated pipeline affords a throughput of thousands of compounds per week and can be easily adapted for use with other PPN species such as Pratylenchus penetrans. The techniques described herein can be used to discover new nematicides, which may, in turn, be further developed into highly selective commercial products that safely combat PPNs to help feed an increasingly hungry world.

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

The present protocol describes a reliable and straightforward method for culturing, collecting, and screening Ditylenchus dipsaci.

Kultivierung und Screening des pflanzenparasitären Nematoden Ditylenchus dipsaci

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

For the survival of the motile phototrophic microorganisms, being under proper light conditions is crucial. Consequently, they show photo-induced behaviors (or photobehavior) and alter their direction of movement in response to light. Typical photobehaviors include photoshock (or photophobic) response and phototaxis. Photoshock is a response to a sudden change in light intensity (e.g., flash illumination), wherein organisms transiently stop moving or move backward. During phototaxis, organisms move toward the light source or in the opposite direction (called positive or negative phototaxis, respectively). The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is an excellent organism to study photobehavior because it rapidly changes its swimming pattern by modulating the beating of cilia (a.k.a., flagella) after photoreception. Here, various simple methods are shown to observe photobehaviors in C. reinhardtii. Research on C. reinhardtii&#39;s photobehaviors has led to the discovery of common regulatory mechanisms between eukaryotic cilia and channelrhodopsins, which may contribute to a better understanding of ciliopathies and the development of new optogenetics methods.

Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

Most swimming photoautotrophic organisms show photo-induced behavioral changes (photobehavior). The present protocol observes the said photobehavior in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode,

Zusammenfassung

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Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte

Design und Analyse des Temperaturpräferenzverhaltens und seines circadianen Rhythmus in Drosophila

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz

Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

Kultivierung und Screening des pflanzenparasitären Nematoden Ditylenchus dipsaci

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

Beobachtung des Photoverhaltens bei Chlamydomonas reinhardtii