Zytogenetik ist die Untersuchung der Struktur und Eigenschaften von Chromosomen, sowie ihr Verhalten während der Zellteilung und ihre Rolle bei der Vererbung. Ein Chromosom, das ein Molekül der DNA und seiner damit verbundenen Proteine ist, kann unter dem Mikroskop mit Hilfe von Farbstoffen und Sonden beobachtet werden. Solche Beobachtungen sind ein leistungsfähiger Ansatz zur Erkennung von Defekten in Chromosomenstruktur und Anzahl, die häufig mit Krankheiten und Störungen verbunden sind.
Dieses Video wird die Grundsätzen der Zytogenetik, ein Protokoll für eine weit verbreitete Technik, um bestimmten Chromosom Funktionen, bekannt als Fluoreszenz in Situ Hybridisierung und einige Anwendungen dieser Technik abdecken.
Beginnen wir mit der Erörterung der Bedeutung der Zytogenetik und die Prinzipien hinter einige klassischen und modernen Techniken im Bereich.
Zytogenetik beinhaltet die direkte Beobachtung von einer Zelle Chromosomenstruktur und Anzahl, bekannt als die "Karyotyp." Es kann verwendet werden, um Abweichungen von der normalen diploiden oder gepaart, Chromosomenzahl, erkennen die Aneuploidie sowie Mängel in Chromosomenstruktur bezeichnet wird.
Viele Krankheiten und Störungen resultieren aus Chromosomenanomalien. Beispielsweise ist das Philadelphia-Chromosom, die sich aus eine reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 teilen, verbunden mit chronisch myeloischer Leukämie. Ein weiteres Beispiel ist die Trisomie 21, die häufigste Ursache des Down-Syndroms, in denen eine zusätzliche Kopie des Chromosoms 21 vererbt wird.
Karyotypisierung erfolgt in der Regel auf Zellen, die zu teilen, wenn ihre Chromosomen zusammengefasst sind und können leicht unterschieden werden, vorbereiten.
Chromosomen in einem Karyotyp können mit Flecken behandelt werden, die markante Streifenbildung Mustern zu offenbaren. Gefärbte Chromosomen können dann durch Größe und Form für Karyotyp Analyse angeordnet sein. Einige Farbstoffe können angewendet werden, um chromosomale Besonderheiten hervorzuheben. Färbung mit Giemsa oder G-banding, markiert dicht gepackte, in der Regel gen armen Regionen reich an Basen A-T. R-banding ist ein umgekehrter Giemsa Fleck, der reich an G-C Basen chromosomale Regionen hervorhebt. C-banding, unterstreicht die dichtesten chromosomalen Regionen rund um das Zentromer, die Struktur verbindet die identischen Hälften eines duplizierten Chromosoms, während T-banding die Enden der Chromosomen oder Telomere unterstreicht.
Eine andere Technik, Fluoreszenz in Situ Hybridisierung oder Fisch, genannt erlaubt Erkennung von bestimmten Chromosomen, Regionen von DNA oder RNA Transkripte. Dies geschieht durch Inkubation eine Probe mit hochspezifischen Oligonukleotid Sonden, die Eindringmittel gekennzeichnet sind. Da diese Sonden, uncondensed Chromosomen in nicht-teilenden Zellen hybridisiert werden können, kann Fisch im weiteren Sinne als klassische Karyotypisierung Methoden angewendet werden.
Schließlich haben die Forscher auch eine Methode namens vergleichende genomische Hybridisierung zum Bildschirm für fehlende oder doppelte chromosomale Regionen entwickelt. Genomischer DNA aus einem Prüf-, Steuer- und Thema sind isoliert, fragmentiert und mit verschiedenen farbigen Fluorophore beschriftet. Die fragmentierten genomischen Vorbereitungen dann gemischt und wettbewerbsfähigen hybridisiert mit einer normalen Chromosom zu verbreiten. Farben auf den daraus resultierenden Karyotyp zeigen ob eine Region in die zu untersuchende Probe, dupliziert wird, erzeugt mehr Fragmente um die Ausbreitung zu binden, oder wenn die Region gelöscht wird, was zu bevorzugten Bindung an die häufiger Kontrolle Fragmente.
Nun, Sie die Prinzipien der Zytogenetik verstehen, lasst uns in die Praxis umzusetzen und einen genaueren Blick auf wie Fische durchgeführt wird.
