Name: immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers
Uploaded: 2016-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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1. Biocytin Füllung während Electrophysiology HINWEIS: Die Leser auf alternative Quellen für grundlegende Patch-Clamp - Aufnahme - Techniken und Instrumente 19-22 beziehen können, die auf hier nicht weiter ausgeführt. Die hier angegebenen Schritte gehen davon aus, dass die Ausrüstung und Verfahren für die Patch-Clamp-Aufnahmen sind bereits etabliert, und die Beschreibung wird auf Einzelheiten beschränkt werden, in Bezug auf biocytin füllend und Post-hoc-Immunfärbung. Alle Versuche in diesem Manuskript skizziert wurden an Ratten durchgeführt. <ol><li> Verwendung eines Vibratom bereiten Live Gehirnschnitte des gewünschten Bereichs in einer Dicke von 300-350 &amp; mgr; m 23. </li><li> Bereiten Sie eine interne Lösung , die 0,2% biocytin enthält , durch Zugabe von 2 mg biocytin zu 1 ml der internen Standardlösung 6. Für die besten Ergebnisse, beschallen die interne Lösung 10 - 15 min, bis die biocytin vollständig auflöst. Als nächstes laden Sie die interne Lösung in einer Spritze 1 ml mit einer 0,2 ausgestattet &amp;# 160; &amp; mgr; m Porengröße Polypropylen Filterspitze an einen Micro befestigt. Bewahren Sie diese ladende Spritze an einem kalten Packung die Stabilität des Mg-ATP und Na-GTP in der internen Lösung zu halten. HINWEIS: Eine interne Lösung, enthaltend Kaliumgluconat (126 mM K-Gluconat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP und 10 mM Phosphokreatin) optimal für die Rückgewinnung bestimmter neurochemischen Markern, einschließlich parvalbumin, während Immunmarkierung. Nach unserer Erfahrung mit Cäsium und Chloridbasis interne Lösungen reduziert die Fähigkeit eine Immunfärbung für bestimmte neurochemische Marker zu erholen. Neurobiotin oder ein Zell-impermeante, fixierbaren, polar Tracers ein Fluorophor Alexa mit Biocytin Kombination kann als Alternative verwendet werden, um Biocytin. </li><li> Unter Infrarot-Differentialinterferenzkontrast, die entsprechende Zelle für die Aufzeichnung zu visualisieren. Um eine Unterbrechung des Axons zu minimieren, nähern sich dem Zellkörper durch die Pipette entlang ihrer Achse eine Senkung der &quot;Ansatz&quot; f mitSalbung in den meisten Mikromanipulatoren. Stellen Ganzzellableitungen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast mit Patch-Clamp - Physiologie Protokolle 19-22. HINWEIS: Vermeiden Sie die Zelle aus der Richtung des vermeintlichen Axon nähern, da sie die Axon trennen wird, visualisiert als Bleb am Schnittende (grüner Pfeil in Abbildung 1). Vermeiden Sie auch hohe positive Druck auf die Aufzeichnungs Pipette anwenden, während die Zelle nähern uns dem Auslaufen von biocytin zu minimieren, was zu hohen Hintergrundfärbung führen. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vorgeschlagene Ebene für Zellen für Biocytin Fills Annäherung. Das Bild zeigt eine Körnerzellen (GC) füllen mit biocytin während der Aufnahme, die (in rot mit 594-konjugierten Streptavidin) offenbaren biocytin verarbeitet wurde. Die GC hat seine Dendriten in der XY-Ebene ausgerichtet. Beachten Sie die abgetrennten KörnerzellAxon (grüner Pfeil) aufgrund Pipette Bewegung entlang der XY-Ebene. Beachten Sie, dass es dieses Neuron zu nähern entlang der XZ-Ebene ideal ist. Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m. <ol start="4"><li> In voltage clamp Konfiguration, bestimmen die gesamte Zellenkapazität und Serienwiderstand in Reaktion auf kleine (5 mV), kurz (30 ms) Spannungsschritte unter Verwendung der die Membran Testfunktion in Badebetrieb in einem Elektrodatenerfassung und -analyse-Software. Dadurch wird die Einrichtung von Ganzzellaufnahmebedingungen sorgen für biocytin-Füllung zu ermöglichen. </li><li> Führen physiologische Aufnahmen in entweder Strom- oder Spannungs-Clamp-Modus nach Bedarf. Eine minimale Aufzeichnungszeit von&gt; 10 min bei 34 ° C ist ideal. HINWEIS: Längere Aufnahmezeiten können für Studien bei Raumtemperatur durchgeführt werden musste. </li><li> Nach Abschluss der physiologischen Aufnahmen Wiederherstellung der Patch-Clamp-Konfiguration, indem langsam die Aufzeichnungs Pipette in kleinen Schritten bewegt, nach oben alternierende (entlang der Z-Achse) undnach außen (entlang der X-Achse) in der Spannung-Clamp-Modus. </li><li> Gleichzeitig