This work was supported by Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), a Simons Foundation grant, and a Brain and Behavior Research foundation young investigator grant.

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDS) vor dem Gebrauch. Nanomaterialien können zusätzliche Gefahren im Vergleich zu ihren Schüttgut-Pendant. Verwenden Sie alle erforderlichen Sicherheitsmaßnahmen einschließlich technische Kontrollen (Dunstabzug, Lärm-Gehäuse) und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Schutzbrille, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe). 1. Herstellung der Puffer, Tensid und Polymer Solutions <ol><li> Herstellung von 100 mM NaCl - Lösung <ol><li> Man löst 584 mg NaCl in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen. </li></ol></li><li> Herstellung von 3% Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung <ol><li> Man löst 3 g SDS in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen. </li></ol></li><li> Herstellung von 2% Natriumcholat (SC) Lösung <ol><li> Löse 2 g sodium Cholat-Hydrat in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen. </li></ol></li><li> Herstellung von Abbildungspuffer (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl) <ol><li> Man löst 22,23 g Tris-Base und 58,44 g NaCl in 500 ml entsalztem Wasser ein Magnetrührstab und Platte verwendet wird. </li><li> Vorsichtig konzentrierte HCl hinzu bis ein pH von 8,1 erreicht ist. </li><li> entsalztem Wasser hinzufügen Endvolumen von 1 l zu erreichen </li></ol></li><li> Synthese von RITC-PEG-Polymer RITC <ol><li> Auflösen Amin difunktionalisierten Polyethylenglykol (PEG) (5 kDa oder 20 kDa, 0,1 mol / L) und Rhodamin-Isothiocyanat (RITC, 0,2 mol / L) in 1 mL einer 1: 1 Mischung von Dichlormethan und Dimethylformamid (DMF). </li><li> Hinzufügen 0,2 mol / l N, N - Diisopropylethylamin (DIEA). </li><li> Nach 3 h mit 10-fach Volumen Diethylether durch Vakuumfiltration gefolgt auszufällen. </li><li> Abgeblasen, in DMF und wiederholen follo Etherfällungwed durch Vakuumfiltration. Hinweis: andere Isothiocyanat modifizierten Moleküle (zB Fluoresceinisothiocyanat, FITC) an PEG oder einem anderen Amin modifizierten Polymere unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens angebracht werden. </li></ol></li><li> Herstellung von pegyliertem-DNA (PEG-DNA) <ol><li> Kombinieren von 100 &amp; mgr; l Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) -Lösung (0,5 M, pH 7,0) mit 44,9 &amp; mgr; l 5&#39;-Thiol-modifizierte DNA (1 mg / 10 &amp; mgr; l in 0,1 M NaCl) und in den 4,855 ml entionisiertes Wasser. </li><li> Rühre 1 Stunde. </li><li> Man löst 500 mg Methoxypolyethylenglykol Maleimid in 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li><li> Kombinieren Sie DNA und PEG-Lösungen (10 ml gesamt) und rühre 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (SWNT) Suspensions <ol><li> Wäsche von SWNTs Katalysator und Verunreinigungen zu entfernen. <ol><li> In 200-300 mg ungewaschener SWNTs in eine Plastikzentrifugenröhrchen containing 45 ml entionisiertem Wasser. </li><li> Vortex die Lösung für 2 min und beschallen ein Ultraschallbad für 5 Minuten verwendet wird. Beachten Sie, dass Beschallungsgerät Einstellungen von Instrument zu Instrument variieren, so überprüfen Sie, dass die optische Dichte der SWNT - Lösung erhöht (dh schwarz wird ) , um sicherzustellen , dass die SWNT verteilt werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Lösung für 20 min bei 16.100 xg und Überstand verwerfen. </li><li> In etwa 45 ml frischem entionisiertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.4 bis zu 8-mal. </li><li> Entfernen Sie so viel Wasser wie möglich darauf achten, nicht pelletierten SWNTs zu stören und SWNT-Pellet an der Luft trocknen