Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (SNF; #320030_156019). Die Autoren erhielten nichtfinanzielle Unterstützung von Heidelberg Engineering GmBH, Deutschland.

in allen Verfahren waren BALB/c Erwachsene männliche und weibliche Mäusen, die Gfp unter den Promotor des Cx3cr1 Ausdrücken verwendeten 24. Mäuse wurden nach der ARVO-Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research behandelt und alle Verfahren wurden von der Schweizer Regierung nach den Eidgenössischen Schweizer Vorschriften über Tierschutz genehmigt. Mäuse wurden durch eine subkutane Injektion von Medetomidine Hydrochlorid (0,75 mg/kg) und Ketamin (45 mg/kg) betäubt. Ordnungsgemäße Betäubung wurde bestätigt durch die Überwachung der Atemfrequenz und dem Tier &#39; s Reflex gegen eine Prise Schweif. Am Ende der Versuche wurden Mäuse mit CO 2 Inhalation eingeschläfert.
 Hinweis: ausführen jedes bildgebende Sitzung so schnell wie möglich (max. 20 min), seit Kataraktentstehung kann folgende Anästhesie retinalen Visualisierung 30 behindern.
 1. Systemkonfiguration <ol><li>den Computer einschalten.</li>
	<li>Schalten Sie die Stromversorgung. Die Nachricht &#34; Erwerb Modul Start &#34; erscheint auf dem Bildschirm des Geräts Control Panel.</li>
	<li>Klicken Sie doppelt auf das Software desktop-Verknüpfung zum Betrieb der Software.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Datenbank-View, die &#34; Patienten hinzufügen &#34; Symbol.</li>
	<li>Im Popup-Fenster, fügen Sie alle notwendigen Informationen (name, Vorname, Titel, Geburtsdatum, Geschlecht und Patienten-ID) und klicken Sie auf &#34; ok &#34;. Das Pop-Fenster der Hornhautkrümmung auf 2 mm festgelegt und klicken Sie auf &#34; ok &#34;.</li>
	<li>Eine 78D standard ophthalmologischen berührungslose Schlitz Lampe Objektiv vor die standard 30 °-Optik zu positionieren und befestigen Sie ihn sicher mit Klebeband.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Filter-Hebel auf der linken Seite des Gerätes über die Angabe positioniert ist &#34; A &#34; erlauben IR + OCT und AF imaging ( Abbildung 1).</li>
</ol> 2. Maus-Vorbereitung <ol><li>Verwendung eine Medetomidine Hydrochlorid Dosis von 0,75 mg/kg und ein Ketamin-Dosis von 45 mg/kg in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4), Anästhesie-Lösung vorzubereiten. Also für eine Maus 20 g mischen Sie 15 µL Medetomidine-Hydrochlorid mit 18 µL von Ketamin zu einem Endvolumen von 50 µL mit PBS-Puffer. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C bis zu einer Woche.</li>
	<li>Die Maus durch das Genick zu erfassen und geben Sie einen Tropfen Tropicamid 0,5 % + Phenylephrin-Hydrochlorid 2,5 % auf jedes Auge, Erweiterung der Pupille zu erreichen.</li>
	<li>Halten Sie die Maustaste, zurückhaltend und mit einer Insulin-Spritze an einer 30G-Nadel befestigt, 50 µL der Anästhesie-Lösung subkutan injiziert. Setzen Sie die Maus zurück in seinen Käfig, die über ein Heizkissen gesetzt wird. Warten Sie die Maus völlig sediert ist ca. 3-5 min. Zur Beurteilung der Narkose Tiefe Kneifen Sie Ende der Maus. Überprüfen Sie die Hornhaut Reflex durch die Maus Hornhaut mit einem Wattestäbchen sanft berühren. Wenn keine positive Reflex beobachtet wird, fahren Sie mit der Bildgebung. 
	Hinweis: Es ist wichtig, Atemfrequenz während der Narkose überwachen. Wenn die Maus nicht vollständig sediert ist, erhöht sich die Atemfrequenz auf einen schmerzhaften Reiz.</li>
	<li>Maus Hornhaut mit einer Anwendung von 2 % Hydroxypropylmethylcellulose auf jedes Auge fällt Hydrat.</li>
</ol> 3. SD-OCT <ol><li>legen einen wärmenden Patch von ca. 32 ° C auf die maßgeschneiderte Plattform befestigt auf dem Gerät Kinnhalter ( Abbildung 1).</li>
	<li>Bild des rechten Auges, platzieren Sie den Mauszeiger auf den linken Teil der Plattform ( Abbildung 1). Sicherzustellen, dass die richtige Umlaufbahn der Maus steht vor der Linse und der Körper anfällig auf der linken Seite der Plattform liegt.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen der Hydroxypropylmethylcellulose auf dem rechten Auge und + 4 Dioptrien starre Gas durchlässige Kontaktlinsen sorgfältig drauf zu positionieren (sphärische macht:-25.00, +25,00 Dioptrien). Speichern Sie die Kontaktlinse in ausgeglichene Salzlösung (BSS). Um das Objektiv zu ergreifen, Kunststoff oder Silikon Zange verwenden, um Beschädigungen zu vermeiden.</li>
