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1. Biocytin Füllung während Electrophysiology HINWEIS: Die Leser auf alternative Quellen für grundlegende Patch-Clamp - Aufnahme - Techniken und Instrumente 19-22 beziehen können, die auf hier nicht weiter ausgeführt. Die hier angegebenen Schritte gehen davon aus, dass die Ausrüstung und Verfahren für die Patch-Clamp-Aufnahmen sind bereits etabliert, und die Beschreibung wird auf Einzelheiten beschränkt werden, in Bezug auf biocytin füllend und Post-hoc-Immunfärbung. Alle Versuche in diesem Manuskript skizziert wurden an Ratten durchgeführt. <ol><li> Verwendung eines Vibratom bereiten Live Gehirnschnitte des gewünschten Bereichs in einer Dicke von 300-350 &amp; mgr; m 23. </li><li> Bereiten Sie eine interne Lösung , die 0,2% biocytin enthält , durch Zugabe von 2 mg biocytin zu 1 ml der internen Standardlösung 6. Für die besten Ergebnisse, beschallen die interne Lösung 10 - 15 min, bis die biocytin vollständig auflöst. Als nächstes laden Sie die interne Lösung in einer Spritze 1 ml mit einer 0,2 ausgestattet &amp;# 160; &amp; mgr; m Porengröße Polypropylen Filterspitze an einen Micro befestigt. Bewahren Sie diese ladende Spritze an einem kalten Packung die Stabilität des Mg-ATP und Na-GTP in der internen Lösung zu halten. HINWEIS: Eine interne Lösung, enthaltend Kaliumgluconat (126 mM K-Gluconat, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP und 10 mM Phosphokreatin) optimal für die Rückgewinnung bestimmter neurochemischen Markern, einschließlich parvalbumin, während Immunmarkierung. Nach unserer Erfahrung mit Cäsium und Chloridbasis interne Lösungen reduziert die Fähigkeit eine Immunfärbung für bestimmte neurochemische Marker zu erholen. Neurobiotin oder ein Zell-impermeante, fixierbaren, polar Tracers ein Fluorophor Alexa mit Biocytin Kombination kann als Alternative verwendet werden, um Biocytin. </li><li> Unter Infrarot-Differentialinterferenzkontrast, die entsprechende Zelle für die Aufzeichnung zu visualisieren. Um eine Unterbrechung des Axons zu minimieren, nähern sich dem Zellkörper durch die Pipette entlang ihrer Achse eine Senkung der &quot;Ansatz&quot; f mitSalbung in den meisten Mikromanipulatoren. Stellen Ganzzellableitungen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast mit Patch-Clamp - Physiologie Protokolle 19-22. HINWEIS: Vermeiden Sie die Zelle aus der Richtung des vermeintlichen Axon nähern, da sie die Axon trennen wird, visualisiert als Bleb am Schnittende (grüner Pfeil in Abbildung 1). Vermeiden Sie auch hohe positive Druck auf die Aufzeichnungs Pipette anwenden, während die Zelle nähern uns dem Auslaufen von biocytin zu minimieren, was zu hohen Hintergrundfärbung führen. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vorgeschlagene Ebene für Zellen für Biocytin Fills Annäherung. Das Bild zeigt eine Körnerzellen (GC) füllen mit biocytin während der Aufnahme, die (in rot mit 594-konjugierten Streptavidin) offenbaren biocytin verarbeitet wurde. Die GC hat seine Dendriten in der XY-Ebene ausgerichtet. Beachten Sie die abgetrennten KörnerzellAxon (grüner Pfeil) aufgrund Pipette Bewegung entlang der XY-Ebene. Beachten Sie, dass es dieses Neuron zu nähern entlang der XZ-Ebene ideal ist. Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m. <ol start="4"><li> In voltage clamp Konfiguration, bestimmen die gesamte Zellenkapazität und Serienwiderstand in Reaktion auf kleine (5 mV), kurz (30 ms) Spannungsschritte unter Verwendung der die Membran Testfunktion in Badebetrieb in einem Elektrodatenerfassung und -analyse-Software. Dadurch wird die Einrichtung von Ganzzellaufnahmebedingungen sorgen für biocytin-Füllung zu ermöglichen. </li><li> Führen physiologische Aufnahmen in entweder Strom- oder Spannungs-Clamp-Modus nach Bedarf. Eine minimale Aufzeichnungszeit von&gt; 10 min bei 34 ° C ist ideal. HINWEIS: Längere Aufnahmezeiten können für Studien bei Raumtemperatur durchgeführt werden musste. </li><li> Nach Abschluss der physiologischen Aufnahmen Wiederherstellung der Patch-Clamp-Konfiguration, indem