lassen. </li></ol></li><li> Nukleinsäure-Suspensionen von SWNT <ol><li> Auflösen Nukleinsäuren (NA) in 0,1 M NaCl zu einer Konzentration von 100 mg / mL. </li><li> Sie statische Elektrizität von Einweg-Spatel, Mikrozentrifugenröhrchen und SWNT Lager eine antistatische Pistole. In einem Abzug, fügen Sie 20 ul der NA-Lösung auf 980 &amp; mgr; l von 00,1 M NaCl durch Zugabe von 1 mg SWNTs gefolgt. </li><li> Verwendung eines Ultraschallgerät mit 3 mm Durchmesser Spitze beschallen die Lösung für 10 min bei 40% Amplitude in einem Eisbad. </li><li> Zentrifugieren Sie die DNA-SWNT Lösung ZWEIMAL 90 min bei 16.100 x g. Bei der Verwendung von PEG-DNA, zu reinigen überschüssiges und nicht umgesetzte DNA und PEG mit einem 100 kDa Spin-Filter. Fügen Sie genug PBS den Spin-Filter und Spin bei 9.300 × g für 1,5 Minuten zu füllen, wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal. </li><li> Sammeln Sie und halten Sie den Überstand, wobei darauf geachtet, nicht das Pellet zu stören enthält CNT Bündel und Aggregate. Entsorgen Sie das Pellet in Einklang mit den institutionellen Sondermüll geeigneten Verfahren für Nanomaterialien. </li><li> mit ε = 0,036 L / cm · mg entsprechend Lambert-Beer-Gesetz und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor Messen Sie die Lösung Absorption bei 632 nm unter Verwendung eines UV / Vis-Spektralphotometer ungefähre Konzentration von suspendierten einwandigen Nanoröhren zu bestimmen. </li></ol></li><li> Amphiphile PolymersuspensionenSWNT <ol><li> Sie statische Elektrizität von Einweg-Spatel, Mikrozentrifugenröhrchen und SWNT Lager. In einem Abzug werden 5 mg SWNT bis 5 ml 2% SC-Lösung (alternativ kann SDS-Lösung verwendet werden). </li><li> Verwendung eines Ultraschallgerät mit 6 mm Durchmesser Spitze beschallen die Lösung für 1 h bei 40% Amplitude in einem Eisbad. </li><li> Centrifuge Probe bei 150.000 g für 4 h eine Ultrazentrifuge und sorgfältig Überstand zu sammeln. </li><li> Man löst 1 wt% des amphiphilen Polymers (zB RITC-PEG-RITC) in SC-SWNT - Lösung. </li><li> Dialysieren das Polymer-SC-SWNT-Lösung mit einer 3,5 kDa Dialysemembran gegen 1 l deionisiertem Wasser oder Puffer für 5 Tage verwenden. Ändern des Wasser oder Puffer für Stunde und 2 Stunde 4. Eine größere Dialysemembran verwendet werden kann, solange es die Entfernung des oberflächenaktiven Mittels der Wahl erlaubt, aber Beibehaltung sowohl der SWNT und amphiphilen Polymer. </li><li> Messen Sie die Lösung Extinktion bei 632 nm unter Verwendung eines UV / Vis-Spektrophotometer zur Bestimmungungefähre Konzentration von suspendierten einwandigen Nanoröhren mit ε = 0,036 L / cm * mg entsprechend Lambert-Beer-Gesetz und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Oberflächen Immobilisierte SWNT-Sensoren <ol><li> Herstellung von BSA-Biotin und NeutrAvidin Stammlösungen <ol><li> Man löst 10 mg gefriergetrocknet BSA-Biotin in 1 ml entsalztem Wasser eine 10 mg / ml Stammlösung und lagern bei 4 ° C zu machen. </li><li> Man löst 10 mg NeutrAvidin Protein (NAV, deglycosyliert Avidinprotein) in 2 ml entionisiertem Wasser eine 5 mg / ml Stammlösung zu machen. Store Aliquots bei -20 ° C. Aufgetaute Aliquots kann für mehrere Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Bereiten BSA-Biotin beschichtet Mikroskop - Objektträger <ol><li> Reinigen Sie einen Objektträger und 0,17 mm Deckglas (oder gegebenenfalls für das Mikroskopobjektiv) mit entsalztem Wasser, gefolgt von Methanol, Aceton und letzte Spülung von entsalztem Wasser. </li><liErstellen&gt; Kanäle, indem mehrere Stücke doppelseitigen Klebebands etwa 5 mm voneinander entfernt auf dem sauberen Mikroskop-Objektträger. Verschließen Sie die Kanäle, die durch eine lange Deckglas zu nehmen und es auf die Oberseite des doppelseitiges Klebeband drücken. Seien Sie sicher, dass es auf dem Objektträger zentriert ist, so dass die Kanten des Deckglases und Rutsche nicht bündig sind. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l BSA-Biotin-Stammlösung zu 900 &amp; mgr; l 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg / mL. </li><li> Fluss 50 ul der BSA-Biotin-Lösung in den Kanal durch Pipettieren der Lösung in ein Ende und Feuchtigkeitsregulierung entfernt Lösung am anderen ein Gewebe verwendet wird. Inkubieren für 5 Minuten, gefolgt von 3-5 Spülungen mit 50 &amp; mgr; l von 0,1 M NaCl. </li><li> Verdünnen 40 &amp; mgr; l von 5 mg / ml NAV Lager in 960 ul 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 mg / ml. </li><li> Durchfluss 50 ul der NAV-Lösung in den Kanal durch Pipettieren der Lösung in ein Ende und Feuchtigkeitsregulierung entfernt Lösung am anderen ein Gewebe verwendet wird. Inkubieren für 2-5 Minutengefolgt von 3-5 Spülungen mit 50 ul 0,1 M NaCl. </li><li> Verdünnte Stammlösungen von suspendierten SWNTs in Abbildungspuffer zu einer Konzentration von 1-10 mg / L und Strömungs 50 &amp; mgr; l der Lösung in den Kanal und Inkubation für 5 min. </li><li> Spülen Sie vorsichtig überschüssiges SWNTs unter Verwendung von 50 &amp; mgr; l von Abbildungspuffer entfernt. </li></ol></li><li> Herstellung von APTES silanisierte Objektträger HINWEIS: APTES silanisiert Folien ermöglichen eine Möglichkeit, die Oberfläche eines Glassubstrats negativ geladenen DNA-wrapped SWNTs zu immobilisieren. <ol><li> Eine 10% ige Lösung von (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) in Ethanol. </li><li> Mit Kanäle unter Verwendung der in 3.2.2 beschriebenen Schritte, fließen in 100 ul 1x Tris-Puffer. </li><li> Spülen Sie den Kanal mit APTES Lösung und Inkubation für 5 min. Waschen mit 1x Tris-Puffer. </li><li> Verdünnte Stammlösungen von suspendierten DNA-SWNTs in Abbildungspuffer zu einer Konzentration von 1-10 mg / Land Strömungs 50 &amp; mgr; l der Lösung in den Kanal und incubaß für 5 min. </li><li> Spülen Sie vorsichtig überschüssiges SWNTs unter Verwendung von 50 &amp; mgr; l von Abbildungspuffer entfernt. </li></ol></li></ol> 4. Fluoreszenzspektroskopie und Mikroskopie von SWNT-Sensoren <ol><li> nIR Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Führen Sie Abbildung der Oberflächen immobilisiert SWNT mit Laseranregung und ein inverses Mikroskop mit einer InGaAs-Sensor-Array ausgestattet für die Bildgebung. </li><li> Richten Sie den Laserstrahl mit der Hintergrundbeleuchtung Anschluss eines inversen Mikroskops zur Eingabe mit Hilfe von Spiegeln auf verstellbaren kinematischen Halterungen und ein Paar von Pfosten montiert Iris auf den Hafen Höhe. Sicherstellen, dass die Strahlebene ist und gerade durch die Bestätigung, es geht durch beide Iris, wenn zwischen aufeinanderfolgenden Spiegel gestellt und vor dem Eintritt in die Beleuchtungs Port. Falls erforderlich, stellen Sie die Strahlhöhe ein Periskop Montage verwendet wird. Entfernen Sie alle Kurzpasswärmefilter auf der Beleuchtungs Port, der den Strahl dämpfen würde. </li><li> Legen Sie einen geeigneten Filterwürfel in das Mikroskopdas Anregungslicht in das Objektiv zu reflektieren und Emissionslicht zu sammeln. Dieser besteht typischerweise aus einem dichroitischen Langpassfilter mit einer Grenz oberhalb der Anregungswellenlänge (beispielsweise 750 LP) und einer Emissionslangpassfilter (beispielsweise 850 LP) weiter gestreutes Anregungslicht zu minimieren , den Sensor vom Schlagen. Zusätzlich kann das Emissionsfilter gewählt werden, für die Emission von SWNTs einer bestimmten Chiralität selektiv. </li><li> Führen Sie Feineinstellungen für die Strahlausrichtung durch eine entsprechende Ausrichtung Würfel Einsetzen des Objektivs mit zwei versetzten, Mattscheiben, die 1 mm kleine Löcher zu ersetzen. Richten des