	<li>Drücken Sie die gelbe Box in der rechten Ecke der Bedienfeldanzeige Erwerb Modul (Greenbox auf Abbildung 2A) zu starten. Das gelbe Feld Grün und das Control-Panel-Menü erscheint auf dem Bildschirm ( Abbildung 2A).</li>
	<li>Für die Übernahme von B-Scans, wählen Sie die Option IR + OCT auf dem Bedienfeld ( Abb. 2A). Ausgewählten Einstellungen werden auf das Control Panel blau hervorgehoben.</li>
	<li>Select &#34; Netzhaut &#34; unter &#34; Anwendung und Struktur &#34; in den Software und bewegen Sie das Objektiv auf das Maus-Auge über die Defekte am Gerät ( Abbildung 1). Überprüfen Sie vor der Fokussierung auf die Netzhaut, die Angabe &#34; OD &#34; auf den linken Unterteil des Bildschirms ausgewählt ist. Die Software erkennt automatisch die Links (OS) und das rechte Auge (OD) basierend auf der Position des Ziels. 
	Hinweis: Wenn das Ziel in der Mitte der Plattform positioniert ist, wird eine Fehlermeldung am unteren Rand des Bildschirms angezeigt. In diesem Fall neu positionieren Sie den Mauszeiger etwas bis die Software das richtige Auge erkennt.</li>
	<li>Mit den Fokussierknopf auf der Netzhaut zu konzentrieren, bis die großen Gefäße des Augenhintergrundes Bildes auf der linken Seite des Bildschirms deutlich zu erkennen sind. Bewegen Sie die Kamera durch Drehen der Mikromanipulator, nach links oder rechts, um die Kamera in diese Richtung zu bewegen oder im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn, um die Kamera zu bewegen, oben oder unten, bzw.. 
	Hinweis: Positionieren Sie die Maus auf die Plattform oder das Objektiv nach oben oder unten zu bewegen, die bevorzugte Lokalisation des Sehnervenkopfes im Infrarot-Bild zu erreichen.</li>
	<li>Den Drehknopf Empfindlichkeit zu senken gegen den Uhrzeigersinn oder im Uhrzeigersinn, um die Helligkeit des Augenhintergrundes Bildes zu erhöhen. Wenn optimale Scharfeinstellung erzielt wird, ein SD-OCT B-Scan erscheint auf der rechten Seite des Bildschirms. 
	Hinweis: Wenn der B-Scan kann nicht durch Einstellung des Fokus visualisiert werden, drücken Sie die Tastenkombination Strg + Alt + Shift + O auf der Tastatur. Im Pop-up-Fenster, passen Sie den Wert der Referenzarm bis B-Scan auf dem Bildschirm angezeigt wird.</li>
	<li>Auf der Unterseite rechts auf dem Bildschirm, wählen Sie die einzelnen Scan im Muster (einzelne Linie in Abbildung 2 b).</li>
	<li>Drehen die Mikromanipulator des Geräts ( Abbildung 1), links, rechts, vorwärts oder rückwärts (nach schalten die Kamera in diese Richtung) um sicherzustellen, dass der B-Scan befindet sich zwischen der oberen und unteren Ecken des SD-OCT scan Fenster.</li>
	<li>Legen Sie die automatische Echtzeit-(Kunst) Wert auf mindestens 9 Bilder in hoher Qualität zu erhalten. 
	Hinweis: Kunst verbessert die Bildqualität durch Mittelung mehrere aufeinander folgende Scans. Je höher die &#34; Kunst &#34; Wert ist, desto höher das Signal-Rausch-Verhältnis und damit die Bildqualität. Jedoch durch eine Erhöhung der &#34; Kunst &#34; Wert, der Erwerb von Zeit steigt auch.</li>
	<li>Drücken Sie die &#34; erwerben &#34; Taste ( Abbildung 2) auf dem Display des Bedienfelds und erwerben Sie die Bilder.</li>
	<li>Neu positionieren Sie den Mauszeiger um das Bild des linken Auges und wiederholen die Schritte 3.2-3.12.</li>
	<li>Sie die Kontaktlinse mit Kunststoff/Silikon Zange entfernen und legen Sie sie in BSS.</li>
	<li>Die Maus Hornhaut mit einem frischen Tropfen Hydroxypropylmethylcellulose Hydrat und entfernen Sie das überschüssige mit einem Papiertuch.</li>
	<li>Entfernen Sie die standard 30 °-Optik durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn.</li>
	<li>Setzen Sie das Objektiv 55 ° und wiederholen Sie die Schritte 3,4-3.12 für jedes Auge.</li>
</ol> 4. Auto-Fluoreszenz Imaging <ol><li>ohne bewegen der Maus auf der Plattform wählen Sie IR auf dem Bedienfeld.</li>
	<li>Mit den Fokussierknopf konzentrieren sich auf die großen Netzhautgefäße.</li>
	<li>Auf das Control Panel wählen Sie AF.</li>
	<li>Drehknopf die Empfindlichkeit gegen den Uhrzeigersinn zu reduzieren oder im Uhrzeigersinn, um die Helligkeit des Bildes erhöhen.</li>
	<li>Die Empfindlichkeit Knopf drücken, und legen Sie die &#34; Kunst &#34; Wert auf 67 oder mehrere erhalten qualitativ hochwertige Bilder.</li>