überwachen die Kapazität und den Eingangswiderstand &quot;membrane Test&quot; -Funktion mit dem Verlust von kapazitiven Transienten und den Zusammenbruch der Stromantworten auf eine gerade Linie sichtbar zu machen, was auf die Wieder Abdichtung der Zelle und die Einrichtung einer Außen außerhalb an der Pipettenspitze Patch. bei einer depolarisierten Potential der Zelle Holding (-40 mV) wird die Wiederversiegelungsverfahren erleichtern. Hinweis: Dieses Verfahren zur Entfernung einer Zelle gewährleistet üblicherweise die vollständige Wiederherstellung der Soma und Dendriten. Gelten nicht positiven Druck auf die Aufzeichnungspipette während dieses Vorgangs oder während die Zelle aus der Pipette löst. Visualisierung des Somas der aufgenommenen Zelle in der Scheibe zeigt die erfolgreiche Trennung. Das Vorhandensein von Zelltrümmern oder ein Membranfleck am Ende der abgelösten Spitze weist in der Regel eine Dislokation des soma und wird nicht vollständig Zellmorphologie ergeben. </li><li> Achterner die Pipette aus der Zelle Lösen 3 die Scheibe in der Aufnahmekammer behalten - 5 min den Transport des Farbstoffes zu dem distalen dendritischen und axonalen Prozesse zu gewährleisten. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf eine 24-Well-Platte mit 4% PFA für die Fixierung. ACHTUNG: PFA ist krebserregend, und geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich der Handschuhe und Gesichtsmaske, verwendet werden muss , Hautreizungen und Einatmen zu vermeiden. PFA ist brennbar und muss außerhalb der Reichweite von Feuer gehalten werden. PFA ist nie in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden. PFA Fixierung müssen von den Bereichen isoliert werden für die Live-Scheibe Zubereitung verwendet Kontamination der Physiologie-Setup zu vermeiden, einschließlich Transferpipetten. </li><li> 24 bis 48 h nach PFA Fixation, übertragen die Scheiben auf 0,1 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS) für die Lagerung vor der Immunfärbung. HINWEIS: Im Idealfall biocytin Erholung und Immunfärbung sind am besten, wenn durchgeführt, bald nach der Fixierung, obwohl Färbung pro<html> innerhalb von 7 d der Fixierung Ausbeuten gute Ergebnisse gebildet. für die Färbung durchgeführt bis zu und über 90 Tage nach der Fixierung 0,05% Natriumazid - Scheiben mit 0,02 in PBS gehalten werden. Obwohl über Nacht Fixierung in PFA gut für die meisten Antikörper arbeitet, ist es möglich, dass einige Antikörper am besten arbeiten, wenn die Dauer der Inkubation in Fixiermittel verringert wird. Die Fixierung in PFA für über 48 h reduziert die Verfügbarkeit von Antigenen und verringert die Chancen für eine erfolgreiche sekundäre Immunfärbung für neurochemische Marker. ACHTUNG: Natriumazid ist extrem gefährlich und kann reizend bei Kontakt mit der Haut oder den Augen oder bei der Einnahme oder Einatmen. Schwere Überbelichtung kann zum Tod führen. Die Kanzerogenität und Mutagenität der Verbindung sind nicht bekannt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Handschuhe, Schutzbrille, einen Laborkittel und eine Staubmaske. Natriumazid wird niemals in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. Die Färbung des ersten primären Antikörper und Biocytin (Tag 1) HINWEIS: Die nach dem Immunostaining Verfahren ist für frei schwebenden Abschnitte und kontinuierliche erfordert bei einer niedrigen Geschwindigkeit (2 Umdrehungen / min, rpm) auf einem Schüttler für alle Inkubationsschritte schütteln. <ol><li> Waschen Sie das Gewebe 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4). HINWEIS: 0,1 M PBS kann im Labor im Handel erworben oder hergestellt werden , wie folgt (macht 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 l dH 2 0. HINWEIS: Wenn die gewünschte neurochemische Marker bekannt ist, das für ein Protein / Peptid-Anfärbung kann gleichzeitig mit Biocytin Färbung durchgeführt werden (Schritte 2,2-2,4). Wenn Färbung nur für biocytin, gehen 2,5 Schritt. </li><li> OPTIONAL: Block mit 10% Blocking Serum (BS; normales Ziegenserum (NGS), verdünnt in 0,3% Triton X-100 in PBS für 1 h bei RT). HINWEIS: Jede Vertiefung solltedas gleiche Volumen der Lösung erhalten; das empfohlene Volumen zwischen 250 bis 500 &amp; mgr; l / Vertiefung. Die Auswahl des Blockierungsserum wird von der Spezies basieren , in der die Sekundärantikörper angehoben werden (beispielsweise wird NGS verwendet für Farbstoff-konjugiertem