Wir möchten Profs danken. Huibert Mansvelder und Bert Sakmann für umfangreiche Unterstützung, Dr. Marcel Oberländer für fruchtbare Diskussionen und die Bereitstellung neuronalen Tracing und Brendan Lodder für technische Unterstützung. Die Daten wurden mit Hilfe des ntrode VI für LabView, großzügig von Bruno R. (Columbia Univ., NY, USA) zur Verfügung gestellt erworben. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und des Bernstein Zentrums für Computational Neuroscience, Tübingen unterstützt (vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Zentrum für Neurogenomik und Kognitionsforschung (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), die Finanzierung zu CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 und ENC-Network # p3-c3) und der VU University Amsterdam.

1. Vorbereitung der Tiere Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem niederländischen Gesetz und nach der Auswertung von einer lokalen Ethikkommission an der VU University Amsterdam, Niederlande, durchgeführt. <ol><li> Betäuben einer Wistar-Ratte (P25-P45, ♂ / ♀) mit Isofluran (2-3% in Sauerstoff) und anschließend mit Urethan (20% in 0,9% NaCl, 1,6 bis 1,7 g / kg) durch intraperitoneale Injektion. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose durch Überwachung Prise Entzug, Augenlid Reflexe und Bewegungen Tasthaare. </li><li> Verwalten Sie eine zusätzliche Dosis von Urethan (10% der Anfangsdosis) im Falle das Tier nicht ausreichend Narkosetiefe zu erreichen, oder wenn Tasthaare Zuckungen im Verlauf des Experiments beobachtet. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Tier auf der stereotaktischen Rahmen mit einem Heizkissen ausgestattet, legen rektale Temperatursonde und die Körpertemperatur des Tieres zu halten, bei 37,5 ± 0,5 ° C durch ein Heizkissen. </li><li&gt; Positionieren Sie den Kopf des Tieres in der stereotaktischen Rahmen, schneiden Sie die Haare am Oberkopf mit einer Schere, um die Haut sichtbar zu machen. </li><li> Injizieren Sie 100 ul 1% Lidocain (in 0,9% NaCl) subkutan zur Lokalanästhesie an der Einsatzstelle und warten 3-5 min. Entfernen Sie die Haut, die die Oberfläche des Schädels durch Schneiden in der Schwanz-to-rostrale Richtung und reinigen Sie die restlichen Gewebe. </li><li> Reinigen Sie den Schädel ausgiebig mit 0,9% NaCl und saugfähige Tupfer. </li><li> Bestimmen der Koordinaten des Zielbereichs auf der linken Hemisphäre (zum primären somatosensorischen Kortex (S1): 2,5 mm posterior und 5,5 mm lateral zum Bregma). Markieren Sie die Stelle auf den Schädel mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift. </li><li> Abkratzen Knochen sanft von einem Zahnbohrer aus der Region von Interesse, bis der Knochen wird transparent und Blutgefäße sind deutlich sichtbar. </li><li> Einen 0,5 mm x 0,5 mm Kraniotomie, indem ein Fenster in der ausgedünnten Schädel mit einem Skalpell (Nr. 11), die Vermeidung von Schäden an der Dura materund Blutgefäße. Optional: Markieren Sie die Kanten der Kraniotomie mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift, um die Sichtbarkeit zu verbessern. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht der Sekundenkleber auf die Trocken Schädel und Zahnzement, ein Bad (dh die Aufnahme Kammer), die den Kraniotomie zu konstruieren. </li><li> Trimmen der Whisker an der kontralateralen Seite genau 5 mm von der Whisker Follikel. Optional: Markieren Sie die Barthaare getrimmt mit schwarzer Mascara. </li></ol> 2. Juxtasomal Recordings und Biocytin Labeling <ol><li> Machen Patch-Pipetten aus Borosilikatglas mit innen Spitzendurchmesser von ~ 1 um bis Elektroden mit 3-5 MOhm Widerstand zu erhalten. Hinweis: Die ideale Pipette Morphologie für die juxtasomal Aufnahme ist eine allmähliche Verjüngung schlank, eine niedrige Konuswinkel, und a ~ 1 um Spitze (Abbildung 1). </li><li> In Abhängigkeit von der Aufzeichnungstiefe (bezogen auf die Pia-Oberfläche), sollten die Abmessungen der Verjüngung der Aufzeichnungselektrode eingestellt werden. Von entscheidender Bedeutung ist, dass ter verjüngen Durchmesser sollte weniger als 75 um bereits am Eintrittspunkt in das Gehirn, um mechanische Beschädigungen oder Stress auf den Aufnahmebereich zu vermeiden. Dies zeigt, daß bei oberflächlichen kortikalen Aufnahmen, eine Verjüngung von 300-500 &amp;mgr; m mit einem Außendurchmesser von maximal 75 &amp;mgr; m erforderlich ist (Fig. 1A), während die Aufnahmen von relativ tiefen kortikalen Schichten erfordern eine längere Verjüngung 1.500-1.800 &amp;mgr; m, wieder mit maximaler Außen Durchmesser von 75 &amp;mgr; m (1,800 &amp;mgr; m an der Elektrodenspitze). </li><li> Laden Sie die Patch-Pipette mit normalem Ratten Rufton (NRR), ergänzt mit 2% Biocytin (siehe Tabelle 1 für Lösungen und Reagenzien) und montieren Sie die Patch-Pipette auf einem Kopf Stufe auf einen Mikromanipulator befestigt. </li><li> Den Winkel des Elektrodenhalters bis 34 ° in Bezug auf die Sagittalebene, um gezielt die Kolonne D2 von Ratten-S1. </li><li> Schließen Sie das Kopfstufe mit einem Verstärker in Brücke-Modus (dh Stromzange). </li><li> Positionieren Sie den Patchpipettieren, in der Nähe der Kraniotomie. Füllen Sie die Badewanne mit 0,9% NaCl und bestimmen den Elektrodenwiderstand, der zwischen 3-5 MOhm, durch Anlegen einer Rechteckimpuls mit positiven Stromeinspeisung (1 nA, 200 ms an / aus) bewertet sein sollten. </li><li> Stellen Überdruck von 100 bis 150 mbar und vorab die Patch-Pipette in ein um Schritte, während die Anwendung positiver Strom als Rechteckimpulse (1 nA, 200 ms an / aus). Überwachen Sie die robuste Widerstandsänderung bei der Kontaktaufnahme mit der Dura mater. An diesem Punkt setzen die Koordinaten der Mikromanipulator auf &quot;Null&quot;, um genaue Tiefenmessungen zu ermöglichen. </li><li> Geleistete in 1 um Schritt-Modus, bis der Patch-Pipette durchdringt die von einem plötzlichen Abfall des Elektrodenwiderstand angegeben Dura mater. Entfernen des Haltedrucks der Pipette. </li><li> Suche nach einzelnen Einheiten beim Vorrücken in 1 um Schritte. Überwachung der Elektrodenwiderstand kontinuierlich durch Anlegen von 200 msec ein / aus-Impulse. Eine Erhöhung der Elektrodenwiderstand typicVerbündeter zeigt die Nähe eines einzelnen Neurons. Schieben Sie die Elektrode, bis positive Aktionspotential (AP) Wellenformen von ~ 2 mV aufgezeichnet (2A und 2B). </li><li> Optional: Nimmt die spontane Spiking Muster der Neuronen zu bestimmen und Whisker-evozierte Spiking von, zum Beispiel, nach kaudal Ablenken einzelnen Whisker für 200 ms unter einem Winkel von 3,3 º mit einer piezoelektrischen Vorrichtung 18. </li><li> Schieben Sie die Elektrode bis der Widerstand ist 25-35 MOhm und Spikes Amplituden von 3-8 mV optimale Bedingungen für juxtasomal Füllung erhalten. Starten des juxtasomal Füllung durch