	<li>Wenn das Set &#34; Kunst &#34; Wert erreicht wurde, drücken Sie &#34; erwerben &#34; auf dem Bedienfeld, das Bild zu erwerben. Drücken Sie die Empfindlichkeit Knopf wieder zu stoppen, im Durchschnitt. Stellen Sie den Fokus, um die verschiedene Schichten der Netzhaut zu visualisieren.</li>
	<li>55° Linse zu entfernen und das weite Feld 102° Objektiv montieren. Führen Sie die Schritte 4.1 &#8211; 4.6 für beide Augen jede Maus und für jede Maus.</li>
	<li>Klicken Sie &#8220; Bilder speichern &#8221; am linken oberen Rand des Fensters und klicken Sie dann auf &#8220; verlassen &#8221;. Um die Bilder auf dem Computer zu speichern, wählen Sie die Maus aus der Liste auf der rechten Seite des Bildschirms durch einen Doppelklick auf das Maus-Namen. Doppelklick auf jedes Bild separat und klicken Sie dann auf das Disketten-Symbol. Speichern Sie das Bild als TIF, BMP, JPG oder PNG in den gewünschten Ordner. Zum Beenden der Software Press &#8220; Datei &#8221; und &#8220; beenden &#8221;.</li>
</ol> 5. Anästhesie-Umkehr <ol><li>Hydrat die Maus Augen mit einem Tropfen Hydroxypropylmethylcellulose und Rückkehr die Maus auf ein Heizkissen.</li>
	<li>Vorbereiten Atipamezol Lösung in einer Dosis von 2,25 mg/kg, die beruhigende Wirkung der Medetomidine Hydrochlorid rückgängig zu machen. Fügen Sie für eine 20 g Maus 9 µL Atipamezol in einem Endvolumen von 150 µL PBS hinzu. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C bis zu einer Woche.</li>
	<li>min nach Narkose Injektion (Schritt 2.2), injizieren 150 µL Atipamezol Lösung subkutan.</li>
	<li>Überwachen die Maus bis zur Genesung aus der Narkose. Wenn die Maus ist vollständig wiederhergestellten (5-10 min nach Atipamezol Injektion) steckte es wieder in seinen Käfig. Erholung wird durch die Fähigkeit des Tieres, seinen Körper als auf der einen Seite legte drehen Wiedererlangung der Aktivität Wandern, und in Reaktion auf die Umwelt Stimulation reagieren.</li>
</ol> 6. Manuelle Retinal Dickenmessung von SD-OCT-Bilder <ol><li>den OCT-Scan durch einen Doppelklick auf den Namen des Tieres zu öffnen.</li>
	<li>Öffnen den B-Scan mit 30° oder 55 ° Linse erhalten.</li>
	<li>Wählen Sie &#34; Dickenprofil &#34;.</li>
	<li>Drücken Sie die &#34; bearbeiten Schicht Segmentationen &#34; Symbol ( Abb. 2 b). Die Software automatisch identifiziert, die innere Begrenzung und Basis Membran.</li>
	<li>, Manuell korrigieren Sie ggf. die Position der inneren Begrenzung und Membran. Wählen Sie dazu den Layer von der linken Seite des Bildschirms und dann die roten Kreis-Option ( Abb. 2 b) geändert werden. Umzug des Kreises mit der Maustaste gedrückt, um die Zeile ändern,.</li>
	<li>Ändern Sie die Zeile die entsprechende Ebene richtig positionieren. Klicken Sie &#34; speichern und schließen Sie &#34; um das Fenster zu verlassen. 
	Hinweis: Aufgrund der Reflektivität der Aderhaut, kann die Software die Basis Membran falsch identifiziert. So ist es vorzuziehen, es manuell zu definieren, bevor Sie mit Messungen der Netzhautdicke.</li>
	<li>Wählen Sie &#34; Netzhaut &#34; unter die &#34; Schicht &#34; Option. Auf den unteren Rand des Bildschirms erscheint ein Diagramm der Netzhautdicke.</li>
	<li>Klicken Sie auf eine andere Position auf dem Diagramm oder auf der B-Scan der Netzhautdicke (in µm angegeben) anzeigen für die ausgewählte Position.</li>
	<li>Messung der Netzhautdicke in den gewünschten Abstand des Sehnervenkopfes und kopieren Sie die Werte in einer Kalkulationstabelle.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.9 für jede Maus für die 30 ° und 55° Objektiv.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analyse mit der gewünschten Software.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+microglia-mediated+neuroinflammation+to+retinal+degenerative+diseases.">Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases.</a> Mediators Inflamm. , 673090 (2015).</li><li>Ng, T. F., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+migration+of+retinal+microglia+into+the+subretinal+space.">Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).</li><li>Langmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+activation+in+retinal+degeneration.">Microglia activation in retinal degeneration.</a> J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).