Strahls auf die Mitte der beiden unteren und oberen Ausrichtschicht Scheiben. </li><li> Bringen Sie ein 2D InGaAs-Sensoranordnung an der Seite Imaging-Port des Mikroskops einen entsprechenden Adapter und ein 0,5-fach-Objektiv, wenn notwendig, die Sensorgröße anzupassen. </li><li> Unter Verwendung eines 100X -Ölimmersionsobjektiv (1,4 NA), gelten fluoreszenzfrei Sionsöl und legen Sie die immobilized SWNT Probe auf den Mikroskoptisch. </li><li> Heben Sie das Ziel, bis das Öl in Kontakt mit der Unterseite des Deckglases (# 1.5, 170 &amp; mgr; m Dicke). Nehmen Sie die Einstellung mit dem Ziel Kragen notwendig , wenn für Abbildungsbedingungen, zB Temperatur, Glasdicke, usw. </li><li> Langsam heben das Ziel mit der Anregungsquelle auf und das Fluoreszenzsignal der InGaAs-Kamera zu überwachen. Die Fluoreszenzintensität sollte schrittweise zu erhöhen, wie die Fokusebene der Oberfläche nähert, und die immobilisierten Sensoren in den Fokus gerückt. </li></ol></li><li> nIR Fluoreszenzspektroskopie HINWEIS: Fluoreszenzspektroskopie kann mit dem gleichen Mikroskopaufbau durchgeführt werden, sondern durch das gesammelte Licht aus dem Mikroskopkörper lenken und in ein Spektrometer und InGaAs Lineararray-Detektor. <ol><li> Mit kinematischen Halterungen und Spiegel für nIR bewertet, lenken das Licht Weg zu den Eintrittsspalt des Spektrometers. Konzentrieren Sie das Licht auf einen poi untennt auf den Eingang einer Fokussierlinse geschlitzt mit (zB plankonvexe, f = 150 mm). Diese Ausrichtung durch Dämpfen der Laserleistung auf &lt;1 mW und Ersetzen des Mikroskopobjektiv mit einem 1 &quot;Spiegel und unter Verwendung eines 50/50 Strahlteilungsfilterwürfel erreicht wird. Das Anregungslicht wird dann den Mikroskopkörper durch die Austrittsöffnung verlassen können und verwendet werden, die Spiegel und die Linse zu fokussieren den Strahl auf den Eintrittsspalt einzustellen. </li><li> das Mikroskopobjektiv und Langpassfilter, legen Sie eine Well-Platte auf die Bühne und notieren Sie die Spektren von einem Scharf Probe unter Verwendung des Spektrometers und InGaAs-Array nach dem Ersetzen. </li></ol></li><li> Die Messung der reversiblen Reaktion von (GT) 15 DNA-SWNT zu Dopamin <ol><li> Berg Sensorkanäle auf den Mikroskoptisch und bringen in den Fokus mit einem 100X Öl-Objektiv und InGaAs-Kamera beschichtet. Zugabe von 50 ul 100 uM Dopamin-Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit dem Strömungskanal und Aufzeichnungsdie Änderung in der Fluoreszenzintensität. </li><li> Waschen Sie die Dopamin Lösung phosphatgepufferte Salzlösung mit und die Veränderung der Fluoreszenz der einzelnen SWNT-Sensoren beobachten. </li></ol></li><li> Well-Platten - Screening für Analyten Antwort von SWNT - Sensoren HINWEIS: Screening von verschiedenen Analyten kann mit einem motorisierten Tisch gesteuert mit Hilfe eines transparenten Well-Platte durchgeführt werden. Eine ideale Well-Platte ist transparent für sichtbares und IR und hat schwarze Seitenwände Übersprechens zwischen den Vertiefungen zu minimieren. <ol><li> Pipette gleichen Volumina von suspendierten SWNT - Sensor (zB 5 mg / l Konzentration) in jede Vertiefung, genug , um den Boden des Bohrlochs gleichmäßig abzudecken, in der Regel&gt; 100 &amp; mgr; l für eine 96-Well - Platte und&gt; 30 &amp; mgr; l für eine 384-Well - Platte . </li><li> Pipette Analyten ( zum Beispiel 2 &amp; mgr; l, 100 &amp; mgr; M Endvolumen) vom Screening - Bibliothek in die Well - Platten. Bereiten Sie jeden Analyten in dreifacher Ausfertigung für potenzielle Rechnung zu tragen und zu gut Variation, fluctuatIonen der Anregungsintensität oder der Temperatur. </li><li> Heben Sie das Ziel (zB 20X Achroplan, 0,45 NA) , während die Emissionsspektren Überwachung des Spektrometers und InGaAs - Array verwendet