langsam die Aufzeichnungs Pipette in kleinen Schritten bewegt, nach oben alternierende (entlang der Z-Achse) undnach außen (entlang der X-Achse) in der Spannung-Clamp-Modus. </li><li> Gleichzeitig überwachen die Kapazität und den Eingangswiderstand &quot;membrane Test&quot; -Funktion mit dem Verlust von kapazitiven Transienten und den Zusammenbruch der Stromantworten auf eine gerade Linie sichtbar zu machen, was auf die Wieder Abdichtung der Zelle und die Einrichtung einer Außen außerhalb an der Pipettenspitze Patch. bei einer depolarisierten Potential der Zelle Holding (-40 mV) wird die Wiederversiegelungsverfahren erleichtern. Hinweis: Dieses Verfahren zur Entfernung einer Zelle gewährleistet üblicherweise die vollständige Wiederherstellung der Soma und Dendriten. Gelten nicht positiven Druck auf die Aufzeichnungspipette während dieses Vorgangs oder während die Zelle aus der Pipette löst. Visualisierung des Somas der aufgenommenen Zelle in der Scheibe zeigt die erfolgreiche Trennung. Das Vorhandensein von Zelltrümmern oder ein Membranfleck am Ende der abgelösten Spitze weist in der Regel eine Dislokation des soma und wird nicht vollständig Zellmorphologie ergeben. </li><li> Achterner die Pipette aus der Zelle Lösen 3 die Scheibe in der Aufnahmekammer behalten - 5 min den Transport des Farbstoffes zu dem distalen dendritischen und axonalen Prozesse zu gewährleisten. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf eine 24-Well-Platte mit 4% PFA für die Fixierung. ACHTUNG: PFA ist krebserregend, und geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich der Handschuhe und Gesichtsmaske, verwendet werden muss , Hautreizungen und Einatmen zu vermeiden. PFA ist brennbar und muss außerhalb der Reichweite von Feuer gehalten werden. PFA ist nie in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden. PFA Fixierung müssen von den Bereichen isoliert werden für die Live-Scheibe Zubereitung verwendet Kontamination der Physiologie-Setup zu vermeiden, einschließlich Transferpipetten. </li><li> 24 bis 48 h nach PFA Fixation, übertragen die Scheiben auf 0,1 M Phosphat-gepufferter Saline (PBS) für die Lagerung vor der Immunfärbung. HINWEIS: Im Idealfall biocytin Erholung und Immunfärbung sind am besten, wenn durchgeführt, bald nach der Fixierung, obwohl Färbung pro<html> innerhalb von 7 d der Fixierung Ausbeuten gute Ergebnisse gebildet. für die Färbung durchgeführt bis zu und über 90 Tage nach der Fixierung 0,05% Natriumazid - Scheiben mit 0,02 in PBS gehalten werden. Obwohl über Nacht Fixierung in PFA gut für die meisten Antikörper arbeitet, ist es möglich, dass einige Antikörper am besten arbeiten, wenn die Dauer der Inkubation in Fixiermittel verringert wird. Die Fixierung in PFA für über 48 h reduziert die Verfügbarkeit von Antigenen und verringert die Chancen für eine erfolgreiche sekundäre Immunfärbung für neurochemische Marker. ACHTUNG: Natriumazid ist extrem gefährlich und kann reizend bei Kontakt mit der Haut oder den Augen oder bei der Einnahme oder Einatmen. Schwere Überbelichtung kann zum Tod führen. Die Kanzerogenität und Mutagenität der Verbindung sind nicht bekannt. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Handschuhe, Schutzbrille, einen Laborkittel und eine Staubmaske. Natriumazid wird niemals in den Abfluss entsorgt und müssen als chemischer Abfall gesammelt werden. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. Die Färbung des ersten primären Antikörper und Biocytin (Tag 1) HINWEIS: Die nach dem Immunostaining Verfahren ist für frei schwebenden Abschnitte und kontinuierliche erfordert bei einer niedrigen Geschwindigkeit (2 Umdrehungen / min, rpm) auf einem Schüttler für alle Inkubationsschritte schütteln. <ol><li> Waschen Sie das Gewebe 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4). HINWEIS: 0,1 M PBS kann im Labor im Handel erworben oder hergestellt werden , wie folgt (macht 1 L): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 l dH 2 0. HINWEIS: Wenn die gewünschte neurochemische Marker bekannt ist, das für ein Protein / Peptid-Anfärbung kann gleichzeitig mit Biocytin Färbung durchgeführt werden (Schritte 2,2-2,4). Wenn Färbung nur für biocytin, gehen 2,5 Schritt. </li><li> OPTIONAL: Block mit 10% Blocking Serum (BS; normales Ziegenserum (NGS), verdünnt in 0,3% Triton X-100 in PBS für 1 h bei RT). HINWEIS: Jede Vertiefung solltedas gleiche Volumen der Lösung erhalten; das empfohlene Volumen zwischen 250 bis 500 &amp; mgr; l / Vertiefung. Die Auswahl des Blockierungsserum wird von der Spezies basieren , in der die Sekundärantikörper angehoben werden (beispielsweise wird NGS verwendet für Farbstoff-konjugiertem Ziege anti- (jeweiligen primären Antikörperspezies)). Wenn der Bedarf an verschiedenen Arten angehoben Sekundärantikörper zu verwenden, entsteht Abschnitte Immunfärbung, umfassen 10% jeder Normalserum in Blockierungsschritt (2) und 3% jeder Normalserum für die primären und sekundären Schritte Antikörper-Inkubation. </li><li> (OPTION) Inkubieren Sie die Abschnitte in primärer Antikörper, CB 1 R (polyklonalen, Meerschweinchen) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei RT O / N. CB 1 R wird verwendet , Cannabinoid - Rezeptor Typ 1 - Expression zu identifizieren. Hinweis: Dieser Schritt ist optional und nicht die biocytin Füllung zu offenbaren erforderlich. 2 veranschaulicht einen Abschnitt für Biocytin und CB 1 R während des ersten Färbeverfahren bezeichnet. O / N incuBation bei RT ist ausreichend für die meisten der primären Antikörper; jedoch bestimmte primäre Antikörper, einschließlich CB 1 R erfolgt , benötigen 3-5 d Inkubation. Wenn die Inkubation länger als 1 d werden muss, wird empfohlen, bei 4 ° C inkubieren, da Triton X-100 permeabilisiert Scheiben und zum Zerfall des Gewebes bei längerer Inkubation bei Raumtemperatur führen kann. Umfassen eine negative Kontrolle primärem Antikörper in mindestens einem Abschnitt für jede Serie von Experimenten als Kontrolle für die Spezifität des sekundären Antikörpers fehlt. Für Negativkontrollen wird der primäre Antikörper weggelassen, aber die 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS und BS zugegeben. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig2.jpg" /> Abbildung 2. Erfolgreiche CCK Anfärbung 1 Woche der Erholung von Biocytin Färbung und C Nach annabinoid Rezeptor Typ 1 (CB 1 R) - &lt;strong&gt; Kennzeichnung. (A - C) Konfokale Bilder bei 60X zeigt das Biocytin gefüllten Neuron (A) und CB 1 R Immunreaktivität (B), durch den Pfeil angedeutet ist . Der gleiche Abschnitt wurde nach 1 Woche (C) für die CCK - Immunfärbung verarbeitet. Die Überlagerung von Bildern wird in D gezeigt. CCK Immunreaktivität wurde mit weit rot zeigte, und wurde Pseudo-farbig in Cyan. (E) Morphologische Rekonstruktion der biocytin gefüllten Zelle in A. Beachten Sie, dass die biocytin und CB 1 R - Färbung zeigen sich auch nach dem zweiten CCK - Immunfärbung. Beachten Sie auch die erwartete Verteilung von CB 1 R und CCK - Immunfärbung Muster. (F - H) vergrößertes Bild der Axon aus der Zelle, wie in A, zeigen eine enge Zusammenarbeit Lokalisierung von biocytin und CB 1 R in Axonen (Pfeilspitzen). Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m (A - D), 100 &amp; mgr; m (E) und 10 &amp; mgr; m ( <strong&gt; F - H). Die Bilder werden von Yu et al wiedergegeben. 2015 9. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> (Tag 2) <ol start="4"><li> Waschen Sie die Gehirnschnitte für 10 min 3 x jeweils in 0,1 M PBS (pH = 7,4). </li><li> Inkubieren der Abschnitte in Streptavidin roten Farbstoff-Konjugat (Konzentration: 1: 1,000; Anregung: 594 nm mit Emission im sichtbaren roten Spektrum) mit 0,3% Triton X-100 und 3% BS in 0,1 M PBS bei 4 ° CO / N in der dunkel (in Aluminiumfolie eingewickelt), um die biocytin zu offenbaren. Optional: Fügen Sie einen sekundären Antikörper, Ziege-Anti-Meerschweinchen (Konzentration: 1: 500; Anregung: 488 nm und Emission in grün), mit der obigen Inkubation, wenn die optionale primäre Inkubation folgende in Schritt 2.3. HINWEIS: Sekundäre Antikörper wird nur, wenn die optionale primäre Antikörper-Färbung (Schritt 2.3) durchgeführt wird, benötigt werden. Zur Visualisierung biocytin, eine streptavidin-Fluorophor - Konjugat mit einem Emissionsspektrum in rot wird empfohlen, da es eine feinere Axone im Detail zu visualisieren hilft und mit besseren Kontrast (Abbildungen 1 - 3). Während Doppel- oder Dreifachimmunfärbung, um miteinander Kreuzreaktivität von sekundären Antikörpern zu vermeiden, fügen sekundäre Antikörper nach dem anderen in einer seriellen Art und Weise (2 h Intervall zwischen seriellen Ergänzungen der Antikörper ist ausreichend). 