Anlegen von Rechteckimpulsen positiver Strom (1 nA, 200 ms EIN / AUS). Langsam und schrittweise Erhöhung der Strom, der durch Stufen von 0,1 nA, während die Überwachung der AP-Wellenform und Frequenz (2A und 2B). </li><li> Überwachen Sie die Membranöffnung als eine klare Zunahme der AP-Frequenz während der Ein-Phase des Blockimpuls (2C </strong&gt;). Die Spitzen-Wellenform während Füllung zeigt eine erhöhte Breite und reduziert nach-Hyperpolarisation (2C und 2D). Weitere Parameter sind eine erhöhte Lärm oder eine kleine (1-5 mV) negativen DC-Verschiebung. </li><li> Erhöhen oder verringern den Strom (1 nA) beim Ausfüllen stabile Biocytin Infusion erhalten. Reduzieren oder stoppen Sie die Stromimpulse auf plötzlichen Anstieg der AP-Frequenz, um die Toxizität durch Über Zustrom von extrazellulären Ionen wie Natrium-Ionen zu vermeiden. Hinweis: jedes Neuron wird unterschiedlich auf die Stromeinspeisung und juxtasomal Kennzeichnung Parameter müssen je nach individuellen Aufnahmebedingungen angepasst werden reagieren. </li><li> Das Signal nach dem Stoppen der Stromeinspeisung genau beobachten. Die Spitzen-Wellenform nach einer Füllung Sitzung ist in der Regel erweitert und zeigt eine Hyperpolarisation nach stark reduziert. Warten für die Wiederherstellung der Neuronen, die offensichtlich ist, wenn die Spitzen-Wellenform wieder seine ursprünglichen Eigenschaften (dh Gegenwartnormal nach-Hyperpolarisation, Abbildung 2). </li><li> Wiederholen Biocytin Sitzungen zum Ausfüllen nach der vollständigen Wiederherstellung des Neurons zu Biocytin Last für eine verbesserte Qualität der Färbung zu erhöhen. </li><li> Fahren Sie die Patch-Pipette in Schritten von 1 um, bis die Spitze Amplitude abnimmt, um mechanische Spannungen auf die Zelle zu reduzieren. Warten Sie mindestens 1 Stunde für die Biocytin intrazellulär diffundieren dabei eng Überwachung der Körpertemperatur des Tieres und die Atmung. </li></ol> 3. Perfusion der Tier-und Ausbau des Gehirns <ol><li> Bereiten Sie die Setup-Perfusion, spülen, und Vorspannung der Schlauch mit 0,9% NaCl. </li><li> Positionieren Sie das Tier auf einem OP-Tray und mit Standard-Etikettenband. Für ausreichende Tiefe der Narkose; Fuß Prise Augenlid und Reflexe sollten nicht vorhanden sein. </li><li> Machen Sie eine medial Schnitt (5-6 cm) durch die Bauchwand direkt unter dem Brustkorb seitlich und fahren in posterior-anterior Richtung, um das Brustbein aus.Ziehen Sie das Brustbein nach vorne und vorsichtig die Leber von der Membran. </li><li> Einen kleinen Einschnitt in der Membran, durch die unteren Rippen geschnitten und weiter den Schnitt entlang der gesamten Länge der Bauchhöhle, um das Herz freizulegen. </li><li> Entfernen Sie den Herzbeutel. </li><li> Führen Sie die Nadel in die linke Herzkammer und einen Einschnitt in den rechten Vorhof. Perfusion mit 0,9% NaCl (~ 8 ml / min) bis zur Entfärbung der Leber vollständig ist. </li><li> Schalten Sie die Infusions bis 4% Paraformaldehyd (PFA), bis Steifigkeit des Vorderpfote und Unterkiefer ist offensichtlich. </li><li> Enthaupten die Ratte mit einer Schere </li><li> Entfernen Sie die restlichen Nackenmuskulatur und setzen den Schädel komplett. </li><li> Positionieren Sie die Schere im Hirnstamm auf der Rückenseite und schneiden Sie die Knochen vorsichtig entlang der Pfeilnaht, die Aufrechterhaltung der Rückenlage. </li><li> Entfernen der Knochen von beiden