</li><li>Joly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+phagocytes:+resident+microglia+and+bone+marrow+immigrants+remove+dead+photoreceptors+in+retinal+lesions.">Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).</li><li>Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-mediated+IGF-I+neuroprotection+in+the+rd10+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa.">Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).</li><li>Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+populations+of+microglia/macrophages+in+the+retina+and+their+activation+after+retinal+ischemia+and+reperfusion+injury.">Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury.</a> Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+properties+of+the+mouse+eye.">Optical properties of the mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).</li><li>Lozano, D. C., Twa, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rat+schematic+eye+from+in+vivo+biometry+and+the+correction+of+lateral+magnification+in+SD-OCT+imaging.">Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).</li><li>Vaz-Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Coherence+Tomography+Features+Of+Active+And+Inactive+Retinal+Neovascularization+In+Proliferative+Diabetic+Retinopathy.">Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy.</a> Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).</li><li>Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+macrophage+dynamics+with+optical+coherence+tomography+in+anterior+ischemic+optic+neuropathy.">Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy.</a> Exp Eye Res. , (2016).</li><li>Makiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macular+cone+abnormalities+in+retinitis+pigmentosa+with+preserved+central+vision+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).</li><li>Paques, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fundus+imaging+by+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy+in+the+mouse.">High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse.</a> Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).</li><li>Joshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneously+occurring+fundus+findings+observed+using+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy+in+wild+type+Sprague+Dawley+rats.">Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).</li><li>Muraoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+rabbit+retina+with+retinal+degeneration+by+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography.">Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography.</a> PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).</li><li>Fischer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive,+in+vivo+assessment+of+mouse+retinal+structure+using+optical+coherence+tomography.">Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography.</a> PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).</li><li>Bell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vasculature+of+adult+zebrafish:+in+vivo+imaging+using+confocal+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy.</a> Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).</li><li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas.">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li><li>Huber, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+mouse+models+of+retinal+degeneration.">Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).</li><li>Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+Mouse+Retinal+Layers+Using+Automated+Segmentation+of+Spectral+Domain+Optical+Coherence+Tomography+Images.">Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images.</a> Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).</li><li>Sim, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+in+vivo+labelling+of+infiltrating+leukocytes+in+the+mouse+retina+using+indocyanine+green+dye.">A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye.</a> Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).</li><li>Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+retinal+microglial+activation+during+neurodegeneration:+confocal+ophthalmoscopic+imaging+and+cell+morphometry+in+mouse+glaucoma.">In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma.</a> J Vis Exp. (99), e52731 (2015).