3A stellt eine biocytin gefüllte Zelle ohne den optionalen primären Antikörperfärbung verarbeitet und vor der Resektion abgebildet. </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54880/54880fig3.jpg" /> Abbildung 3. Erfolgreiche Zweite Immunostaining nach der Wiederherstellung von Biocytin Morphologie und Resektion. (A1) konfokale Bild eines 300 &amp; mgr; m in Scheiben schneiden die Erholung der dendritischen Morphologie eines biocytin gefüllten Zelle zeigt. (&lt;strong&gt; A2) Membranspannung Spuren des Neurons in Reaktion auf +500 und -100 pA Strominjektionen. (B) Die Gewinnung des biocytin gefüllten soma in einem 50 &amp; mgr; m Abschnitt erhalten , nachdem die 300 &amp; mgr; m Abschnitt Resektion (in A1) nach der Montage und Bildgebung. (B2) Nachfolgende Immunfärbung des dünnen Abschnitts ergab Kolokalisation des biocytin gefüllten soma (rechtes Bild) mit CCK (Mitte). Das fusionierte Bild wird auf der rechten Seite dargestellt. Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m. Panel - A2 wird mit Genehmigung von Yu et al wiedergegeben. In der Presse, 25. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54880/54880fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> (Tag 3) <ol start="6"><li> Waschgehirnschnitte 3x für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4). </li><li> Um die Fluoreszenz zu schützen und Wiederfärbung in der Zukunft zu erleichtern, montieren Sie die Sektionen in einer auf Wasser basierenden Montagemedium und die Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln. HINWEIS: Es ist am besten Abschnitte Restain so früh wie möglich Schwierigkeiten zu vermeiden, bei der Entfernung der Nagellack von der Rutsche, Schimmelpilzbefall und Austrocknung des Gewebes aufgrund einer Leckage des Befestigungsmediums aus dem Glasträger. Mikrobielle Kontamination kann durch Verwendung von 0,02% Natriumazid in PBS verhindert werden. ACHTUNG: Natriumazid ist sehr giftig und entzündlich , wenn es mit Wasser in Kontakt ist. Bitte beziehen Sie sich auf die Standardbetriebsverfahren für die Handhabung und Entsorgung von gefährlichen Chemikalien. (Tage 4 - 7) </li><li> Führen konfokale Bildgebung mit einer Anregung bei 594 und 488 nm und bei einer Vergrößerung von 20X oder 40X zu Biocytin gefüllten Neuronen in roten und neurochemischen Markern (CB 1 R) in grün offenbaren. Beurteilen colabeling (Abbildung 2). </li><li> Stellen Sie die Kamera Belichtung auf weniger als 100 ms Photobleaching und OBTA zu vermeidenin der konfokalen Bildstapeln der axonalen und dendritischen Dorne des gesamten Neurons. Verwenden konfokale Bildstapel und Neuron Tracing-Software-Pakete, die neuronale Morphologie zu rekonstruieren. </li></ol> 3. Die Färbung des zweiten primären Antikörpers: HINWEIS: Während der zweite kann Immunofärbung Schritt 90 d nach der ersten Färbung durchgeführt werden, eine optimale Färbung erreicht, wenn der zweite primäre Antikörper-Färbung innerhalb von 7 durchgeführt wird - d 10. (Nach 7-90 d) <ol><li> Tragen Sie Aceton auf einem Wattestäbchen und der Streifen den Nagellack aus der Glasträger. </li><li> Entfernen Sie das Deckglas sorgfältig fein Spitze einer Pinzette und legte ein paar Tropfen von 0,1 M PBS auf den Abschnitten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Abschnitte von der Folie einen feinen Pinsel verwenden und waschen Sie sie in 0,1 M PBS für 24 bis 48 h auf einem Schüttler in Aluminiumfolie bei schwachem Licht bedeckt bei 4 o C HINWEIS: Es ist wichtig, mit einem zu decken