Seiten der Pfeilnaht um das Gehirn freizulegen mit einer Pinzette. Die Dura vorsichtig entfernen, um zu vermeiden, dAmage. </li><li> Einem stumpfen Spachtel vorsichtig in die Bauchseite des Gehirns und das Gehirn zu entfernen sanft. </li><li> Post-fix das gesamte Gehirn über Nacht in PFA bei 4 ° C Schalten Sie das Gehirn, um 0,05 M Phosphatpuffer (PB) und lagern bei 4 ° C </li></ol> 4. Slicing the Brain in Tangential Sections <ol><li> Nehmen Sie das Gehirn aus dem 0,05 M PB und legte es auf ein Filterpapier zugewandten vorderen. Mit einem scharfen Rasierklinge schneiden Sie das Kleinhirn entlang der Frontalebene und trennen Sie die Hemisphären durch Schneiden entlang der mittlere Sagittalebene. </li><li> Sekundenkleber auf der Montageplattform und montieren Sie die linke Hemisphäre auf der Sagittalebene mit Front nach rechts. Die Montageplattform in einem Winkel von 45 ° auf einem Vibratom und tauchen das Gehirn in 0,05 M PB. </li><li> Sicherung einer Rasierklinge auf dem Vibratom und sicherstellen, dass der erste Kontakt mit der Hirnoberfläche ist in der Mitte der anterior-posterioren Ebene der Halbkugel. Cut 24 100 umAbschnitte und sammeln sie in einer 24-Well-Platte mit 0,05 M PB. </li></ol> 5. Die histologische Verfahren <ol><li> Führen histologischen Protokolle für die Cytochrom-Oxidase-Färbung 24 und der Avidin-Biotin-Peroxidase-Verfahren nach zuvor beschriebenen Verfahren 25. Optional: visualisieren Biocytin mit fluoreszierenden Avidin / Streptavidin-Konjugate Alexa. Dies ermöglicht zusätzlich Doppelfärbung mit retrograde oder anterograde Tracing-Techniken. </li><li> Wash Abschnitte 5 x 5 min mit 0,05 M PB und bereiten die 3-3&#39;-Diaminobenzidin (DAB)-haltigen Lösung für die Cytochrom-Oxidase-Färbung Fässer in Schicht 4 (L4) von S1 zu visualisieren (siehe Tabelle 2 für Lösungen und Reagenzien). Abschnitte 6-12 von Pia im vorgewärmten Lösung für 30-45 min bei 37 ° C. </li><li> Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB für 6 x 5 min und stillen endogenen Peroxidase-Aktivität durch Inkubation alle Abschnitte in 3% H 2 </sub&gt; O 2 in 0,05 M PB für 20 min bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB bei 5 x 10 min. Abschnitte in ABC-Lösung inkubiert (siehe Tabelle 3 für Lösungen und Reagenzien) über Nacht bei 4 ° C </li><li> Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB für 5 x 10 min und bereiten die DAB-Lösung, um die Biocytin gefüllten Neuron visualisieren (siehe Tabelle 4 für Lösungen und Reagenzien). Abschnitte in gefilterten Lösung inkubieren 45-60 min bei RT. </li><li> Spülen Abschnitte mit 0,05 M PB bei 5 x 10 min. Berg Abschnitte auf Objektträger und Deckgläschen mit Mowiol (siehe Tabelle 5 nach Lösungen und Reagenzien). </li><li> Bestimmen Sie Etikettierqualität mittels Lichtmikroskopie. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex.">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li><li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development.">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li><li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+without+disturbing:+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli.">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li><li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes).">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li></ol>

Die authros haben nichts zu offenbaren.