Ziege anti- (jeweiligen primären Antikörperspezies)). Wenn der Bedarf an verschiedenen Arten angehoben Sekundärantikörper zu verwenden, entsteht Abschnitte Immunfärbung, umfassen 10% jeder Normalserum in Blockierungsschritt (2) und 3% jeder Normalserum für die primären und sekundären Schritte Antikörper-Inkubation. </li><li> (OPTION) Inkubieren Sie die Abschnitte in primärer Antikörper, CB 1 R (polyklonalen, Meerschweinchen) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei RT O / N. CB 1 R wird verwendet , Cannabinoid - Rezeptor Typ 1 - Expression zu identifizieren. Hinweis: Dieser Schritt ist optional und nicht die biocytin Füllung zu offenbaren erforderlich. 2 veranschaulicht einen Abschnitt für Biocytin und CB 1 R während des ersten Färbeverfahren bezeichnet. O / N incuBation bei RT ist ausreichend für die meisten der primären Antikörper; jedoch bestimmte primäre Antikörper, einschließlich CB 1 R erfolgt , benötigen 3-5 d Inkubation. Wenn die Inkubation länger als 1 d werden muss, wird empfohlen, bei 4 ° C inkubieren, da Triton X-100 permeabilisiert Scheiben und zum Zerfall des Gewebes bei längerer Inkubation bei Raumtemperatur führen kann. Umfassen eine negative Kontrolle primärem Antikörper in mindestens einem Abschnitt für jede Serie von Experimenten als Kontrolle für die Spezifität des sekundären Antikörpers fehlt. Für Negativkontrollen wird der primäre Antikörper weggelassen, aber die 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS und BS zugegeben. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig2.jpg" /> Abbildung 2. Erfolgreiche CCK Anfärbung 1 Woche der Erholung von Biocytin Färbung und C Nach annabinoid Rezeptor Typ 1 (CB 1 R) - &lt;strong&gt; Kennzeichnung. (A - C) Konfokale Bilder bei 60X zeigt das Biocytin gefüllten Neuron (A) und CB 1 R Immunreaktivität (B), durch den Pfeil angedeutet ist . Der gleiche Abschnitt wurde nach 1 Woche (C) für die CCK - Immunfärbung verarbeitet. Die Überlagerung von Bildern wird in D gezeigt. CCK Immunreaktivität wurde mit weit rot zeigte, und wurde Pseudo-farbig in Cyan. (E) Morphologische Rekonstruktion der biocytin gefüllten Zelle in A. Beachten Sie, dass die biocytin und CB 1 R - Färbung zeigen sich auch nach dem zweiten CCK - Immunfärbung. Beachten Sie auch die erwartete Verteilung von CB 1 R und CCK - Immunfärbung Muster. (F - H) vergrößertes Bild der Axon aus der Zelle, wie in A, zeigen eine enge Zusammenarbeit Lokalisierung von biocytin und CB 1 R in Axonen (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m (A - D), 100 &amp; mgr; m (E) und 10 &amp; mgr; m ( <strong&gt; F - H). Die Bilder werden von Yu et al wiedergegeben. 2015 9. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> (Tag 2) <ol start="4"><li> Waschen Sie die Gehirnschnitte für 10 min 3 x jeweils in 0,1 M PBS (pH = 7,4). </li><li> Inkubieren der Abschnitte in Streptavidin roten Farbstoff-Konjugat (Konzentration: 1: 1,000; Anregung: 594 nm mit Emission im sichtbaren roten Spektrum) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei 4 ° CO / N in der dunkel (in Aluminiumfolie eingewickelt), um die biocytin zu offenbaren. Optional: Fügen Sie einen sekundären Antikörper, Ziege-Anti-Meerschweinchen (Konzentration: 1: 500; Anregung: 488 nm und Emission in grün), mit der obigen Inkubation, wenn die optionale primäre Inkubation folgende in Schritt 2.3. HINWEIS: Sekundäre Antikörper wird nur, wenn die optionale primäre Antikörper-Färbung (Schritt 2.3) durchgeführt wird, benötigt werden. Zur Visualisierung biocytin, eine streptavidin-Fluorophor - Konjugat mit einem Emissionsspektrum in rot wird empfohlen, da es eine feinere Axone im Detail zu visualisieren hilft und mit besseren Kontrast (Abbildungen 1 - 3). Während Doppel- oder Dreifachimmunfärbung, um miteinander Kreuzreaktivität von sekundären Antikörpern zu vermeiden, fügen sekundäre Antikörper nach dem anderen in einer seriellen Art und Weise (2 h Intervall zwischen seriellen Ergänzungen der Antikörper ist ausreichend). 3A stellt eine biocytin gefüllte Zelle ohne den optionalen primären Antikörperfärbung verarbeitet und vor der Resektion abgebildet. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig3.jpg" /> Abbildung 3. Erfolgreiche Zweite Immunostaining nach der Wiederherstellung von Biocytin Morphologie und Resektion. (A1) konfokale Bild eines 300 &amp; mgr; m in Scheiben schneiden die Erholung der dendritischen Morphologie eines biocytin gefüllten Zelle zeigt. (&lt;strong&gt; A2) Membranspannung Spuren des Neurons in Reaktion auf +500 und -100 pA Strominjektionen. (B) Die Gewinnung des biocytin gefüllten soma in einem 50 &amp; mgr; m Abschnitt erhalten , nachdem die 300 &amp; mgr; m Abschnitt Resektion (in A1) nach der Montage und Bildgebung. (B2) Nachfolgende Immunfärbung des dünnen Abschnitts ergab Kolokalisation des biocytin gefüllten soma (rechtes Bild) mit CCK (Mitte). Das fusionierte Bild wird auf der rechten Seite dargestellt. Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m. Panel - A2 wird mit Genehmigung von Yu et al wiedergegeben. In der Presse, 25. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> (Tag 3) <ol start="6"><li> Waschgehirnschnitte 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4). </li><li> Um die Fluoreszenz zu schützen und Wiederfärbung in der Zukunft zu erleichtern, montieren Sie die Sektionen in einer auf Wasser basierenden Montagemedium und die Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln. HINWEIS: Es ist am besten Abschnitte Restain so früh wie möglich Schwierigkeiten zu vermeiden, bei der Entfernung der Nagellack von der Rutsche, Schimmelpilzbefall und Austrocknung des Gewebes aufgrund einer Leckage des Befestigungsmediums aus dem Glasträger. Mikrobielle Kontamination kann durch Verwendung von 0,02% Natriumazid in PBS verhindert werden. ACHTUNG: Natriumazid ist sehr giftig und entzündlich , wenn es mit Wasser in Kontakt ist. Bitte beziehen Sie sich auf die Standardbetriebsverfahren für die Handhabung und Entsorgung von gefährlichen Chemikalien. (Tage 4 - 7) </li><li> Führen konfokale Bildgebung mit einer Anregung bei 594 und 488 nm und bei einer Vergrößerung von 20X oder 40X zu Biocytin gefüllten Neuronen in roten und neurochemischen Markern (CB 1 R) in grün offenbaren. Beurteilen colabeling (Abbildung 2). </li><li> Stellen Sie die Kamera Belichtung auf weniger als 100 ms Photobleaching und OBTA zu vermeidenin der konfokalen Bildstapeln der axonalen und dendritischen Dorne des gesamten Neurons. Verwenden konfokale Bildstapel und Neuron Tracing-Software-Pakete, die neuronale Morphologie zu rekonstruieren. </li></ol> 3. Die Färbung des zweiten primären Antikörpers: HINWEIS: Während der zweite kann Immunofärbung Schritt 90 d nach der ersten Färbung durchgeführt werden, eine optimale Färbung erreicht, wenn der zweite primäre Antikörper-Färbung innerhalb von 7 durchgeführt wird - d 10. (Nach 7-90 d) <ol><li> Tragen Sie Aceton auf einem Wattestäbchen und der Streifen den Nagellack aus der Glasträger. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas sorgfältig fein Spitze einer Pinzette und legte ein paar Tropfen von 0,1 M PBS auf den Abschnitten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Abschnitte von der Folie einen feinen Pinsel verwenden und waschen Sie sie in 0,1 M PBS für 24 bis 48 h auf einem Schüttler in Aluminiumfolie bei schwachem Licht bedeckt bei 4 o C HINWEIS: Es ist wichtig, mit einem zu decken Abschnitteluminum Folie gegen Ausbleichung vermeiden. </li><li> Um eine vollständige Entfernung des Eindeckmediums gewährleisten, waschen Sie die Abschnitte 1 - 2x am folgenden Tag in 0,1 M PBS für jeweils 10 min. </li><li> Weiter mit der Inkubation in der zweiten primären Antikörper ( zum Beispiel Cholecystokinin, ein Neuropeptid gefunden in bestimmten GABAergen Inter (CCK; Konzentration: 1: 1,000; monoklonaler Maus - Antikörper)) für 1 d (Figur 2). Hinweis: Dieses Verfahren ist ähnlich wie 2.3 zu Schritt aber verwendet einen anderen Antikörper. Zusätzlich wird der Blockierungsschritt während des Wiederfärbungs weggelassen. </li><li> Waschen Sie die Gehirnschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4). </li><li> Fleck mit dem Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers Ziege-Anti-Maus (Konzentration: 1: 500; Anregungswellenlänge: 647 nm), um sicherzustellen, dass die Anregungs-Emissionsspektren des sekundären Antikörpers nicht überlappen mit Streptavidin (Konzentration: 1: 1,000; Anregungswellenlänge: 594 nm) und vor ImmunofluoreszenzFlecken. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte in wässrigen Eindeckmittel und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. HINWEIS: Speichern der Abschnitte bei 4 ° C in einer lichtundurchlässigen Speicherfeld, um die Fluoreszenz zu schützen. </li></ol>