Abschnitteluminum Folie gegen Ausbleichung vermeiden. </li><li> Um eine vollständige Entfernung des Eindeckmediums gewährleisten, waschen Sie die Abschnitte 1 - 2x am folgenden Tag in 0,1 M PBS für jeweils 10 min. </li><li> Weiter mit der Inkubation in der zweiten primären Antikörper ( zum Beispiel Cholecystokinin, ein Neuropeptid gefunden in bestimmten GABAergen Inter (CCK; Konzentration: 1: 1,000; monoklonaler Maus - Antikörper)) für 1 d (Figur 2). Hinweis: Dieses Verfahren ist ähnlich wie 2.3 zu Schritt aber verwendet einen anderen Antikörper. Zusätzlich wird der Blockierungsschritt während des Wiederfärbungs weggelassen. </li><li> Waschen Sie die Gehirnschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 M PBS (pH = 7,4). </li><li> Fleck mit dem Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers Ziege-Anti-Maus (Konzentration: 1: 500; Anregungswellenlänge: 647 nm), um sicherzustellen, dass die Anregungs-Emissionsspektren des sekundären Antikörpers nicht überlappen mit Streptavidin (Konzentration: 1: 1,000; Anregungswellenlänge: 594 nm) und vor ImmunofluoreszenzFlecken. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte in wässrigen Eindeckmittel und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. HINWEIS: Speichern der Abschnitte bei 4 ° C in einer lichtundurchlässigen Speicherfeld, um die Fluoreszenz zu schützen. </li></ol>

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A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons).">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons).</a> J Vis Exp. (91), e51706 (2014).</li><li>Jinno, S., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+characterization+of+hippocamposeptal+projecting+GABAergic+nonprincipal+neurons+in+the+mouse+brain:+a+retrograde+labeling+study.">Immunocytochemical characterization of hippocamposeptal projecting GABAergic nonprincipal neurons in the mouse brain: a retrograde labeling study.</a> Brain research. 945 (2), 219-231 (2002).</li><li>Yu, J., Proddutur, A., Swietek, B., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Reduction+in+Cannabinoid-Sensitive+Heterotypic+Inhibition+of+Dentate+Basket+Cells+in+Epilepsy:+Impact+on+Network+Rhythms.">Functional Reduction in Cannabinoid-Sensitive Heterotypic Inhibition of Dentate Basket Cells in Epilepsy: Impact on Network Rhythms.</a> Cereb Cortex. , (2015).</li><li>Proddutur, A., Yu, J., Elgammal, F. S., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure-induced+alterations+in+fast-spiking+basket+cell+GABA+currents+modulate+frequency+and+coherence+of+gamma+oscillation+in+network+simulations.">Seizure-induced alterations in fast-spiking basket cell GABA currents modulate frequency and coherence of gamma oscillation in network simulations.</a> Chaos. 23 (4), 046109 (2013).</li><li>Scharfman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+dentate+neurons+by+morphology+and+electrophysiology+in+hippocampal+slices:+granule+cells,+spiny+hilar+cells+and+aspiny+'fast-spiking'+cells.">Differentiation of rat dentate neurons by morphology and electrophysiology in hippocampal slices: granule cells, spiny hilar cells and aspiny 'fast-spiking' cells.</a> Epilepsy Res Suppl. 7, 93-109 (1992).</li><li>Tasker, J. G., Hoffman, N. W., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+intracellular+markers+for+combined+electrophysiological,+morphological+and+immunohistochemical+analyses.">Comparison of three intracellular markers for combined electrophysiological, morphological and immunohistochemical analyses.</a> J Neurosci Methods. 38 (2-3), 129-143 (1991).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls die gepatchte Zelle mit biocytin Füllung ist der wichtigste Schritt, um die vollständige Wiederherstellung der Morphologie zu gewährleisten. Für vollständige Erholung der Zelle, ist es wichtig, eine optimale Schichtorientierung zu wählen Sie das Durchtrennen von Prozessen während des Schneidens zu minimieren. Diese Orientierung kann auf der Schaltung und Zelltyp unter Prüfung auf Basis unterscheiden. Als nächstes ist es no...

