RNA-Sequenzierung oder RNA-Seq, ist eine Technik, die Informationen über die Abfolge und Menge jeder RNA ausgedrückte, bekannte als das "Transkriptom," kann in einer Zellpopulation. Im Gegensatz zu anderen Expressions-profiling-Methoden wie Microarrays, die Sondierung für bekannte RNA-Sequenzen beinhalten, kann RNA-Seq Genexpression von Organismen mit UN-sequenzierten Genome Profil erstellen. Darüber hinaus kann RNA-Seq eine größere Reichweite der Niederschrift Ausdruck Ebenen als Microarrays, vor allem bei sehr niedrigen oder sehr hohen Ebenen genau messen.
Dieses Video wird die Grundsätzen der RNA-Seq, ein Protokoll für die Vorbereitung einer RNA-Seq-Bibliothek und Analyse der Daten und einige Anwendungen dieser Technik abdecken.
Zunächst betrachten wir einige Prinzipien hinter RNA-FF Transkriptom Sequenzierung erfordert Isolierung eine Bevölkerung von Abschriften, deren Ebenen gemessen werden sollen. Die meisten RNA in den Zellen ist ribosomaler RNA oder rRNA, zentraler Bestandteil der Zelle Protein-Produktionsmaschinen. Um Verwertung von anderen Arten von Protokollen, rRNA zu erleichtern ist in der Regel entfernt vor der Sequenzierung durch Hybridisierung die Probe zu komplementären Oligonukleotiden an magnetischen Perlen und mit Hilfe eines Magneten, um der rRNA vom Rest der Probe zu trennen.
Alternativ kann eine bestimmte Bevölkerung von RNA für die Sequenzierung ausgewählt werden. Z. B. Protein-kodierenden Messenger-RNAs oder mRNAs, erfasst werden kann, mit "Oligo-dT" – kurze Strecken von Deoxy-T Nukleotiden, die Bindung an die Reihenfolge der Grundlagen als ein Poly-A-Rute am Ende diese Abschriften bekannt. Die kontaminierenden rRNA wird dann entfernt. Micro-RNAs, die 22-Nukleotid regulatorischen RNAs sind, können gezielt für die Sequenzierung basierend auf deren Größe isoliert werden. Da RNA Abbau von Natur aus anfällig ist, ist es erste umgekehrte transkribierten, doppelsträngige DNA.
Oligonukleotid-Sequenzen bekannt als Adapter sind dann auf die DNA-Fragmente ligiert. Die Adapter enthalten konstanten Regionen, die als Grundierung-Bindungsstellen für anschließende PCR Verstärkung dienen, und diese sind in der Regel asymmetrisch, so dass die "Strandedness" der Vorlage erhalten bleibt. Die Adapter enthalten auch einzigartige Sequenzen, bekannt als "Barcodes", die alle Fragmente aus einer einzigen Probe zu identifizieren. Die Bibliothek wird dann mittels PCR verstärkt.
Ein Sequenzierung Chip, auf dem es Oligonukleotide komplementär zu den Adaptern gibt, wird verwendet, um die Bibliothek Probe zu immobilisieren, verdünnt wird, so dass die DNA-Moleküle auf dem Chip bei geringer Dichte Tempern. Die DNA wird verstärkt auf dem Chip über einen Prozess namens "Brücke Verstärkung" in Form "klonale Cluster." Kurze Abschnitte, jeder 30-150 Basen in der Länge, werden dann von einem oder beiden Enden dieser DNA-Vorlagen, Generierung von Hunderten von Millionen von Produkten bekannt als Sequenzierung liest synthetisiert.
Die Sequenzierung Ergebnisse werden dann für Qualität analysiert und die Daten werden verarbeitet. Analyse der Sequenzen kann eine Vielzahl von Informationen, einschließlich Unterschiede im Ausdruck RNAs zwischen Proben und bisher unbekannte Abschriften oder Formen der Transkripte zeigen.
Nun, da wir die Funktionsweise von RNA-Seq gesehen haben, gehen Sie wir durch ein Protokoll für die Vorbereitung einer RNA-Seq-Bibliothek und analysieren die Sequenzdaten. RNA ergibt sich zunächst aus der Stichprobe von Interesse, und seine Qualität wird durch Elektrophorese, zum Beispiel durch mit einem Mikrofluidik-Gerät namens einem Bioanalyzer überprüft. Die RNA muss von hoher Qualität für genaue Sequenzierung Ergebnisse sein. Um das Fehlen von DNA-Kontaminationen zu gewährleisten, wird die RT-PCR für eine ausdrückliche gen mit oder ohne Reverse Transkriptase durchgeführt. Es darf keine Produkte in der Abwesenheit der reversen Transkriptase.