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A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons).">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons).</a> J Vis Exp. (91), e51706 (2014).</li><li>Jinno, S., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+characterization+of+hippocamposeptal+projecting+GABAergic+nonprincipal+neurons+in+the+mouse+brain:+a+retrograde+labeling+study.">Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study.</a> Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).</li><li>Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reduction+in+Cannabinoid-Sensitive+Heterotypic+Inhibition+of+Dentate+Basket+Cells+in+Epilepsy:+Impact+on+Network+Rhythms.">Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms.</a> Cereb Cortex. , (2015).</li><li>Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure-induced+alterations+in+fast-spiking+basket+cell+GABA+currents+modulate+frequency+and+coherence+of+gamma+oscillation+in+network+simulations.">Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations.</a> Chaos. 23 (4), 046109 (2013).</li><li>Scharfman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+dentate+neurons+by+morphology+and+electrophysiology+in+hippocampal+slices:+granule+cells,+spiny+hilar+cells+and+aspiny+'fast-spiking'+cells.">Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells.</a> Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).</li><li>Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+intracellular+markers+for+combined+electrophysiological,+morphological+and+immunohistochemical+analyses.">Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses.</a> J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls die gepatchte Zelle mit biocytin Füllung ist der wichtigste Schritt, um die vollständige Wiederherstellung der Morphologie zu gewährleisten. Für vollständige Erholung der Zelle, ist es wichtig, eine optimale Schichtorientierung zu wählen Sie das Durchtrennen von Prozessen während des Schneidens zu minimieren. Diese Orientierung kann auf der Schaltung und Zelltyp unter Prüfung auf Basis unterscheiden. Als nächstes ist es no...