wird . Optimale Position des Ziels wird der Brennebene etwa in der Mitte des Probenvolumens in dem Bohrloch gesetzt, die zu einem Maximum der gemessenen Intensität entsprechen. </li><li> Für jede Probe gut, notieren Belichtung eines 1-10 s ein Spektrum zu sammeln. </li><li> Vergleichen Sie die Emissionsspektren für jede Vertiefung zu einem Steuerelement enthält nur SWNT ohne zusätzliche Analyt die Fluoreszenzantwort zu quantifizieren. </li></ol></li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Immobilized+Protein+A+Binding+to+Immunoglobulin+G+on+Nanosensor+Array+Surfaces.">Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces.</a> Anal Chem. 87 (16), 8186-8193 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+recognition+using+corona+phase+complexes+made+of+synthetic+polymers+adsorbed+on+carbon+nanotubes.">Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes.</a> Nat nanotechnol. 8 (12), 959-968 (2013).</li><li>Kruss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+detection+using+corona+phase+molecular+recognition+on+fluorescent+single-walled+carbon+nanotube+sensors.">Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors.</a> J Am Chem Soc. 136 (2), 713-724 (2014).</li><li>Salem, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chirality+dependent+corona+phase+molecular+recognition+of+DNA-wrapped+carbon+nanotubes.">Chirality dependent corona phase molecular recognition of DNA-wrapped carbon nanotubes.</a> Carbon. 97, 147-153 (2016).</li><li>Giraldo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ratiometric+Sensor+Using+Single+Chirality+Near-Infrared+Fluorescent+Carbon+Nanotubes:+Application+to+In+Vivo+Monitoring.">A Ratiometric Sensor Using Single Chirality Near-Infrared Fluorescent Carbon Nanotubes: Application to In Vivo Monitoring.</a> Small. 11 (32), 3973-3984 (2015).</li><li>Karousis, N., Tagmatarchis, N., Tasis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Progress+on+the+Chemical+Modification+of+Carbon+Nanotubes.">Current Progress on the Chemical Modification of Carbon Nanotubes.</a> Chem Rev. 110 (9), 5366-5397 (2010).</li><li>Movia, D., Del Canto, E., Giordani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+and+Oxidized+Single-Walled+Carbon+Nanotubes+as+Robust+Near-IR+Fluorescent+Probes+for+Molecular+Imaging.">Purified and Oxidized Single-Walled Carbon Nanotubes as Robust Near-IR Fluorescent Probes for Molecular Imaging.</a> J Phys Chem C. 114 (43), 18407-18413 (2010).</li><li>Cognet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+quenching+of+exciton+fluorescence+in+carbon+nanotubes+by+single-molecule+reactions.">Stepwise quenching of exciton fluorescence in carbon nanotubes by single-molecule reactions.</a> Science. 316 (5830), 1465-1468 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

SWNTs werden in wässriger Lösung durch direkte Beschallung mit SDS oder ssDNA leicht suspendiert, wie durch eine Zunahme der optischen Dichte durch die kolloidale Dispersion des resultierenden SWNT-Polymer-Hybrid vorgesehen angegeben. SDS und ssDNA streut und solubilisiert Bündel von einwandigen Nanoröhren durch durch hydrophobe oder pi-pi-Wechselwirkungen auf die SWNT Oberfläche zu adsorbieren. Zusätzlich können andere Polymere, wie genomische DNA, amphiphile Polymere, konjugierte Polymere und Lipiden, auf die O...

Einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (SWNT) sind atomar dünne Schichten aus Kohlenstoffatomen rollten in lange, dünne Zylinder, die einzigartige elektronische und optische Eigenschaften aufweisen. 1 Derartige Eigenschaften umfassen eine Bandlücken Herstellung nahen Infrarot (NIR) Fluoreszenzemission über Exziton Rekombination , die sehr empfindlich gegenüber ihrer lokalen Umgebung ist. NIR- Emission von SWNTs fällt in den nahen Infrarot-Fenster, in dem die Eindringtiefe des Lichts für biologisches Gewebe maximal ist. 2,3 Zusätzlich zeigen SWNT einige einzigartige Eigenschaften atypisch im Gegensatz zu organischen Fluorophore: SWNT weisen eine große Stokes - Verschiebung, nicht photobleach, und nicht blinken. 4 In jüngster diese Eigenschaften ausnutzt , hat zur Entwicklung einer Zusammenstellung der neuen molekularen Sensoren mit Anwendungen in der Biologie geführt. 5,6 Unveränderte sind jedoch SWNTs in Wasser unlöslich und Suspensionen einzelner SWNT zu erhalten , kann eine Herausforderung sein. 7,8 Bundling und Aggregation von einwandigen Nanoröhren in Lösung können ihre Bandlückenfluoreszenz, 2 macht sie ungeeignet für Sensoranwendungen zu verschleiern. Dispergier- einzelnen Kohlenstoff-Nanoröhren in wässriger Lösung erfordert ihre oberflächenmodifizierenden Hydrophobizität getriebenen Aggregation zu verhindern. 9 Während Modifikation kovalente kann SWNT wasserlöslich machen, 10 sowie vermitteln spezifische Bindungschemie, Defektstellen im SWNT Gitter reduzieren oder ihre Fluoreszenzemission abklingen. 13 , die durch hydrophobe und pi-pi Stapel - Wechselwirkungen an die Nanoröhrenoberfläche adsorbieren - Stattdessen kann SWNT Funktionalisierung unter Verwendung von Tensiden, Lipiden, Polymeren und DNA 9,11 erreicht werden. Die sich ergebende chemische Umgebung umgebende Oberfläche funktionalisierte SWNTs wird als seine corona Phase. Störeinflüsse auf die Corona-Phase kann einen großen Einfluss auf Exzitonen haben auf der Oberfläche von Nanoröhren reisen, Modulationen verursacht fluor zu SWNTescence Emission. Es ist dieses empfindliche Beziehung zwischen der Koronaphase und SWNT Fluoreszenz, die durch den Einbau von spezifischen Bindungsmodalitäten auf die große Oberfläche von SWNT neuen molekularen Sensoren zu entwickeln, ausgenutzt werden kann. Störeinflüsse auf die SWNT Corona Phase bei Analyt-Bindung kann in der lokalen dielektrischen Umgebung zu Veränderungen führen, Ladungstransfer oder Gitterfehler einführen, die alle die Fluoreszenzemission der SWNTs modulieren kann als Signalübertragungsmechanismus zu dienen. 14 Dieser Ansatz in der Entwicklung neuer Fluoreszenzsensoren für den Nachweis von vielen verschiedenen Klassen von Molekülen , einschließlich DNA, 15,16 Glucose 17 und kleine Moleküle, wie ATP, 18 reaktive Sauerstoffspezies 19 und Stickstoffmonoxid verwendet wird. 20,21 Jedoch sind diese Ansätze beschränkt, daß sie sich auf die Existenz eines bekannten Bindungs Modalität für die Zielanalyten verlassen. Vor kurzem wurde eine allgemeinere AppRotauge Fluoreszenzsensoren zur Gestaltung wurde SWNTs nicht-kovalent funktionalisiert mit amphiphilen Hetero, Phospholipide und Polynucleinsäuren entwickelt wurden. Diese Moleküle adsorbieren an Kohlenstoff - Nanoröhrchen - Oberflächen zu produzieren hochstabile Suspensionen einzelner SWNT 22-25 mit einzigartigen Corona - Phasen , die spezifisch Proteine 26,27 oder kleine Moleküle einschließlich des Neurotransmitters Dopamin binden kann. 28-30 Engineering the Corona Phase SWNTs und spezifisch binden Zielanalyten zu dispergieren , wird als Corona - Phase molekulare Erkennung (CoPhMoRe) bezeichnet. 28 Die kleine Größe, geringe Toxizität, hohe Stabilität und unbleaching nIR Fluoreszenz von CoPhMoRe SWNT - Sensoren machen sie zu ausgezeichneten Kandidaten für die in vivo Mess für längere zeitaufgelöste Messungen. 6 Neuere Arbeiten zur optischen Detektion von reaktivem Stickstoff und Sauerstoff - Spezies ihre Anwendungen in Pflanzengewebe gezeigt. 