Das Gehirn ist in den strukturellen und funktionellen Eigenschaften der einzelnen neuronalen Elemente der Vielfalt bekannt. die Rollen von verschiedenen neuronalen Typen in der Gehirnfunktion und Pathologie zu verstehen, müssen die Charakterisierung und die eindeutige Identifizierung von Neuronen. Strukturell die morphologischen Merkmale von somatisch-dendritischen Standort definiert bestimmen die möglichen Eingaben, die ein bestimmtes Neuron erhält, während das Muster der axonalen arborization Potential postsynaptischen Ziele identifiziert. Die strukturelle Vielfalt von Neuronen hat seit den Tagen von Ramón y Cajal brech histologische Untersuchungen 1 geschätzt. Das Aufkommen von Einzelzellen-Aufnahmetechniken gezeigt, dass strukturell verschiedene Neuronen zeigen Unterschiede auch in Feuermuster und synaptische Eigenschaften. Die Vielfalt in der Struktur und Physiologie zeigt sich besonders deutlich in GABAergen inhibitorischen Neuronen 2,3. Darüber hinaus ist es zunehmend deutlich geworden, daß structurally ähnliche Neuronen können verschiedene neurochemische Marker und zeigen entsprechende funktionelle Unterschiede 4 auszudrücken. In ähnlicher Weise Neuronen mit den gleichen neurochemische Marker können 5-10 unterschiedliche Strukturen und Funktionen haben. So wird in der Praxis ergeben sich bei der Analyse der funktionellen Eigenschaften von Neuronen und ihre Rolle in dem Netzwerk definieren, sowohl die morphologischen und neurochemischen Identitäten. Sogar mit dem Aufkommen von Reportermauslinien spezifische neurochemische Marker Targeting, ist es oft notwendig , Morphologie und Subtyp Identität basierend auf Immunhistologie 11 zu bestimmen. Das Standardverfahren verwendet, um Zellen zu charakterisieren, in akuten Hirnschnitten aufgezeichnet ist, sie mit biocytin oder Neurobiotin während der Aufnahme zu füllen, fixieren Sie die Abschnitte in Paraformaldehyd (PFA) im Anschluss an den Aufnahmen und Immunhistochemie verwenden, um die Morphologie und Neurochemie zu offenbaren. Da die Dicke der Abschnitte für slice Physiologie sind typischerweise 300 umoder mehr, und weil die meisten Antikörper nicht den ganzen Weg durch diese Tiefe zu durchdringen, müssen die Scheiben 60 um oder weniger zu ermöglichen für die gleichzeitige Immunofärbung für Biocytin und neurochemischen Markern 12-14 erneut geschnitten werden. Leider Resektion ist mühsam; Risiken Verlust von Gewebe während des Schneidens; und kann dazu führen, Gewebe Schrumpfung auf Differential, morphologische Rekonstruktionen zu komplizieren. Darüber hinaus könnte vorherige Kenntnis der Morphologie helfen, die Kandidatenmarker verengen, die wahrscheinlich von den Zellen exprimiert werden. Wir haben den Standard biocytin Immunhistologie Protokolle modifizierte serielle Verarbeitung von Abschnitten für die Gewinnung von Morphologie zuerst zu ermöglichen, und dann zur Identifizierung potenzieller neurochemischen Marker. Immunhistochemie ist die Untersuchung der Antigenverteilung in Geweben oder Zellen , und kann mit einem Enzym, Fluoreszenzmarkierungen, radioaktive Elemente sichtbar gemacht werden, oder Goldkolloidpartikel 15. Das Verfahren involves primären Antikörper unter Verwendung eines oder mehrerer spezifischer Antigene durch die Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper gefolgt spezifisch markieren und zu verstärken, den primären Antikörper für die Visualisierung Targeting. Aufgrund der Notwendigkeit, die Fluoreszenzspektren von jeder sekundären Antikörpers ohne Überlappung zu unterscheiden, nur eine begrenzte Anzahl von Antigenen können gleichzeitig geprüft werden. So könnte vorherige Kenntnis der Morphologie bei der Auswahl der Kandidaten neurochemischen Marker für die Zellklassifizierung nützlich sein. Konzeptionell ist das Grundprinzip hinter serielle Verarbeitung von bereits gefärbten Schnitten basiert auf der Prämisse , die für ein Protein oder Peptid - Immunmarkierung nicht mit Antigenität und anschließender Immunmarkierung für einen strukturell unabhängig Peptid 16 stören sollte. Dieses Fehlen von Störungen ist aufgrund der Bindung der Antikörper an ein bestimmtes Protein Epitop auf einem Antigen und daher ermöglicht die gleichzeitige Färbung von mehreren Antigenen im gleichen Gewebe. Die Anzahl von Antigenen revealed durch Immunfärbung wird durch die Notwendigkeit für die nicht überlappenden Spektren der fluoreszierenden Sekundärantikörper und durch die Notwendigkeit , zu zielen einzelnen Antigene mit Antikörpern , die in verschiedenen Spezies begrenzt , um Kreuzreaktivität zu eliminieren , 17,18. Zwar ist dies die Argumentation hinter seriell anstatt gleichzeitige Markierung mit zwei verschiedenen Antikörpern, die unseres Wissens in Wechselwirkung treten kann, wurde eine Immunfärbung für ein zweites