Das Gehirn ist in den strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen neuronalen Elemente der Vielfalt bekannt. die Rollen von verschiedenen neuronalen Typen in der Gehirnfunktion und Pathologie zu verstehen, müssen die Charakterisierung und die eindeutige Identifizierung von Neuronen. Strukturell die morphologischen Merkmale von somatisch-dendritischen Standort definiert bestimmen die möglichen Eingaben, die ein bestimmtes Neuron erhält, während das Muster der axonalen arborization Potential postsynaptischen Ziele identifiziert. Die strukturelle Vielfalt von Neuronen hat seit den Tagen von Ramón y Cajal brech histologische Untersuchungen 1 geschätzt. Das Aufkommen von Einzelzellen-Aufnahmetechniken gezeigt, dass strukturell verschiedene Neuronen zeigen Unterschiede auch in Feuermuster und synaptische Eigenschaften. Die Vielfalt in der Struktur und Physiologie zeigt sich besonders deutlich in GABAergen inhibitorischen Neuronen 2,3. Darüber hinaus ist es zunehmend deutlich geworden, daß structurally ähnliche Neuronen können verschiedene neurochemische Marker und zeigen entsprechende funktionelle Unterschiede 4 auszudrücken. In ähnlicher Weise Neuronen mit den gleichen neurochemische Marker können 5-10 unterschiedliche Strukturen und Funktionen haben. So wird in der Praxis ergeben sich bei der Analyse der funktionellen Eigenschaften von Neuronen und ihre Rolle in dem Netzwerk definieren, sowohl die morphologischen und neurochemischen Identitäten. Sogar mit dem Aufkommen von Reportermauslinien spezifische neurochemische Marker Targeting, ist es oft notwendig , Morphologie und Subtyp Identität basierend auf Immunhistologie 11 zu bestimmen. Das Standardverfahren verwendet, um Zellen zu charakterisieren, in akuten Hirnschnitten aufgezeichnet ist, sie mit biocytin oder Neurobiotin während der Aufnahme zu füllen, fixieren Sie die Abschnitte in Paraformaldehyd (PFA) im Anschluss an den Aufnahmen und Immunhistochemie verwenden, um die Morphologie und Neurochemie zu offenbaren. Da die Dicke der Abschnitte für slice Physiologie sind typischerweise 300 umoder mehr, und weil die meisten Antikörper nicht den ganzen Weg durch diese Tiefe zu durchdringen, müssen die Scheiben 60 um oder weniger zu ermöglichen für die gleichzeitige Immunofärbung für Biocytin und neurochemischen Markern 12-14 erneut geschnitten werden. Leider Resektion ist mühsam; Risiken Verlust von Gewebe während des Schneidens; und kann dazu führen, Gewebe Schrumpfung auf Differential, morphologische Rekonstruktionen zu komplizieren. Darüber hinaus könnte vorherige Kenntnis der Morphologie helfen, die Kandidatenmarker verengen, die wahrscheinlich von den Zellen exprimiert werden. Wir haben den Standard biocytin Immunhistologie Protokolle modifizierte serielle Verarbeitung von Abschnitten für die Gewinnung von Morphologie zuerst zu ermöglichen, und dann zur Identifizierung potenzieller neurochemischen Marker. Immunhistochemie ist die Untersuchung der Antigenverteilung in Geweben oder Zellen , und kann mit einem Enzym, Fluoreszenzmarkierungen, radioaktive Elemente sichtbar gemacht werden, oder Goldkolloidpartikel 15. Das Verfahren involves primären Antikörper unter Verwendung eines oder mehrerer spezifischer Antigene durch die Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper gefolgt spezifisch markieren und zu verstärken, den primären Antikörper für die Visualisierung Targeting. Aufgrund der Notwendigkeit, die Fluoreszenzspektren von jeder sekundären Antikörpers ohne Überlappung zu unterscheiden, nur eine begrenzte Anzahl von Antigenen können gleichzeitig geprüft werden. So könnte vorherige Kenntnis der Morphologie bei der Auswahl der Kandidaten neurochemischen Marker für die Zellklassifizierung nützlich sein. Konzeptionell ist das Grundprinzip hinter serielle Verarbeitung von bereits gefärbten Schnitten basiert auf der Prämisse , die für ein Protein oder Peptid - Immunmarkierung nicht mit Antigenität und anschließender Immunmarkierung für einen strukturell unabhängig Peptid 16 stören sollte. Dieses Fehlen von Störungen ist aufgrund der Bindung der Antikörper an ein bestimmtes Protein Epitop auf einem Antigen und daher ermöglicht die gleichzeitige Färbung von mehreren Antigenen im gleichen Gewebe. Die Anzahl von Antigenen revealed durch Immunfärbung wird durch die Notwendigkeit für die nicht überlappenden Spektren der fluoreszierenden Sekundärantikörper und durch die Notwendigkeit , zu zielen einzelnen Antigene mit Antikörpern , die in verschiedenen Spezies begrenzt , um Kreuzreaktivität zu eliminieren , 17,18. Zwar ist dies die Argumentation hinter seriell anstatt gleichzeitige Markierung mit zwei verschiedenen Antikörpern, die unseres Wissens in Wechselwirkung treten kann, wurde eine Immunfärbung für ein zweites Antigen nicht nach der Beendigung der Immunmarkierung für ein oder mehrere Antigene auf montierten Abschnitten berichtet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur seriellen Immunfärbung von zuvor gefärbt und montiert Abschnitte. Während wir uns ausführlich diesen Prozess für eine serielle Immunmarkierung Verfahren zur Gewinnung von Morphologie gefolgt von Protein / Peptid-Markern in dicken Abschnitten Färbung können die gleichen Verfahren wie auch in Standard, dünne histologische Schnitte verwendet werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen praktischen Ansatz für aufgezeichnet Neuronen mit biocytin und den Prozess füllen das zu verdrängenElektrode aus der Zelle nach Abschluß der Aufnahmen die Füllung der axonalen und dendritischen Dorne von Neuronen zu optimieren, wie in unserem jüngsten Arbeiten 6,8 dargestellt. Der wichtigste Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweise besteht darin, daß die Morphologie der aufgezeichneten Zelle kann vollständig vor der Resektion oder immunostain den Scheiben Versuch gewonnen und abgebildet werden. Obwohl Probleme mit dem Eindringen bestimmter Antikörper machen kann es für die sekundäre Immunfärbung der Resektion Scheiben notwendig, die hier ausgeführten Verfahren würde die Notwendigkeit beseitigen, um komplexe Neuronen aus mehreren Abschnitten rekonstruieren und Probleme aufgrund von Gewebeverlust und unterschiedliche Schrumpfung vermeiden würde, die den Wiederaufbau gefährden können folgende Resektion. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die Verfahrenskosten zu reduzieren, Zeit, Mühe und teure Antikörper durch Immunfärbung begrenzen und Wieder sectioning zu Scheiben in denen Biocytin gefüllten Neuronen gewonnen werden. Die praktischste Aspekt ist die Anzeigesätzliche Immunfärbung, die die oben genannten Technik vor der Verwendung auf gefärbten Schnitten Monate durchgeführt werden kann. Insbesondere würde die Rückgewinnung von Morphologie erheblich reduzieren das Potential, daß die physiologischen Daten von den Zellen aufgrund einer Unfähigkeit verworfen ist eine grundlegende morphologische Charakterisierung des Zelltyps zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fluka</td><td>60129</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>229806</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Guinea pig anti CB1&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Af530-1</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Mouse anti CCK</td><td>CURE, UCLA</td><td>courtesy of G. Ohning</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Rabbit anti Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>PV27</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>S11227</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Vectashield&amp;nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td>Invitogen Molecular probes</td><td>Alexa Fluor conjugated dyes</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Labnet orbit low speed shaker</td><td>Bioexpress</td><td>S-2030-LS</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11231-30</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Slide folders</td><td>EMS</td><td>71520</td><td>Immunostaining</td></tr><tr><td>Vibratome VT 1200 S</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B amplifier</td><td>Molecular devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Software</td><td>Molecular devices</td><td>pCLAMP 10&amp;nbsp;</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440 digitizer</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Filter tips</td><td>Nalgene</td><td>171-0020</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-335-100</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Electrophysiology</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td>Electrophysiology</td></tr></tbody></table>

immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers

Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Zellen, die die Patch-Clamp-Technik haben zur Identifizierung von verschiedenen neuronalen Typen auf Basis von Brennmustern erlaubt. Die Einbeziehung von biocytin / Neurobiotin in der Aufzeichnungselektrode ermöglicht Post-hoc-Rückgewinnung von morphologischen Details, die notwendig sind, um die dendritischen Verzweigungen und die Regionen durch die Axone der aufgezeichneten Neuronen gezielt zu bestimmen. Jedoch angesichts der Anwesenheit von morphologisch ähnlichen Neuronen mit unterschiedlichen neurochemical Identitäten und Funktionen, immunhistochemische Färbung für die zelltypspezifische Proteine ​​ist wesentlich, um endgültig Neuronen zu identifizieren. Um Netzwerk-Konnektivität, Gehirnschnitte für physiologische Aufnahmen sind bei einer Dicke von 300 &amp; mgr; m oder mehr halten vorbereitet. Doch oft diese Dicke behindert immunhistologischer Nachbearbeitung aufgrund von Problemen mit dem Antikörper Penetration, erfordert die Resektion des Gewebes. Resektion von Scheiben ist eine anspruchsvolle Kunst, die oft Resulting in dem Verlust von Gewebe und die Morphologie der Zellen aus denen elektrophysiologische Daten erhalten, die Daten unbrauchbar macht. Seit Wiederherstellung der Morphologie würde Datenverlust und Führung bei der Auswahl der neuronalen Marker zu begrenzen, haben wir eine Strategie zur Gewinnung von Zellmorphologie angenommen zuerst durch sekundäre Immunfärbung gefolgt. Wir stellen einen praktischen Ansatz bei physiologischen Aufnahmen und anschließender Serienimmunfärbung für die Gewinnung von Morphologie biocytin Füllung, gefolgt von der restaining von Abschnitten der neurochemischen Identität zu bestimmen. Wir berichten, dass Abschnitte, die mit biocytin gefüllt waren, mit Paraformaldehyd fixiert (PFA), gebeizt und Eindecken kann später mit einem zweiten primären Antikörper Tage entfernt und erneut gefärbt. Diese restaining beinhaltet die Entfernung des Deckglases, das Waschen von Abschnitten in einer Pufferlösung und die Inkubation von primären und sekundären Antikörper der neurochemischen Identität zu offenbaren. Das Verfahren ist vorteilhaft zum Eliminieren datein Verlust aufgrund einer Unfähigkeit Morphologie und zur Eingrenzung der neurochemische Marker wiederherzustellen basierend auf Morphologie getestet werden.