Die juxtasomal Verfahren ermöglicht die Aufnahme in vivo Aktionspotential Spicken von einzelnen Einheiten über Verhaltensbedingungen (narkotisiert, wach Kopf-fest oder frei zu bewegen) mit der Option der Biocytin-Beschriftung der aufgezeichneten Neuron für Post-hoc-Zelltyp Klassifizierung und / oder 3D-Rekonstruktion. Der große Vorteil ist, um physiologische Parameter in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration zu erhalten, noch in der Lage, das Neuron intrazellulär mit Biocytin <s...

Neuronale Netzwerke bestehen aus mehreren Zelltypen, dadurch gekennzeichnet, hochspezifische morphologische und physiologische Eigenschaften 1-7. Als eine Folge einzelner Zelltypen führen spezialisierte Aufgaben im Netzwerk (siehe beispielsweise Gentet et al. 8 und Burgalossi et al. 9). Wir sind erst am Anfang, um die Zelltyp-spezifische Funktionen in neuronalen Netzwerken zu verstehen und ist immer noch viel zu entdecken. Zu diesem Zweck sind viele Labors experimentelle Ansätze anwenden, die die Analyse von morphologischen Eigenschaften des gleichen neuronalen Population, aus der physiologischen Parameter wurden erhalten, 1,10-15 ermöglichen. Hier zeigen wir die juxtasomal Markierungstechnik 16,17, die elektrophysiologischen Ableitungen geht mit herkömmlichen Patch-Pipetten in der extrazellulären (also nicht-invasive)-Konfiguration in Kombination mit der Elektroporation aufgezeichnet Neuron mit Biocytin. Diegroße Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die nicht-invasive Natur sorgt dafür, dass Aktionspotential Spicken von einzelnen Neuronen ohne Veränderung (zB Dialyse) den intrazellulären Inhalt der Zelle aufgezeichnet. Gefolgt durch Elektroporation bietet die juxtasomal Ansatz die Möglichkeit, Post-hoc-Zell-Identifikation und Rekonstruktion der Funktion (Physiologie), um die Struktur (Morphologie) zu verknüpfen. Typischerweise beinhaltet morphologische Rekonstruktion Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Morphologie, die Quantifizierung der Wirbelsäule und / oder bouton Dichten oder auch Rekonstruktion von neuronalen Morphologie im Nanometerauflösung mittels Elektronenmikroskopie erweitert werden kann. Die juxtasomal Aufzeichnungstechnik kann für die in vivo-Aufnahmen von verschiedenen Zelltypen in kortikalen Schichten oder subkortikale Bereiche in einer Reihe von Arten verwendet werden, obwohl die meisten Studien haben die Technik in kleine Nagetiere wie Mäuse oder Ratten angewendet. Unsere Forschung ist auf die Aufnahme und Kennzeichnung Neuronen konzentriertaus Ratten primären somatosensorischen Kortex (S1) und beinhaltet visuelle Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen 18, dendritische Rekonstruktionen in Kombination mit präzise Erfassung in einem standardisierten Referenzrahmen Reverse Engineering kortikaler Netzwerke 4,19 und detaillierte Rekonstruktion der axonalen Architektur zur Charakterisierung Zelltyp-spezifische lokale und langfristige Projektion richtet 20. Im Vergleich zu alternativen In-vivo-Aufnahmetechniken (intrazelluläre oder ganze Zellen), sind juxtasomal Aufnahmen relativ stabil und können daher über Verhaltenszustände einschließlich betäubt 21,22 angewendet werden, sediert 14, wach kopffesten 23 oder sogar frei beweglichen Tieren 9 . Hier zeigen wir juxtasomal Kennzeichnung S1 eines Urethan-narkotisierten Ratten, obwohl wir betonen die allgemeine Anwendbarkeit dieser Technik auf viele Vorbereitungen der Wahl.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">SM-6 control system</td>
			<td style="width:275px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">LN- Mini 23 XYZ</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lynx-8 amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Neuralynx</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Axoclamp-2B amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Osada model EXL-M40</td>
			<td style="width:275px;">Osada, inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Piezoelectric device</td>
			<td style="width:275px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">PL140.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Labview</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ntrode Virtual Instrument&#160;</td>
			<td>R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">(Labview acq. software)</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sugi absorbent swabs</td>