31Eine besonders spannende Anwendung für CoPhMoRe SWNT - Sensoren ist das Potenzial für markierungsfreie Detektion von Neurotransmittern wie Dopamin in vivo, wo andere Techniken, wie elektrochemische Mess oder Immunhistochemie, leiden an einem Mangel an räumlicher Auflösung, zeitliche Auflösung und Spezifität. Die Projektierung und die Entdeckung CoPhMoRe SWNT-Sensoren hat bisher von der Größe und chemische Vielfalt der Dispersions Bibliothek zurückgehalten worden, um die Wahrscheinlichkeit zu begrenzen eines Sensors für ein bestimmtes Ziel zu finden. Bisher haben Forscher verkratzt nur die Oberfläche der verfügbaren konjugierten, co-block, biologische und biomimetische Polymere, die als funktionell aktives Dispergiermittel für SWNT-Sensoren dienen. Hier stellen wir verschiedene Methoden für beide SWNT Dispergieren und ihre Fluoreszenz für Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung für einzelne SWNT-Sensor-Analyse. Insbesondere beschreiben wir das Verfahren zur Beschichtung von SWNT mit Polynukleinsäure oligomers durch direkte Beschallung sowie wie SWNT mit amphiphilen Polymeren durch Tensid Austausch durch Dialyse zu funktionalisieren. Wir verwenden (GT) 15 -DNA und Polyethylenglykol funktionalisiert mit Rhodaminisothiocyanat (RITC-PEG-RITC) als Beispiele. Wir veranschaulichen die Verwendung von (GT) 15 -DNA SWNTs als CoPhMoRe Sensor für den Nachweis von Dopamin. Schließlich beschreiben wir Verfahren zur Einzelmolekül-Sensormessungen durchführt, die für die Charakterisierung oder Einzelmolekülmessung verwendet werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cholate hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris base (Trizma base)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine-PEG-amine,NH2-PEG-NH2</td>
			<td>Nanocs Inc</td>
			<td>PG2-AM-5k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine B isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>283924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>676853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylformamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-diisopropylethylamine&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D125806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>673811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4706&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217;-thiol-modified DNA&#160;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methoxypolyethylene glycol maleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100k Da spin filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPCO Super purified single walled carbon nanotubes</td>
			<td>Integris</td>
			<td>HiPco SuperPurified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti static gun</td>
			<td>Milty</td>
			<td>Milty Zerostat 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra sonicator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>CV18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin protein</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer.Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kinematic mirrors</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>KM200-E03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>periscope</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RS99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Immersol 518f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Plan-apochromat 100X oil, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass</td>
			<td>Healthrow Scientific</td>
			<td>HS159879H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dopamine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared 2d array camera</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td>NIRvana</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infrared 1d sensor array</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td>PyLoN IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nIR spectrograph</td>