Nach dem erfolgreichen Abschluss behalten die Abschnitte der biocytin Füllung und die Immunmarkierung in Schritt 2 durchgeführt und kann mit Hilfe einer konfokalen oder Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. Zusätzlich wurde die bearbeiteten Abschnitte auch Immunofärbung für das markierte Antigen während der nachfolgenden Verarbeitung in Schritt 3 in dem Abschnitt in 2 dargestellt, die Morphologie einer Biocytin gefüllten Neuron in einem dicken Abschnitt (30...

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Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

immunostaining-biocytin-filled-processed-sections-for-neurochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.9K Aufrufe.  Rutgers New Jersey Medical School.  Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden. 

Serie: Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Forschung

Neurowissenschaften

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Biologie

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described here identifies the basic building blocks of this circuitry. The in-depth studies of cortical regions will ultimately provide other scientists with the circuit components needed for an understanding of how the brain acquires, processes and stores information and what goes wrong in disease, while the electrophysiological and morphological data are widely used by computational neuroscientists in the construction of model networks that explore information processing. The protocol outlined here describes how biocytin-filled cells recorded in the CA2 region of the hippocampus are recovered and then reconstructed in&#160;3D. Additionally, the protocol describes the demonstration of calcium binding protein or peptide content in recorded interneurons.

The protocol outlined here describes the immunofluorescence analysis, biocytin recovery and high-quality reconstructions of hippocampal CA2 interneurons following the intracellular electrophysiological recordings in vitro, allowing neuronal characterization and ultimately fine neuronal anatomy to be studied.

Biocytin Erholung und 3D-Rekonstruktionen der gefüllten Hippocampal CA2 Interneuronen

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Immunologie und Infektion

Histological Staining of Neural Tissue

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this technique, a tissue of interest is preserved using chemical fixatives and sectioned, or cut into very thin slices. A variety of staining techniques are then applied to provide contrast to the visually uniform sections. In the study of neuroanatomy, histological techniques are frequently applied to visualize and study nervous system tissue. This video focuses on histological staining techniques for neural tissue. An overview of common brain stains is provided, including those that specifically mark neuronal cell bodies, like Nissl stains, and those that selectively highlight myelinated axons, like the Luxol Fast blue stain. Immunohistological techniques, which take advantage of the specific interaction between antibodies and unique cellular proteins, are also discussed. Next, the preparation of brain samples for staining is described, including the basic steps for fixation, embedding, sectioning, and rehydration of the tissue. The presentation also provides a step-by-step procedure for immunohistological staining followed by a Nissl stain, in addition to practical applications of these techniques.

Brain Stains: Histological Staining of Neural Tissue

Die histologische Färbung von Nervengewebe

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Neurowissenschaften

Immunohistochemical Staining of Biomarkers in Brain Tumor Neurosphere Sections

<a href='https://app.jove.com/v/58931/evaluation-biomarkers-glioma-immunohistochemistry-on-paraffin'>Source: N&#250;&#241;ez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures.&#160;J. Vis. Exp. (2019).</a>This video demonstrates an immunohistochemical technique for labeling tumor biomarkers in paraffin-embedded brain tumor neurospheres. The neurosphere sections undergo paraffin removal and rehydration, followed by treatment to expose biomarker sites. Primary and secondary antibodies are then applied to label these biomarkers. The secondary antibodies are bound by avidin-conjugated peroxidase enzymes, which oxidize chromogenic substrates to indicate biomarker locations. Finally, nuclear counterstaining and slide preparation are completed for microscopic analysis.

Source: N&#250;&#241;ez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Tumors

Immunostaining of Interneurons in a Rat Hippocampal Section

Swietek, B., et al., <a href="https://app.jove.com/v/54880">Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the process of visualizing a biocytin-filled interneuron in a rat hippocampal section, highlighting its neurochemical identity through the use of specific antibodies and fluorescence microscopy.

Swietek, B., et al., Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers. J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the ...

Neurodegenerative Diseases

Immunohistochemical Staining of Nerve Fibers in the Nucleus Basalis of Meyner of the Mouse Brain

Source: Singh, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60405">Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates the immunohistochemical staining of cholinergic fibers in the nucleus basalis of the Meynert region of mouse brain sections. Sections are blocked and treated with primary against choline acetyltransferase, followed by biotinylated secondary antibodies. Avidin-biotin-peroxidase complexes are added, which bind to secondary antibodies, followed by the chromogenic substrate. Sections are then dehydrated and mounted before visualizing under the microscope.

Source: Singh, P., et al. Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2020)
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