			<td style="width:275px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">30601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Cytochrome C from equine heart</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Catalase from bovine liver</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">DAB</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">H2O2</td>
			<td style="width:275px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">7047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Vectastain standard ABC-kit</td>
			<td style="width:275px;">Vector</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Triton X100</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urethane</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:275px;">Pharmachemie</td>
			<td style="width:119px;">45.112.110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L5647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Simplex rapid dental cement</td>
			<td style="width:275px;">Kemdent</td>
			<td>ACR308/ACR924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Biocytin</td>
			<td style="width:275px;">Molekula</td>
			<td style="width:119px;">36219518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">PFA</td>
			<td style="width:275px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8187151000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Trizma base</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T4661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:275px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Analytical grade glycerol</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">HEPES</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">NaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">KCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">22,350-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">MgCl2</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtasomal biocytin labeling to study the structure-function relationship of individual cortical neurons

Die Hirnrinde von mehreren Schichten und viele verschiedene Zelltypen, die zusammen als ein Netzwerk für viele höhere kognitive Funktionen einschließlich Entscheidungen, sensorischen geführte Verhalten oder Speicher verantwortlich ist. Um zu verstehen, wie solche komplizierten neuronalen Netzwerken erfüllt die Aufgaben, ist ein wichtiger Schritt, um die Funktion (oder elektrische Aktivität) der einzelnen Zelltypen innerhalb des Netzes zu bestimmen, wenn das Tier bevorzugt ist die Durchführung einer entsprechenden kognitiven Aufgabe. Zusätzlich ist es ebenso wichtig, die anatomische Struktur des Netzwerks und der morphologischen Architektur der einzelnen Neuronen zu ermöglichen Reverse Engineering des kortikalen Netzwerks zu bestimmen. Technische Durchbrüche heute ermöglichen die Aufnahme Zellaktivität bei wachen, sich verhaltenden Tier mit der wertvollen Möglichkeit, Post-hoc-Identifizierung der aufgezeichneten Neuronen. Hier zeigen wir die juxtasomal Biocytin Markierungstechnik, die Aufzeichnungsaktion Potentiometer beinhaltetal Spick in der extrazellulären (oder lose-Patch)-Konfiguration mit herkömmlichen Patch-Pipetten. Die juxtasomal Aufnahmekonfiguration ist relativ stabil und zutreffend über Verhaltensbedingungen, einschließlich betäubt, betäubt, wach Kopf befestigt, und auch in der frei beweglichen Tier. Somit ermöglicht diese Methode die Verknüpfung Zelltyp-spezifische Aktionspotential Spick während das Verhalten der Tiere, um die Rekonstruktion der einzelnen Nervenzellen und letztlich der gesamten kortikalen Mikroschalt. In diesem Video-Manuskript, zeigen wir, wie einzelne Nervenzellen im juxtasomal Konfiguration kann mit Biocytin in der Urethan-narkotisierten Ratten für Post-hoc-Identifikation und morphologische Rekonstruktion gekennzeichnet werden.

Detaillierte Kenntnisse über 3D-Struktur der einzelnen Nervenzellen ist entscheidend für die Aufklärung Organisationsprinzipien neuronaler Netzwerke. Unsere Methode beinhaltet eine Pipeline, um qualitativ hochwertige Biocytin Kennzeichnung von einem in-vivo-Herstellung zu erreichen, wodurch post hoc neuronalen Klassifizierung und detaillierte Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur einzelner Neurone bei hoher Auflösung. Abhängig von der Qualität des juxtasomal Etikettierung werd...

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Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.

Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Aufrufe.  VU University Amsterdam.  Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur. 

Serie: Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...