Antigen nicht nach der Beendigung der Immunmarkierung für ein oder mehrere Antigene auf montierten Abschnitten berichtet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur seriellen Immunfärbung von zuvor gefärbt und montiert Abschnitte. Während wir uns ausführlich diesen Prozess für eine serielle Immunmarkierung Verfahren zur Gewinnung von Morphologie gefolgt von Protein / Peptid-Markern in dicken Abschnitten Färbung können die gleichen Verfahren wie auch in Standard, dünne histologische Schnitte verwendet werden. Darüber hinaus beschreiben wir einen praktischen Ansatz für aufgezeichnet Neuronen mit biocytin und den Prozess füllen das zu verdrängenElektrode aus der Zelle nach Abschluß der Aufnahmen die Füllung der axonalen und dendritischen Dorne von Neuronen zu optimieren, wie in unserem jüngsten Arbeiten 6,8 dargestellt. Der wichtigste Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweise besteht darin, daß die Morphologie der aufgezeichneten Zelle kann vollständig vor der Resektion oder immunostain den Scheiben Versuch gewonnen und abgebildet werden. Obwohl Probleme mit dem Eindringen bestimmter Antikörper machen kann es für die sekundäre Immunfärbung der Resektion Scheiben notwendig, die hier ausgeführten Verfahren würde die Notwendigkeit beseitigen, um komplexe Neuronen aus mehreren Abschnitten rekonstruieren und Probleme aufgrund von Gewebeverlust und unterschiedliche Schrumpfung vermeiden würde, die den Wiederaufbau gefährden können folgende Resektion. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die Verfahrenskosten zu reduzieren, Zeit, Mühe und teure Antikörper durch Immunfärbung begrenzen und Wieder sectioning zu Scheiben in denen Biocytin gefüllten Neuronen gewonnen werden. Die praktischste Aspekt ist die Anzeigesätzliche Immunfärbung, die die oben genannten Technik vor der Verwendung auf gefärbten Schnitten Monate durchgeführt werden kann. Insbesondere würde die Rückgewinnung von Morphologie erheblich reduzieren das Potential, daß die physiologischen Daten von den Zellen aufgrund einer Unfähigkeit verworfen ist eine grundlegende morphologische Charakterisierung des Zelltyps zu erhalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:203px;">&#160;S7653</td>
			<td style="width:151px;">Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCL&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60129</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>229806</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guinea pig anti CB1&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Af530-1</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse anti CCK</td>
			<td>CURE, UCLA</td>
			<td>courtesy of G. Ohning</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti Parvalbumin</td>
			<td>Swant</td>
			<td>PV27</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin, Alexa Fluor conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S11227</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibodies</td>
			<td>Invitogen Molecular probes</td>
			<td>Alexa Fluor conjugated dyes</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labnet orbit low speed shaker</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>S-2030-LS</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slide folders</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71520</td>
			<td>Immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibratome VT 1200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142066</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiclamp 700B amplifier</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Multiclamp 700B</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCLAMP 10 Software</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>pCLAMP 10&#160;</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1440 digitizer</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter tips</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>171-0020</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-335-100</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microloaders</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Electrophysiology</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers

Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Zellen, die die Patch-Clamp-Technik haben zur Identifizierung von verschiedenen neuronalen Typen auf Basis von Brennmustern erlaubt. Die Einbeziehung von biocytin / Neurobiotin in der Aufzeichnungselektrode ermöglicht Post-hoc-Rückgewinnung von morphologischen Details, die notwendig sind, um die dendritischen Verzweigungen und die Regionen durch die Axone der aufgezeichneten Neuronen gezielt zu bestimmen. Jedoch angesichts der Anwesenheit von morphologisch ähnlichen Neuronen mit unterschiedlichen neurochemical Identitäten und Funktionen, immunhistochemische Färbung für die zelltypspezifische Proteine ​​ist wesentlich, um endgültig Neuronen zu identifizieren. Um Netzwerk-Konnektivität, Gehirnschnitte für physiologische Aufnahmen sind bei einer Dicke von 300 &amp; mgr; m oder mehr halten vorbereitet. Doch oft diese Dicke behindert immunhistologischer Nachbearbeitung aufgrund von Problemen mit dem Antikörper Penetration, erfordert die Resektion des Gewebes. Resektion von Scheiben ist eine anspruchsvolle Kunst, die oft Resulting in dem Verlust von Gewebe und die Morphologie der Zellen aus denen elektrophysiologische Daten erhalten, die Daten unbrauchbar macht. Seit Wiederherstellung der Morphologie würde Datenverlust und Führung bei der Auswahl der neuronalen Marker zu begrenzen, haben wir eine Strategie zur Gewinnung von Zellmorphologie angenommen zuerst durch sekundäre Immunfärbung gefolgt. Wir stellen einen praktischen Ansatz bei physiologischen Aufnahmen und anschließender Serienimmunfärbung für die Gewinnung von Morphologie biocytin Füllung, gefolgt von der restaining von Abschnitten der neurochemischen Identität zu bestimmen. Wir berichten, dass Abschnitte, die mit biocytin gefüllt waren, mit Paraformaldehyd fixiert (PFA), gebeizt und Eindecken kann später mit einem zweiten primären Antikörper Tage entfernt und erneut gefärbt. Diese restaining beinhaltet die Entfernung des Deckglases, das Waschen von Abschnitten in einer Pufferlösung und die Inkubation von primären und sekundären Antikörper der neurochemischen Identität zu offenbaren. Das Verfahren ist vorteilhaft zum Eliminieren datein Verlust aufgrund einer Unfähigkeit Morphologie und zur Eingrenzung der neurochemische Marker wiederherzustellen basierend auf Morphologie getestet werden.

Nach dem erfolgreichen Abschluss behalten die Abschnitte der biocytin Füllung und die Immunmarkierung in Schritt 2 durchgeführt und kann mit Hilfe einer konfokalen oder Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. Zusätzlich wurde die bearbeiteten Abschnitte auch Immunofärbung für das markierte Antigen während der nachfolgenden Verarbeitung in Schritt 3 in dem Abschnitt in 2 dargestellt, die Morphologie einer Biocytin gefüllten Neuron in einem dicken Abschnitt (30...

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Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

immunostaining-biocytin-filled-processed-sections-for-neurochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.9K Aufrufe.  Rutgers New Jersey Medical School.  Dieses Protokoll stellt eine Methode für die morphologische Erholung von Neuronen während elektro Aufnahmen mit biocytin Füllung und anschließende immunhistochemischen Nachbearbeitung geflickt. Wir zeigen, dass dicke biocytin gefüllten Abschnitte, die später mit einem zweiten primären Antikörper Tage oder Monate erneut gefärbt können wurden gefärbt und Eindecken werden. 

Serie: Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Morphometrische Analysen von Netzhautschnitte

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves are frequently damaged because of trauma or disease. As methods and strategies have been developed to assess peripheral nerve injury in animal models, function and regeneration, analyzing the morphometry of the peripheral nerve has become an essential terminal outcome measurement. Toluidine blue staining of nerve cross sections obtained from resin embedded nerve sections is a reproducible method for qualitative and quantitative assessments of peripheral nerves, enabling visualization of morphology number of axons and degree of myelination. This technique, as with many other histological methods, can be difficult to learn and master using standard written protocols. The intent of this publication is therefore to accentuate written protocols for toluidine blue staining of peripheral nerves with videography of the method, using sciatic nerves harvested from rats. In this protocol, we describe in vivo peripheral nerve fixation and collection of the tissue, and post-fixation with 2% osmium tetroxide, embedding of nerves in epoxy resin, and ultramicrotome sectioning of nerves to 1-2&#956;m thickness. Nerve sections then transferred to a glass slide and stained with toluidine blue, after which they are quantitatively and qualitatively assessed. Examples of the most common problems are shown, as well as steps for mitigating these issues.

Here we present a protocol to visualize fine structures of peripheral nerves by obtaining and staining 1-2 &#181;m sections with toluidine blue

Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet Abschnitte für die Beurteilung der Morphologie der peripheren Nerven

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...