</li><li>Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+detection+in+retro-mode+imaging+by+a+scanning+laser+ophthalmoscope.">Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope.</a> Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).</li><li>Greenstein, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+changes+associated+with+normal+and+abnormal+fundus+autofluorescence+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa.</a> Retina. 32 (2), 349-357 (2012).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Microglia+for+the+Maintenance+of+Synaptic+Function+and+Integrity+in+the+Mature+Retina.">Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina.</a> J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).</li><li>Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+in+the+visual+pathway+in+experimental+glaucoma:+spatiotemporal+characterization+and+correlation+with+axonal+injury.">Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).</li><li>Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Activation+and+Recruitment+of+Circulating+Macrophages+During+Ischemic+Experimental+Branch+Retinal+Vein+Occlusion.">Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).</li><li>Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+theoretical+models+from+adult+stroke+recovery+to+improve+use+of+non-invasive+brain+stimulation+for+children+with+congenital+hemiparesis.">Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis.</a> J Neurophysiol. , (2017).</li><li>Combadiere, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1-dependent+subretinal+microglia+cell+accumulation+is+associated+with+cardinal+features+of+age-related+macular+degeneration.">CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration.</a> J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).</li><li>Bermudez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+cold+cataract+development+in+anesthetized+mice.">Time course of cold cataract development in anesthetized mice.</a> Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).</li><li>Toth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+retinal+morphology+viewed+by+optical+coherence+tomography+and+by+light+microscopy.">A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy.</a> Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).</li><li>Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+Effect+of+Oral+CSF-1R+Kinase+Inhibitor+on+Retinal+Microglia+Revealed+by+In+Vivo+Scanning+Laser+Ophthalmoscopy.">Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy.</a> Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).</li><li>Gabriele, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+spectral-domain+optical+coherence+tomography+total+retinal+thickness+measurements+in+mice.">Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).</li><li>Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+laser+ophthalmoscopy+for+mice:+a+novel+evaluation+system+for+retinal/choroidal+angiogenesis+in+mice.">Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).</li><li>Wang, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+fundus+hyperautofluorescent+spots+and+their+role+in+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+Goldmann-Favre+syndrome.">Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).</li><li>Wang, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+of+fundus+autofluorescence+in+patients+and+mice+with+a+defective+NR2E3+gene.">Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene.</a> Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sick+photoreceptors+attract+activated+microglia+from+the+ganglion+cell+layer:+a+model+to+study+the+inflammatory+cascades+in+rats+with+inherited+retinal+dystrophy.">Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy.</a> Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).</li><li>Hughes, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+activated+sialoadhesin-positive+microglia+during+retinal+degeneration.">Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der vorliegende Artikel zeigt ein Protokoll für den Erwerb von retinalen B-Scans und Bildgebung der Gfp positive Mikroglia Verteilung in der Maus Netzhaut in der gleichen Sitzung imaging. SD-OCT und SLO werden zunehmend in Tiermodellen der Netzhauterkrankung zur retinalen Veränderungen über Zeit10,14,17,18,21informieren. Mit diesem Protokoll, Cx3cr1<sup...