Um Poly-A-RNA zu wählen, sind die Proben an Oligo-dT Sonden mit magnetischen Beads verbunden gebunden. Die ausgewählten RNA ist 200-Nukleotid-Stücke bei hoher Temperatur in Anwesenheit von Magnesium-Ionen, fragmentiert, Verringerung der Länge-abhängige Verzerrungen in nachfolgenden Reaktionen und Analysen. Die Fragmente werden dann in doppelsträngige DNA umgewandelt, und Adapter ligiert. Die Bibliothek wird durch PCR verstärkt und seine Qualität überprüft auf einem Bioanalyzer und qPCR durchführen. Die Bioanalyzer Ergebnisse sollten einen Spitzenwert von Produkten in der Größe erwartet basierend auf den durchschnittlichen Fragmentgröße und Länge von den Adaptern zeigen.
Bibliotheken aus verschiedenen Proben, die verschiedenen Barcode-Adapter, können zusammen mit einer Stichprobe von Referenz DNA hinzugefügt in geringer Konzentration als eine Qualitätskontrolle für die nachfolgenden Schritte des Prozesses, z. B. klonalen Cluster-Generation und die Sequenzierung Reaktionen gemischt werden. Die Mischung wird hinzugefügt, um eine Sequenzierung-Chip und in die Maschine geladen.
Während der Sequenzierung Reaktion wird die Dichte der DNA Cluster überwacht: Es darf nicht zu hoch, zu Cross-Kontamination oder zu niedrig ist, führen kann keine ausreichenden Daten führen kann. Die Qualität der Sequenzierung erhält von der Q-Score zeigt die Wahrscheinlichkeit, dass eine falsche Basis ermittelt. Die Q-Werte für die meisten Basen sollte größer sein als 30, für eine falsche Lektüre einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 1 von 1000 entspricht. Erholung von der Referenz-DNA-Sequenzen mit der erwarteten Rate gibt an, dass alle Bibliothek Sequenzen gleichmäßig vertreten sind.
Generiert durch Sequenzierung liest dann überlappen miteinander um die RNA ableiten, die sequenziert wurde. Für Organismen mit Genominformationen zur Verfügung können mal gelesen das Referenz-Genom ausgerichtet werden. Gezählt wird die Anzahl der Lesevorgänge pro Protokoll um die Fülle der einzelnen RNA zu messen.
Nach der Besichtigung wie RNA-Seq funktioniert, schauen wir uns einige Möglichkeiten, wie, die Sie verwendet wird.
Transkriptom Sequenzierung kann Gene identifizieren, die unter verschiedenen Bedingungen differentiell exprimiert werden. Beispielsweise wurden in diesem Experiment Transkriptom von Stechmückenlarven produziert unter verschiedenen Wachstumsbedingungen verglichen. Obwohl diese besondere Art der Krankheit-tragen Mücke keinen sequenzierten Genoms, konnten Forscher vergleichen Sie die erhaltenen Transkriptom-Informationen auf andere sequenzierten Spezies, und Gene zu identifizieren, mit einem erhöhten oder verringerten Ausdruck.
RNA-Seq kann auch verwendet werden, in "massiv parallelen Reporter Assays" gen Regulationsmechanismen zu studieren. Dies geschieht durch transfecting Säugetier-Zellen mit einer Bibliothek mit Tausenden von Plasmiden, jeweils eine mutierte Variante einer gen regulatorischen Website "fahren" die Transkription einer Reporter-Sequenz, die gekoppelt ist mit einzigartigen Tags. Nach RNA Isolation und Hochdurchsatz-Sequenzierung sind die Ebenen der einzelnen Tags bewertet, um Reporter Ausdruck von jedem Konstrukt zu bewerten, welche gibt Einblick in die funktionale Bedeutung der Nukleotide in jeder rechtlichen Seite Variante mutiert.
Zu guter Letzt kann RNA Sequenzierung zu studieren RNA-Protein-Wechselwirkungen, insbesondere, um Protokolle zu identifizieren, denen ein Protein des Interesses an bindet angepasst werden. Das Protein ist Immunoprecipitated mit Antikörpern und der gebundenen RNAs sind definiert durch Sequenzierung. Wenn die RNA-Protein-komplexe vernetzt zu Beginn, kann Sequenzierung Analyse Karte die Website die Crosslink und identifizieren die Protein-Bindungsstelle auf der RNA auf das Nukleotid-Niveau.
Sie haben nur Jupiters Video auf RNA-f angesehen. In diesem Video haben wir gesehen, wie RNA-Proben in Bibliotheken, sequenziert, sowie die daraus resultierenden Daten analysiert und die Arten von Informationen, die Sequenzierung Analyse kann umgewandelt werden. Dank seiner Sensitivität potenziell verwendet werden, in jedem Organismus und verringerte Kosten für die Sequenzierung, RNA-Seq zunehmend in vielen Bereichen der Genetikforschung verwendet wird, und bieten einen Einblick in viele Fragen rund um Zell-Funktion und Entwicklung. Danke fürs Zuschauen!