Erste, isolierte Gewebe oder Zellen werden mit einem Fixativ wie Paraformaldehyd, Chromosom Morphologie und Integrität zu bewahren behandelt. Anschließend wird ein Chromosom Ausbreitung ist bereit, zum Beispiel durch das Material mechanisch zu stören. Die Chromosomen sind dann dehydriert in einer Lösung Reihe von steigenden Ethanol-Konzentrationen und permeabilized in einer Lösung von Pepsin Zielsequenzen, die Sonden zugänglich zu machen. Chromosomen sind dann gewaschen und mit einem Postfix stabilisiert, denaturiert mit Formamid, so dass die jetzt einzelsträngige DNA Sonden binden kann und dehydriert in einer zweiten Reihe von zunehmend konzentrierte Ethanol Lösungen.
Eindringmittel beschriftet, sehr spezifische DNA-Sonden sind vorbereitet und gemischt mit unbeschrifteten repetitive DNA-Fragmente, unspezifischen Bindung zu blockieren. Die Sonde wird dann angewendet, um die Chromosomen verteilt, wo es an die Zielsequenz hybridisiert und ungebundenen Sonde wird mit einer Reihe von Wäschen entfernt.
Schließlich werden die Chromosomen in einem Medium montiert, die die Probe und enthält eine allgemeine DNA Gegenfärbung, z. B. DAPI Etiketten Hintergrund genomischen DNA, sodass ein Deckglas wird angewendet. An dieser Stelle können die Proben unter einem Fluoreszenz-Mikroskop mit beobachtet werden, der entsprechende Filter-Sets, um genomische DNA und Sequenz-spezifischen Funktionen zu visualisieren.
Nach der Besichtigung wie Fische durchgeführt wird, schauen wir uns einige Anwendungen dieser leistungsstarke Technik.
Fisch kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass ein Embryo Karyotyp normal vor der Implantation. Hier war eine einzelne Zelle, bekannt als eine Blastomere biopsiert aus einem Embryo drei Tage nach der Befruchtung, dann lysiert und direkt auf einen Objektträger fixiert. Die Chromosom-Verbreitung wurde dann, Sonden, die speziell ausgewählt, um mögliche Chromosomenstörungen identifizieren hybridisiert. In diesem Fall zeigen Abweichungen von der erwarteten Muster der Hybridisierung Signale Störungen Chromosomenzahl oder Struktur.
Innovative Techniken sind auch entwickelt worden, um alle Chromosomen aus einer einzigen biologischen Probe zu kennzeichnen. Eine solche Methode beinhaltet das Octochrome Gerät, ein acht-celled Objektträger mit fluoreszierenden Sonden vorinstalliert. Alle 22-Sex bestimmende Chromosomen, genannt Autosomen und zwei Geschlechtschromosomen wurden durch deren Verteilung unter den acht Fenstern, jeweils drei Chromosom-spezifische Fluorophore beschriftet. Dies ermöglichte gleichzeitige Vorführung alle Chromosomen von einer einzigen Hybridisierung.
Schließlich anstatt die Sonden in verschiedenen Fenstern auf einer Folie zu trennen, alle Chromosomen können beschriftet werden und dann zusammen mit einen Ansatz namens spektrale Karyotypisierung oder SKY nachgewiesen. Zu jedem Chromosom geben jeweils eine einzigartige spektrale Farbe wurden mehrere Chromosom-spezifischen Sonden mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen hybridisiert. Gleichzeitigen Beobachtungen der kombinierten Chromosomen Mischung sind besonders nützlich für die Ermittlung der Karyotyp Mängel und können verwendet werden, um die Aneuploidie und chromosomalen Deletionen sowie Translokationen identifiziert.
Sie habe nur Jupiters Video-on-Zytogenetik beobachtet. In diesem Video haben Sie gelernt, über die Grundsätze der Zytogenetik, Techniken wie Karyotypisierung und Fische, die verwendet werden, um bestimmte Chromosomen Merkmale hervorheben und Anwendungen dieser Techniken. Jüngste Fortschritte in der Zytogenetik haben ihre Fähigkeiten in Forschung und Pathologie Labors gleichermaßen erhöht, und sie werden weiterhin weit verbreiteten Einsatz an der Spitze der Krankheitsforschung und Diagnostik zu finden. Danke fürs Zuschauen!