In experimentelle Ophthalmologie Untersuchung der Netzhaut Pathologie mit histologischen Techniken in der Regel ausgewertet. Jedoch Histologie erfordert tierischen Euthanization und Änderung der tatsächlichen Eigenschaften des Gewebes verursachen. SD-OCT und SLO werden routinemäßig in der klinischen Ophthalmologie zu diagnostischen Zwecken und für die Überwachung von mehreren Netzhauterkrankungen wie diabetischen Makulaödems9, anteriore ischämische optische Neuropathie10oder Retinitis Pigmentosa11 verwendet . SD-OCT und SLO sind nicht-invasive Techniken, die hochauflösende Bilder von der Netzhaut zu erzeugen, die durch den erweiterten Pupille ohne weiteres Zutun visualisiert werden. SD-OCT informiert der Netzhaut Struktur und Netzhautdicke Datensammlung Photons um Schnittbilder der Netzhaut zu erstellen, während SLO Fluoreszenz Daten sammelt um stereoskopische kontrastreiche Bilder der Netzhaut zu erzeugen. Heute, beide Techniken werden zunehmend in experimentelle Ophthalmologie mit kleinen Nagetieren12,13,14,15 (oder sogar Zebrafisch16,17) verwendet und können bieten Sie sowohl qualitative und quantitative Informationen12,17,18,19,20,21.
Ansammlung von endogenen Fluorophore wie Lipofuscins oder die Bildung von Drusen in der Netzhaut kann durch SLO als Auto Fluoreszenzsignal visualisiert werden. Diese Eigenschaft macht SLO eine wertvolle Technik zur Diagnose und Überwachung von Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makula-Degeneration oder Retinitis Pigmentosa22,23. In experimentelle Ophthalmologie kann Auto-Fluoreszenz-imaging (AF) zur Erkennung von bestimmten Zelltypen Reporter Mauslinien verwendet werden. Zum Beispiel sind Mäuse heterozygot für die Ausprägung der Gfp unter den Promotor des Cx3cr124 vorteilhaft für in Vivo Visualisierung der Mikroglia-Zellen in die normale Netzhaut und zur Untersuchung der Mikroglia/Makrophagen Dynamik in Netzhauterkrankung21. Mikroglia sind die ansässigen Makrophagen der Netzhaut, die eine entscheidende Rolle spielen auf Gewebe Homöostase und Gewebereparatur bei Verletzung1,25,26. Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut berichtet in der Netzhaut Verletzung, Ischämie und Degeneration, was eine Rolle dieser Zellen im Netzhauterkrankung2,3,4,5, 6.
Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache Methode zur retinale Bildgebung und Messung der Netzhautdicke mit SD-OCT und zur Visualisierung der Gfp positive Mikroglia Zellen in den Cx3cr1GLP/Gfp Netzhaut Maus beschreiben SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT-System). Dieses Protokoll kann für Bildgebung und Dicke Messungen des gesunden oder Kranken retinae in verschiedenen Mauslinien genutzt werden. Darüber hinaus können morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung der Mikroglia Zahlen und Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut mit SLO21durchgeführt werden. Mikroglia-Zellen sind mit degenerativen Erkrankungen in das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich der Netzhaut27,28,29verbunden. So durch die Kombination der beiden Methoden verwendet in diesem Protokoll, Korrelation der Mikroglia Verbreitung und Degeneration der Netzhaut kann vorgenommen werden, die Überwachung Krankheitschwierigkeit erleichtern kann, oder die Wirksamkeit der therapeutischen Ansätze in Vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectralis Imaging system (HRA+OCT)</td>
			<td>Heidelberg Engineering, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ophthalmic imaging platform system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg Eye Explorer</td>
			<td>Heidelberg Engineering, Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 1.9.13.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens</td>
			<td>Volk Optical Inc., Ohio, USA</td>
			<td>V78C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectralis wide angle 55&#176; lens</td>
			<td>Heidelberg Engineering, Germany</td>
			<td>50897-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra widefield 102&#176; lens</td>
			<td>Heidelberg Engineering, Germany</td>
			<td>50117-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)</td>
			<td>Provet AG, Lyssach, Switzerland</td>
			<td>Swissmedic Nr. 50&#39;590 - ATCvet: QN05CM91</td>
			<td>anesthetic/analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine 50mg/ml (Ketalar)</td>
			<td>Parke-Davis, Zurich, Switzerland</td>
			<td>72276388</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)</td>
			<td>ISPI, Bern, Switzerland</td>
			<td>N/A</td>
			<td>pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm</td>
			<td>B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Stra&#223;e, Germany</td>
			<td>9151125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)</td>
			<td>OmniVision, Neuhausen, Switzerland</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+4 dpt rigid gas permeable contact lens</td>
			<td>Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Base Curve: 7.20 to 8.40 mm 
			Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm 
			Power: -25.00 to +25.00 Diopters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>balanced salt solution (BSS)</td>
			<td>Inselspital, Bern, Switzerland</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)</td>
			<td>Provet AG, Lyssach, Switzerland</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#945;2 adrenergic receptor antagonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of cx3cr1gfp/gfp reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy

Spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT) und scanning Laser Ophthalmoskopie (SLO) werden ausführlich in experimentelle Ophthalmologie eingesetzt. In diesem Protokoll, Mäuse, die mit dem Ausdruck grün fluoreszierenden Proteins (Gfp) unter den Promotor des Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1GLP/GLP) wurden verwendet, um Bild-Mikroglia Zellen in Vivo in der Netzhaut. Mikroglia sind resident Makrophagen der Netzhaut und haben verschiedene Netzhauterkrankungen1,2,3,4,5,6in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Ansatz zur Erzeugung von retinalen B-Scans, mit SD-OCT und Bildgebung der Mikroglia Zelle Verteilung in Cx3cr1GLP/Gfp Mäuse mit SLO in Vivomit einer ophthalmologischen Bildgebungssystem Plattform. Das Protokoll kann in mehrere Reporter Mauslinien verwendet werden. Es gibt jedoch einige Einschränkungen des Protokolls, die hier vorgestellt. Erstens, SLO und SD-OCT, im hochauflösenden Modus, sammeln von Daten mit hohe axiale Auflösung aber die laterale Auflösung ist geringer (3,5 µm und 6 µm, beziehungsweise). Darüber hinaus ist die Fokus und Sättigung Ebene in SLO hängt stark von Parameter-Auswahl und korrekte Ausrichtung des Auges. Zusätzlich, im Vergleich mit Geräten, die für menschliche Patienten bei Mäusen ist schwierig wegen der höheren optischen Gesamtleistung des Auges Maus entworfen für das menschliche Auge; kann dies um zu lateralen Vergrößerung Ungenauigkeiten7, die auch die Vergrößerung durch die Maus Linse u.a. abhängig sind. Jedoch trotz, die position der axiale Scan ist abhängig von lateralen Vergrößerung, die axialen SD-OCT Messungen sind genaue8.