			<td>Princeton Instruments</td>
			<td>SCT-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>planoconvex lens</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>LA1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wellplates (glass bottom)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4580</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering molecular recognition with bio-mimetic polymers on single walled carbon nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

SWNTs wurden in wässriger Lösung mit beiden Tensiden und amphiphile Polymere, die durch direkte Beschallung und durch Dialyse Börse ausgesetzt. Abbildung 1 zeigt SWNTs, gezüchtet , um die Eisencarbonyl katalysierten Verfahren (HiPCO) verwenden, suspendiert SC verwenden, RITC-PEF20-RITC und (GT) 15 -DNA. Die optische Dichte eines SWNTs mit SDS (oder Polymer) erhöht drastisch nach der Beschallung und nimmt bei Entfernung von Aggregaten und Verunreinigungen ...

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Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K Aufrufe.  University of California Berkeley. We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Serie: Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Forschung

Biotechnik

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very promising application for molecular sensors, field effect transistor and super thin and flexible electronic devices1-4. Anodic arc discharge supported by the erosion of the anode material is one of the most practical and efficient methods, which can provide specific non-equilibrium processes and a high influx of carbon material to the developing structures at relatively higher temperature, and consequently the as-synthesized products have few structural defects and better crystallinity.
 To further improve the controllability and flexibility of the synthesis of carbon nanostructures in arc discharge, magnetic fields can be applied during the synthesis process according to the strong magnetic responses of arc plasmas. It was demonstrated that the magnetically-enhanced arc discharge can increase the average length of SWCNT 5, narrow the diameter distribution of metallic catalyst particles and carbon nanotubes 6, and change the ratio of metallic and semiconducting carbon nanotubes 7, as well as lead to graphene synthesis 8. 
 Furthermore, it is worthwhile to remark that when we introduce a non-uniform magnetic field with the component normal to the current in arc, the Lorentz force along the J&times;B direction can generate the plasmas jet and make effective delivery of carbon ion particles and heat flux to samples. As a result, large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes were simultaneously generated by such new magnetically-enhanced anodic arc method. Arc imaging, scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM) and Raman spectroscopy were employed to analyze the characterization of carbon nanostructures. These findings indicate a wide spectrum of opportunities to manipulate with the properties of nanostructures produced in plasmas by means of controlling the arc conditions.

Anodic arc discharge is one of the most practical and efficient methods to synthesize various carbon nanostructures. To increase the arc controllability and flexibility, a non-uniform magnetic field was introduced to process the one-step synthesis of large-scale graphene flakes and high-purity single-walled carbon nanotubes.

Simultane Synthese von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Graphen in einem magnetisch-enhanced Arc Plasma

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engineering adhärenten Bakterien durch Schaffung eines einheitlichen Synthetic Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...