Mit den hier vorgestellten Protokoll, SD-OCT scannt und SLO Bilder stammen aus Cx3cr1GLP/Gfp Mäuse in der gleichen Sitzung imaging. Abbildung 3 umfasst Vertreter SD-OCT Einzelscans erhalten mit einem 30° oder ein 55 ° Objektiv (Abbildung 3A) und repräsentative SLO Bilder mit einem 55 ° oder ein 102 ° Objektiv erhalten, wo Gfp-positiven Mikroglia-Zellen sichtbar gemacht. Höhere Reflektivität der Aderha...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy at JoVE.com

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

in-vivo-imaging-cx3cr1gfpgfp-reporter-mice-with-spectral-domain

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

10.5K Aufrufe.  Bern University Hospital and University of Bern. Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.

Serie: In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

Oral Biofilm Analyse Palatal Expander durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung und konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Forschung

Medizin

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double circular scan (CDCS) that scans around the optic nerve head at 3.40 mm and 3.75 mm diameters. The double concentric circles are performed 6 times consecutively over 2 sec. The CDCS scan is saved with Doppler shift information from which flow can be calculated. The standard clinical protocol calls for 3 CDCS scans made with the OCT beam passing through the superonasal edge of the pupil and 3 CDCS scan through the inferonal pupil. This double-angle protocol ensures that acceptable Doppler angle is obtained on each retinal branch vessel in at least 1 scan. The CDCS scan data, a 3-dimensional volumetric OCT scan of the optic disc scan, and a color photograph of the optic disc are used together to obtain retinal blood flow measurement on an eye. We have developed a blood flow measurement software called "Doppler optical coherence tomography of retinal circulation" (DOCTORC). This semi-automated software is used to measure total retinal blood flow, vessel cross section area, and average blood velocity. The flow of each vessel is calculated from the Doppler shift in the vessel cross-sectional area and the Doppler angle between the vessel and the OCT beam. Total retinal blood flow measurement is summed from the veins around the optic disc. The results obtained at our Doppler OCT reading center showed good reproducibility between graders and methods (&lt;10%). Total retinal blood flow could be useful in the management of glaucoma, other retinal diseases, and retinal diseases. In glaucoma patients, OCT retinal blood flow measurement was highly correlated with visual field loss (R2&gt;0.57 with visual field pattern deviation). Doppler OCT is a new method to perform rapid, noncontact, and repeatable measurement of total retinal blood flow using widely available Fourier-domain OCT instrumentation. This new technology may improve the practicality of making these measurements in clinical studies and routine clinical practice.

Total retinal blood flow is measured by Doppler optical coherence tomography and semi-automated grading software.

Doppler Optical Coherence Tomography der retinalen Zirkulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double ...

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentierung und Messung von FAT-Volumes in Murine Obesity Modellen mithilfe von Röntgen-Computertomographie

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

In Vivo, perkutane, Nadel Based, Optical Coherence Tomography von Nierentumoren

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...